布鲁氏菌病的诊断技术进展

摘要：随着分子生物学、纳米、化学发光免疫诊断等新技术的迅速发展，布鲁氏菌病的实验室检测技术也有了更多种选择，他们具有灵敏、特异、快速、直接定量、可自动化等多种优势，正逐步被广泛使用，有些已经占据了布病实验室诊断的重要位置，但传统的诊断技术也不可就此丢弃，它是现代检测技术的前提和基础，依然在生产实践的一线起着不可替代的重要作用。

关键词：布鲁氏菌病；检测；技术进展
布鲁氏菌病的诊断技术进展
刘海成1，刘西源2，朱玲钰1
（1.内蒙古巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心内蒙古巴彦淖尔015000；2.内蒙古巴彦淖尔市临河区医保局内蒙古巴彦淖尔015000）
doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2024.03.004
收稿日期：2023-06-19
作者简介：刘海成（1973.10—），男，山东济南人，本科，高级兽医师，研究方向：动物疫病的实验室诊断。

1布鲁氏菌病传统的诊断技术
家畜布鲁氏菌病传统的诊断技术包括流行病学、临床症状、病
理变化、病原的分离鉴定以及实验室里的虎红平板凝集试验、试管凝集试验、全乳环状试验、琼脂扩散实验、补体结合试验、ELISA 等血清学检测技术以及适合现场操作的变态反应等。

1.1流行病学特点
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人和多种动物共患的变态反
应性传染病，几乎所有陆生动物和海洋里的哺乳动物都易感，陆生家畜中羊、牛、猪最易感，接触性传播，无明显的季节性。

布鲁氏菌细胞内寄生，典型症状过后，细菌寄生胞内，药物很难对它起到作用，至今尚无根治办法，主要侵害生殖系统，母畜比公畜易感，成年畜比幼年畜易感。

1.2临床症状多数动物隐性感染、排毒却无明显症状；典型症状主要表现为
发热、流产、关节炎、乳房炎、睾丸炎等相关症状。

1.3病理变化
子宫、胎盘炎性浸润、化脓性坏死、睾丸炎、关节内膜炎，多器
官特征性肉芽肿、胎儿败血症等病变。

1.4病原分离鉴定
1）取典型病变组织。

取典型病变组织抹片，柯氏染色后镜检，
发现红色球杆状小杆菌，其他菌为蓝色时可做出初步判断。

2）实验室准备。

实验室人员在做好个人防护的前提下，取典型
未污染病料，在马丁琼脂（含10%马血清）、肝浸液琼脂等培养基上分离培养，通过其特异性单向血清A 、M 凝集试验、生化试验、分离物的特点、菌体粗糙程度等综合判断。

1.5血清学试验
1）虎红凝集试验（RBT ）。

虎红平板凝集是目前在生产一线运用
最广的一种试验，具有操作简便、材料简单、成本低、反应快、可定性也可定量等优点。

其原理是将布氏杆菌抗原灭活后，用虎红染色，当遇到被检血清中特异性抗体后发生凝集，形成肉眼可见的凝集颗粒。

适合大面积初筛。

但虎红抗原主要与IgM 发生凝集，对疾病后期产生的IgG 检出率低，另外，受到观察者主观判断的差异、抗原质量差异、环境温度等因素影响，容易出现漏检和假阳性结果[1]。

2）试管凝集试验（SAT ）。

其原理与虎红凝集试验相似，常用于
虎红凝集试验的复检，操作相对复杂，结果判断受实验环境光线等多种因素影响，同样有一定的主观性和差异性，对IgM 的敏感性高于IgG ，适合于布病的早期诊断。

3）全乳环状试验（MRT ）。

用于检测乳汁中布病抗体，阳性乳汁会在抗原和乳汁的界面上形成白色沉淀环。

操作简单、灵敏度高，但对乳汁检样要求苛刻，也有非特异性结果，适用于布病的初筛。

4）补体结合试验（CFT ）。

补体结合试验是布病检测的“金标
准”，目前收录在国标中。

主要用于检测布病感染后机体中后期产生的IgG ，由于补体抗体产生的晚，在体内保持时间长，对于慢性病例诊断意义较大。

但此方法试验条件比较苛刻，所用试剂种类多、操作复杂、对试验操作者的要求较高、结果判断也有主观性。

此方法也不适于猪的诊断。

5）琼扩试验。

此方法主要针对绵羊种布鲁氏菌的检测，用全乳
环状抗原检测乳汁中的布病抗体，阳性乳与标准抗原两孔间会形成肉眼可见的沉淀线。

此方法操作简单，适合大批量检测，但需24耀72h 判结果。

6）酶联免疫吸附试验（ELISA ）。

这种方法是将抗原或抗体吸附
于聚苯乙烯反应板表面，再与被检样本中的抗体或抗原相结合，形成抗原抗体复合物，再加入酶标记的抗体（或抗原），加入底物后，底物被酶催化后形成有色产物，颜色的深浅与被检物中抗原（或抗体）含量正相关，通过酶标仪检测吸光度的值来计算被检物的含量。

这种方法具有敏感度高、操作简单、易于自动化操作，适合大批
量检测，主要检测IgG ，效果与补体结合试验相当，但也存在假阳性或假阴性的现象。

布病的检测常用I-ELISA 和C-ELISA ，此方法已纳入布病检测的国家标准[2]。

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疾病防治
7）变态反应。

用布鲁氏菌水解素注射于被检动物尾根皱褶处的皮内，在24和48h各观察一次有无红肿现象来判断阴阳性的一种诊断方法，这种方法操作简单，但等待结果时间较长，需要多次保定被检动物，对于慢性病例检出率较高。

传统的血清学方法有一个共同的缺点就是无法区别疫苗和野毒。

2布鲁氏菌病检测的新技术
随着分子生物学、纳米和基因缺失技术的快速发展，近年来，对于布病的检测又有了一些新的方法，比如PCR技术、荧光偏振技术、化学发光技术等。

2.1聚合酶链式反应（PCR）
PCR并不属于新技术，但它在不断发展和改进，日益亲民化，目前在疫病检测中逐步占据了主要位置，在实验室诊断中被广泛应用。

他的基本原理是将检材中特定的微量的DNA片段迅速呈几何倍的扩增，利用特定的仪器设备进行检测的技术。

PCR技术目前发展到了第三代。

第一代是将核酸扩增后，采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析，只能用于定性分析。

目前，国标布病的PCR检测中只收录了此种方法。

第二代是采用特定的仪器采集扩增产物荧光强度的荧光定量PCR技术，目前广泛使用。

第三代是以微滴化处理步骤为主要特征的数字PCR，是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法。

它直接计数目标分子，可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。

1）AMOS-PCR属于第一代PCR，对于家畜布病的检测，AMOS-PCR可以对所检布氏杆菌进行分型，它是根据IS711在各菌株中的插入位置不同和拷贝不同而进行鉴别分型的，可以鉴别牛种生物型1、2、4，羊种生物型1、2、3，猪种生物型1和绵羊附睾种。

可以区分疫苗株和野毒株。

2）多重引物PCR或复合PCR是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段，可以鉴别除绵羊附睾种外的牛种、羊种、猪种、沙林鼠种、犬种布鲁氏菌。

3）荧光定量PCR既可鉴别布鲁氏菌属，也可进行种型鉴定，适合布病的早期快速诊断。

PCR技术具有敏感性高、特异性强、操作简便快速、对起始材料质量要求低等特点。

但PCR技术也不能完全克服假阴性和假阳性的现象，造成的原因比较复杂，比如：实验室环境的问题，如：污染、气溶胶等；样品本身存在问题，如：样品质量差、保存不当等；此外，实验操作的不规范、试剂的质量问题、数据分析中的误差、扩增仪温度不准确、反应液处理不好导致PCR抑制物进入反应体系等都可能导致实验结果失真[3]。

2.2荧光偏振试验（FPA）
荧光偏振试验是一种抗原/抗体相互作用的简单技术，该试验基于物理原理：在溶液中，在布鲁氏菌属的抗体的存在下，和抗原形成了大的荧光复合物。

在阴性样品中，抗原是未结合的状态，与布鲁氏菌属阳性样本相比，这些较小的抗原分子旋转得更快，因此引起光的更大去极化。

这种方法操作快速（几分钟出结果）、简便，在实验室和野外都可操作，相比凝集试验SAT，其结果更客观，特异性和敏感性与ELISA相似，但需要专业的荧光偏振仪器，成本较高，适合大规模布鲁氏菌病的筛查和检测，未来值得推广。

2.3bp26-iELISA
这是一种将基因缺失技术与传统间接酶联免疫吸附试验相结合的方法。

bp26蛋白具有良好的抗原性，其基因在布鲁氏菌7个种21个生物型中几乎完全一样，是比较保守的序列，将纯化的bp26蛋白包被ELISA板，建立检测布鲁氏菌病的间接ELISA方法，它比SAT方法更敏感。

这种方法为以后M5-90疫苗株bp26基因缺失苗的应用提供配套性血清学检测奠定基础，可区分基因缺失苗和野毒感染。

2.4化学发光分析技术
化学发光免疫分析技术是将免疫反应和化学发光分析相结合，化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当他回到稳定的基态时，同时发射出光子（hM），免疫反应系统是将发光物质直接标记在抗原或抗体上，或酶作用于发光底物，利用发光信号测量仪测量光子强度。

尽管目前还没有看到针对布鲁氏菌病的化学发光免疫分析技术的报道，但此项技术已经运用于多种疾病的检测，随着科研工作者的不懈努力，这项技术很快就会运用到布鲁氏菌病的检测上来，尤其是微粒体发光免疫分析技术更具有推广应用前景，它将纳米级的磁微粒作为反应载体，可实现多项目同步检测、全自动运行、结果定量、灵敏度高等特点，是一种划时代的兽医免疫学诊断技术。

3结语
诊断一种疾病不仅要考虑实验室结果，还要综合考虑临床症状、流行病学、病理变化等综合因素。

近年来随着科学技术的飞速发展，布病的检测技术更新得也很快。

但不论是哪一种技术都有其优缺点，它的应用要综合考虑实际条件的限制。

从技术角度来看，血清学诊断方法比较经济和相对简单，更适合进行大规模的筛查和诊断，特别是在流行地区。

姻
参考文献：
[1]杨海荣,关平原,范伟兴.AMOSPCR在布鲁氏菌种型鉴定中应用的研究[J].
中国动物检疫,2007,24(10):25-28.
[2]田克恭,李明.动物疫病诊断技术-理论与应用[M].中国农业出版社,209-218.
[3]加洛子哈.动物布鲁氏菌病的诊断技术及防治措施[J].山东畜牧兽医,2017,38
(3):29+33.
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中国动物保健2024.03。