马兜铃提取条件的优化以及炮制减毒的研究

马兜铃提取条件的优化以及炮制减毒的研究
刘美凤;刘璟;吕浩然;周惠
【摘要】采用单因素试验考察药材粒径、加水量、煎煮时间和煎煮次数4个因素对马兜铃中马兜铃酸A提取效果的影响.运用HPLC测定炒制马兜铃与蜜炙马兜铃中马兜铃酸A的含量.结果表明马兜铃的最佳提取条件为粒径1 cm<'2>,加水22倍量,煎煮2次,每次1.0h.马兜铃炒制和蜜炙均可降低毒性成分马兜铃酸A的含量,蜜炙使马兜铃酸A的含量降低了51.77%,减毒效果明显优于炒制.
【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2011(039)009
【总页数】3页(P83-85)
【关键词】马兜铃;马兜铃酸A;炒制马兜铃;蜜炙马兜铃
【作者】刘美凤;刘璟;吕浩然;周惠
【作者单位】华南理工大学化学与化工学院制药工程系,广东,广州,510640;广东省绿色化学产品技术重点实验室,广东,广州,510640;华南理工大学化学与化工学院制药工程系,广东,广州,510640;华南理工大学化学与化工学院制药工程系,广东,广州,510640;华南理工大学化学与化工学院制药工程系,广东,广州,510640
【正文语种】中文
马兜铃为马兜铃科植物北马兜铃Aristolochia contorta Bge.或马兜铃Aristolochia debilis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果实，性苦，微寒，归肺、大肠经［1］。

主要的化学成分为马兜铃酸、马兜铃内酰胺、季胺生物碱和萜类等成分
［2－3］，马兜铃酸类物质(包括马兜铃酸和马兜铃内酰胺)是结构中菲核连接硝基或内酰胺的一类化合物，可导致严重的肾毒性［4－6］，因此含有马兜铃酸类物质的药用植物和制剂先后被多国禁用。

马兜铃以止咳平喘、清肠消痔之功见长，广泛用于中医师临床和药典及部颁中成药制剂处方中，多用蜜炙品。

蜜炙马兜铃增强润肺止咳之功，同时降低毒性，几乎不发生生品所致恶心、呕吐的副作用。

本实验在优化马兜铃酸检测条件的前提下［7－8］，以马兜铃酸A的含量为指标，采用高效液相色谱法(HPLC)对马兜铃酸A进行定量检测，以单因素试验法对马兜铃酸A的提取条件进行优选。

同时通过对比炒制和蜜炙两种传统炮制方法对马兜铃中马兜铃酸A含量的影响，探讨马兜铃的炮制减毒的化学机理。

1.1 实验仪器司;色谱柱(Hypersil ODS2，C18，4.6 mm×200 mm，5μm，柱号E1915624)，大连依利特科学仪器有限公司;电子天平(BS124S)，北京赛多利斯仪器系统有限公司;高速万能粉碎机(FW－100型)，北京市永光明医疗仪器厂;超声波清洗仪(KQ5200DE)，昆山市超声仪器有限公司;恒温水浴锅(HH－4)，常州澳华仪器有限公司。

1.2 试剂与药品
甲醇(色谱纯)，美国Fisher公司;水为自制超纯水;甲醇、冰醋酸(分析纯)，江苏强盛化工有限公司;马兜铃购自广州市万怡大药房，经广东药学院生药学教授曾令杰博士鉴定，符合《中国药典》2010年版一部的相应标准;马兜铃酸 A对照品(批号110746－200406)，中国药品生物制品检定所，供含量测定用。

1.3 色谱条件
色谱柱依利特 Hypersil ODS2，C18，(4.6 mm×200 mm，5μm，柱号
E1915624);以甲醇－水－冰醋酸(59∶40∶1)为流动相;检测波长为250 nm;进样量:20μL;柱温30℃。

理论塔板数按马兜铃酸A计算应不低于2 000。

高效液相色谱仪(Agilent 1100 Series)，美国安捷伦科技公
1.4 对照品储备液的配置
准确称取干燥至恒重的马兜铃酸A对照品2.5 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇
溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为50μg·mL－1的马兜铃酸A对照品储备液，
密封后置于冰箱中4℃保存，备用。

1.5 供试品溶液的制备
取马兜铃样品5 g左右，精密称定，按照实验设计加入一定倍量的蒸馏水，浸泡0.5 h，然后按设定时间、次数进行加热回流提取，双层纱布滤过，测量滤液体积。

取10 mL滤液于水浴锅上蒸干，用甲醇定容至25 m L容量瓶中，过0.45μm微
孔滤膜，按“2.1”项下色谱条件进行检测，以外标法计算马兜铃酸 A的含量。

1.6 炒制马兜铃的制备
取马兜铃药材(粒径为1 cm2左右)10 g，置锅内，用文火加热炒至表面色变棕黄色，偶有焦斑，取出放凉，即得炒马兜铃药材。

1.7 蜜炙马兜铃的制备
取炼蜜约2.5 g，开水稀释后，加入到10 g的马兜铃(粒径为1 cm2左右)内拌匀，稍闷，置锅内，用文火加热，炒至不粘手，取出放凉即得蜜炙马兜铃药材。

由表1可知，马兜铃酸A煎出量随着时间的变化呈先增加后减小趋势，在1.0 h
达到最大值。

究其原因是因为时间越长，越多的马兜铃酸A溶出，但马兜铃酸类
成分由于热不稳定性会随着温度的升高或加热时间的延长而降解，也有研究表明马兜铃酸A在煎煮过程中发生聚合［9］，多种效果累加，就呈现先增加后减少的结果。

2.3.2 煎煮次数对马兜铃酸A含量影响
取马兜铃(粒径为1 cm2左右)5 g，精密称定，置于250 mL的烧瓶中，加蒸馏水22倍量(110 mL)，按“1.5”项下的操作方法，分别煎煮1次，2次，3次，每次1.0 h。

合并各组煎煮液，计算马兜铃酸A的含量(n=2)。

结果见表2。

2.1 线性关系考察
取马兜铃酸A对照品储备液适量，加甲醇稀释制得每1 mL含0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，30.0和50.0μg的梯度溶液。

分别精密吸取20μL，注入HPLC色谱仪，平行进样各两次，以两次峰面积平均值为纵坐标，以马兜铃酸A浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=95.557X－14.45，r=0.9996。

结果表明，
马兜铃酸A在0.5～50μg·mL－1的浓度范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.2 精密度与稳定性试验
取马兜铃(粒径为1 cm2左右)5 g，精密称定，加蒸馏水22倍量(110 mL)，按“1.5”项下的操作方法提取2次，每次1.0 h，制取供试品溶液。

然后按“1.3”
项下的色谱条件测定，分别在0，2，4，6，8，22 h，第二天，第三天分别进样，进样量相同，测定马兜铃酸A峰面积。

结果供试品溶液自制备后三天内稳定，RSD 1.54%。

2.3 马兜铃提取条件的优化
2.3.1 煎煮时间对马兜铃酸A含量的影响
取马兜铃(粒径为1 cm2左右)5 g，精密称定，置于250 mL的烧瓶中，加蒸馏水22倍量(110 mL)，按“1.5”项下的操作方法，煎煮1次。

分别在0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h处取样，计算马兜铃酸A的含量(n=2)。

结果见表1。

由表2可知，随着煎煮次数的增多，马兜铃酸A的含量呈递增趋势。

但是煎煮3
次与煎煮2次相比，马兜铃酸A含量增长幅度较小，煎煮两次马兜铃酸A的含量
数值接近全部煎出量。

因此，为了简便操作，马兜铃的煎煮次数选取2次。

2.3.3 加水量对马兜铃酸A含量影响
取马兜铃(粒径为1 cm2左右)5 g，精密称定，置于250 mL的烧瓶中，分别加蒸馏水14倍(70 mL)，18倍(90 mL)，22倍(110 mL)，26倍(130 mL)。

按“1.5”
项下的操作方法，煎煮1次，每次1.0 h。

计算滤液中马兜铃酸A的含量(n=2)。

结果见表3。

由表3可知，马兜铃酸A的提取量随着加水量的增加而增大，达到最大之后趋于饱和，继续增加加水量，反而抑制马兜铃酸A的溶出。

其中，加水量为22倍量(110 mL)时，马兜铃酸A的煎出量为最大，故22倍加水量为马兜铃的最佳用水量。

2.3.4 粒径对马兜铃酸A含量的影响
分别取未处理马兜铃、粒径为1 cm2左右马兜铃、过40目筛的马兜铃粉末5 g，精密称定，置于250 mL的烧瓶中，加蒸馏水22倍量(110 mL)，按“1.5”项下的操作方法，煎煮1次，每次1.0 h。

计算滤液中马兜铃酸A的含量(n=2)。

结果见表4。

由表4可知，三种不同粒径煎煮时，马兜铃酸A的煎出量由大到小分别为:1 cm2＞过40目筛＞未处理。

根据扩散理论，药材粉碎得愈细，与浸取溶剂的接触面积愈大，扩散面也愈大，故扩散速率愈快，浸出效果愈好。

显然，马兜铃剪成面积约1 cm2方形必然比未处理时马兜铃酸A的煎出量大。

但是，与上述理论相反的现象是过40目筛的马兜铃的提取量要小于粒径为1 cm2马兜铃。

造成这种现象的原因可能为以下两点:(1)过细的粉末在浸出时虽能增大接触面积，但吸附作用亦增加，因而使扩散速率受到影响;(2)药材粉碎过细，药材中大量细胞破裂，使药材中蛋白质、黏液质等溶出，黏度增加，马兜铃酸A的溶出减少。

因此，在实验中选择粒径为1 cm2马兜铃。

2.4 炮制减毒研究
精密称取按“1.6、1.7”项下制备好的炒制马兜铃、蜜炙马兜铃各2.50 g，置于150 mL烧瓶中，加水22倍量(55 mL)，浸泡0.5 h，然后加热回流提取1.0 h，提取2次。

双层纱布滤过，取10 mL上清液于水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解，
稀释并定容至25 mL量瓶，过0.45μm微孔滤膜，备用。

按“1.3”项下色谱条件进行检测，以外标法计算马兜铃酸A的提取含量(n=2)。

结果见表5。

由表5分析，上述三种马兜铃中马兜铃酸A由大到小分别为:马兜铃＞炒马兜铃＞
蜜马兜铃，由此可知炒制与蜜炙均有不同程度的减毒作用，其中，蜜炙马兜铃减毒效果最为明显，马兜铃酸A较生品下降了51.77%，这与《中药炮制学》［10］
中所述的“较生品下降了51%～55%”相符合;而炒马兜铃较生品下降了19.85%。

(1)在本实验中，马兜铃酸A的最佳提取条件为:取粒径为1 cm2马兜铃，加水量
为马兜铃质量的22倍，浸泡0.5 h，煎煮时间为1.0 h，提取2次。

(2)在马兜铃的炮制减毒中，炒制马兜铃与蜜炙马兜铃均能降低毒性成分马兜铃酸
A的含量，主要是因为这两者都经过高温处理，使马兜铃酸A发生降解，含量降低。

但是蜜炙马兜铃马兜铃酸A含量低于炒马兜铃，究其原因可能是因为蜂蜜的
黏性比较大，蜜炙之后使马兜铃酸A溶出的扩散系数减少，溶出量降低。

此外，
传统中医认为“蜜炙甘缓而润肺”，马兜铃经蜜炙之后，不仅能够掩盖马兜铃的不良气味，降低毒性成分含量，并且可以增强润肺止咳止功效，因此临床多用蜜炙品。

本研究为马兜铃的传统炮制方法和应用提供科学依据。

(3)从本实验可以看出，通过改变工艺条件和合理的加工炮制，可以大幅降低毒性
成分马兜铃酸的含量，从而有效降低马兜铃的毒性。

【相关文献】
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［4］ Tanaka A，Nishida R，Yokoi H，et al.The characteristic pattern of aminoaciduria in patients with aristolochic acid－induced Fanconi syndrome:Could iminoaciduria be the
hallmark of this syndrome［J］.Clinical Nephrology，2000，54(3):198－202.
［5］庞晓军.马兜铃酸的毒理学现状［J］.中国医院用药评价与分析，2006，6(1):47－49. ［6］蒋贵仲，陈灵.中药中马兜铃酸的毒性研究进展［J］.中国农学通报，2008，24(9):84－87. ［7］ Lee T Yei，Wu M L，Deng J F，et al.High－Performance Liquid Chromatographic determination for aristolochic acid in some medicinal plants and slimming products ［J］.JChromatography B，2002，766: 169－174.
［8］姚东云，王蕾，马红梅，等.马兜铃酸类物质现代分析检测技术研究［J］.现代中药研究与实践，2007，22(3):40－43.
［9］王勇，夏博，邓晓春.马兜铃酸I在煎煮过程中的缩合反应研究［J］.中草药2010，
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