罗氏海盘车皂苷类成分提取纯化工艺优化研究

罗氏海盘车皂苷类成分提取纯化工艺优化研究
解舒博;包永睿;孟宪生;王帅;李天娇
【摘要】目的优化罗氏海盘车中抗炎成分总皂苷的提取纯化工艺,为罗氏海盘车抗炎药效物质基础及作用机制研究奠定基础.方法采用正交试验设计法,以总皂苷含量和出膏率的综合评分为考察指标,优化罗氏海盘车总皂苷提取工艺参数;采用大孔吸附树脂法,以总皂苷含量为考察指标,通过静、动态吸附与解吸实验优化罗氏海盘车总皂苷纯化工艺参数;采用噻唑蓝(MTT)法比较纯化前后提取物对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞的抑制作用.结果罗氏海盘车最佳提取条件为10倍量80%乙醇,回流提取3次,每次1 h;最佳纯化条件为采用NKA-9型号树脂,以浓度为0.4 g生药/mL的药液,按0.5 g·mL-1(生药量/树脂体积)比例上样,3 BV水除杂后,4 BV 90%乙醇洗脱,石油醚脱脂,水饱和正丁醇萃取,纯化后样品纯度为75.44%,收率为1.43%;二次纯化物抗炎IC50值比粗提物IC50值降低63%.结论按此优化工艺,可获得纯度较高的罗氏海盘车皂苷类成分.
【期刊名称】《药学研究》
【年(卷),期】2017(036)012
【总页数】5页(P700-704)
【关键词】罗氏海盘车;皂苷类成分;抗炎;提取纯化
【作者】解舒博;包永睿;孟宪生;王帅;李天娇
【作者单位】辽宁中医药大学药学院,辽宁大连116600;辽宁中医药大学药学院,辽宁大连116600;辽宁省组分中药工程技术研究中心,辽宁大连116600;辽宁省现代中药研究工程实验室,辽宁大连116600;辽宁中医药大学药学院,辽宁大连116600;
辽宁省组分中药工程技术研究中心,辽宁大连116600;辽宁省现代中药研究工程实验室,辽宁大连116600;辽宁中医药大学药学院,辽宁大连116600;辽宁省组分中
药工程技术研究中心,辽宁大连116600;辽宁省现代中药研究工程实验室,辽宁大
连116600;辽宁中医药大学药学院,辽宁大连116600;辽宁省组分中药工程技术研究中心,辽宁大连116600;辽宁省现代中药研究工程实验室,辽宁大连116600
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
罗氏海盘车是海盘车科罗氏海盘车(Asterias rollestoni Bell)的干燥全体，是我国
传统中药海星的一个药用品种[1]。

罗氏海盘车含有皂苷类、多糖类、多肽类、生
物碱类等化学成分[2]，具有解毒散结、和胃止痛等功效[3]。

现代实验表明其皂苷
类成分具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等生物活性[4-5]。

本试验经文献调研及前期实
验基础，对罗氏海盘车的皂苷类成分提取纯化工艺进行优化研究，确定了最佳工艺参数，获得纯度较高的有效部位，为罗氏海盘车药效物质基础及作用机制研究奠定实验基础，为其有效部位成为抗炎候选药物提供理论依据[6-8]。

HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD450、HPD-700、AB-8、D-101、
NKA-9、X-5、ADS-7 大孔吸附树脂、聚酰胺树脂(沧州宝恩化工有限公司)；罗氏海盘车药材[大连美罗中药厂有限公司，批号：Y08-114-201604105，经辽宁中
医药大学许亮教授鉴定为罗氏海盘车(Asterias rollestoni Bell)的干燥全体]；齐墩果酸对照品(纯度＞98%，中国药品生物制品检定所，批号：110709-200505)。

2.1 罗氏海盘车皂苷类成分提取工艺研究
2.1.1 对照品溶液的制备取齐墩果酸对照品5.0 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶液使溶解，并稀释至刻度，制成每1 mL中含0.100 mg的齐墩果酸对照品溶液，摇匀，备用，即得[9]。

2.1.2 供试品溶液的制备取罗氏海盘车药材粉末约1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入80%乙醇10 mL，加热回流提取2 h，提取1次，滤过，滤液蒸干，加
甲醇溶液使溶解，置50 mL量瓶中，摇匀，备用，即得。

2.1.3 检测波长的确定精密量取齐墩果酸对照品溶液0.5 mL置于5 mL具塞试管中，水浴蒸干，加入现配的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀，70℃水浴加热15 min后，冷却至室温，再加乙酸乙酯4 mL稀释，摇匀[9]。

将
其置于400～800 nm扫描，同法制得空白溶液，结果显示空白溶液于566 nm处无吸收，对照品溶液在566 nm处有最大吸收，故确定566 nm为检测波长。

2.1.4 标准曲线的绘制精密量取齐墩果酸对照品溶液 0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL 分别置于 5 mL具塞试管中，按“2.1.3”项下操作，在566 nm波长处测定吸光度，以齐墩果酸质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y＝44.418X-0.085 7，r＝0.999 5(n＝6)。

表明齐墩果酸在0.004～
0.020 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验精密量取对照品溶液0.5 mL，置于5 mL具塞试管中，按
“2.1.3”项下方法操作，于566 nm处连续测定6次吸光度，计算 RSD为
0.50%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验按“2.1.2”项下方法操作，制得供试品溶液，取同一供试品溶液，分别于室温下放置0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 h 后，按“2.1.3”项下方法操作，于566 nm处测定吸光度，计算RSD为1.58%，表明供试品溶液在2.0 h
内稳定。

2.1.7 重复性试验取同一样品粉末6份，精密称定，按“2.1.2”项下方法操作制
得供试品溶液，按“2.1.3”项下方法操作，于566 nm处测定吸光度，计算其中
以齐墩果酸计皂苷类成分含量为21.435 mg·g-1，RSD为 2.33%，表明该方法的重复性良好[10]。

2.1.8 正交试验设计优选罗氏海盘车皂苷类成分的提取工艺通过相关文献调研[11]，选定固液比、提取时间、提取次数和乙醇浓度4种因素，并分别选定3个水平进
行试验。

拟采用综合加权评分法进行数据处理[12]，总分以100分计，其中总皂
苷的含量占60分，出膏率占40分。

最终得到的综合评分公式如下：综合评分＝(皂苷含量/最大皂苷含量)×60+(出膏率/最大出膏率)×40。

以总皂苷含量和出膏率的综合评分作为衡量提取效率的客观指标，通过L9(34)正交试验考察，优选出最
佳提取条件。

正交试验设计及结果见表1～3。

通过表2～3，直观分析和方差分析结果显示，各因素对结果影响的重要程度依次
为提取次数(C)＞固液比(A)＞乙醇浓度(D)＞提取时间(B)。

其中提取次数(C)对提取率影响较大且具有显著性。

进一步对提取次数进行单因素试验，结果表明提取次数为3、4、5次时总皂苷含量无明显差异，因此确定最佳提取次数为3次。

故优选
出最佳提取条件为A2 B1C3D2：即10倍量80%乙醇，回流提取3次，每次提取1 h。

按上述试验条件重复3次测得以齐墩果酸计皂苷类成分含量分别为 31.094、
32.551、31.579 mg·g-1，平均值为31.741 mg·g-1，出膏率(出膏率＝干膏量/
生药量×100%)平均为32.58%，纯度(纯度＝总皂苷量/干膏量×100%)为9.74%，RSD为2.34%，证明该方法稳定，可行。

2.2 罗氏海盘车皂苷类成分纯化工艺研究
2.2.1 上样液的制备取罗氏海盘车药材粉末50 g，按“2.1.8”项下最佳提取工艺
制备浓度为0.1 g生药/mL的上样液，备用。

2.2.2 不同树脂静态吸附与解吸试验取预处理好的不同性质的11种大孔吸附树脂，抽滤至干，取2 g，分别置50 mL具塞锥形瓶中，加入上样液10 mL，振荡24 h 至吸附平衡，滤过，测定其中总皂苷含量。

取已饱和吸附的树脂分别过滤，置于
50 mL具塞锥形瓶中，加入80%乙醇10 mL，振荡24 h至解吸平衡，滤过，测
定其中的总皂苷含量[13]。

计算每种树脂的静态吸附率及解吸率。

试验表明，
NKA-9树脂吸附率较高且解吸率比其他树脂高，故选NKA-9型树脂为纯化罗氏
海盘车皂苷类成分的最佳型号树脂，见表4。

2.2.3 泄露曲线考察取NKA-9树脂30 mL，将浓度为0.4 g生药/mL的上样液进行动态吸附，收集流出液，每份5 mL，计算流出液中总皂苷含量，见图1A。

当
上样至第9份时流出液中皂苷含量显著增大，说明此时开始明显泄漏，故确定最
大上样量为40 mL(第8份)。

即上样量为0.53 g·mL-1(生药量/树脂体积)。

2.2.4 上样液浓度考察取NKA-9树脂30 mL，将6 个含生药浓度为 0.1、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0 g·mL-1的上样液，分别加入 100、50、25、20、12.5、10 mL，在相同条件下进行动态吸附及解吸。

收集洗脱液，测定总皂苷含量，计算解
吸量，见图1B。

当上样液浓度为0.4 g生药/mL时NKA-9对皂苷类成分的解吸
量均较其他几个浓度的高，因此确定最佳药液浓度为0.4 g生药/mL。

2.2.5 上样液pH的考察取处理好的NKA-9树脂40 mL，取6份0.4 g·mL-1的
上样液50 mL，分别调节pH 值至2、4、6、8、10、12，以相同条件动态吸附、洗脱，依法测定总皂苷含量，计算吸附量，见图1C。

结果表明上样液pH为6时，树脂吸附皂苷的能力最强，故选择样品溶液原液(pH＝6)直接上柱。

2.2.6 除杂用水量按上述条件动态吸附后，分别以 20、40、60、80、100、120 mL 水洗脱，收集洗脱液，再分别用5 BV 80%乙醇解吸，收集解吸液，测定总皂苷含量。

结果除杂用量为60 mL时，皂苷类成分纯度最高且损失较少，故除杂用
水量最佳为3 BV。

2.2.7 洗脱剂浓度考察按上述条件动态吸附、除杂后，分别用 5 BV的 50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定总皂苷含量，见图1D。

当乙醇浓度为90%时皂苷含量最高，故将浓度为90%乙醇作为洗脱溶媒。

2.2.8 洗脱剂用量的考察按上述条件动态吸附、除杂后，用90%乙醇洗脱，每10
mL收集一份洗脱液，共收集16份，测定其中总皂苷含量，见图1E。

第12份中皂苷含量很低，此时解吸量已占总解吸量的99%，表明此时已经基本解吸完全。

因此洗脱乙醇最佳用量为120 mL，即4 BV。

2.2.9 纯化工艺验证试验取3份罗氏海盘车药材粉末，精密称定，按照上述优选的最佳提取纯化工艺进行试验。

以总皂苷含量为指标，计算皂苷类成分的纯度(纯度＝总皂苷量/干膏量×100%)为40.99%、40.72%、39.93%，平均值为40.55%，RSD 为1.37；回收率为 2.53%、2.50%、2.55%，平均值为2.53%，RSD为1.11%。

结果显示该纯化工艺稳定、可靠。

但所得皂苷类成分的纯度不够，还需进行二次纯化。

2.2.10 二次纯化按照上述优选出的条件进行试验，得一次纯化物。

取10.0 g，加100 mL水超声30 min溶解，加100 mL石油醚脱脂后，加入200 mL水饱和正丁醇溶液(水与正丁醇1∶1混合均匀，超声30 min或静置过夜取上层即得)萃取，静置24 h后，取上层溶液，挥干，即得二次纯化物。

平行试验3次，测得纯度为75.11%、74.69%、76.53%，平均为75.44%，RSD为1.28%。

收率平均为
1.43%，RSD为1.23%。

表明该工艺稳定、可靠。

2.3 纯化前后罗氏海盘车皂苷类成分对细胞抑制率的影响
2.3.1 供试液的配制分别精密称取纯化前的粗提物和二次纯化后样品10 mg于10 mL具塞试管中，加5 mL DMEM培养液，过0.22 μm微孔滤膜，配制成2.00 mg·mL-1溶液，依次加培养液稀释使浓度分别为 1.00、0.50、0.25、0.13 mg·mL-1备用。

2.3.2 试验方法常规培养小鼠巨噬细胞RAW 264.7，接种于96孔培养板中。

分别加入粗提物和纯化物，每组设5个复孔，每孔加入150 μL，培养2 h后，每孔加入浓度为1.0 mg·L-1的脂多糖(LPS)溶液[14-16]，继续培养24 h。

采用噻唑蓝(MTT)法，用酶标仪于492 nm处测吸光度值，计算抑制率。

运用SPSS软件计算
IC50值，结果见表5。

由上表可知罗氏海盘车中皂苷类成分具有抑制炎症细胞生长的作用，且试验结果显示皂苷类成分纯化前后 IC50值分别为 0.78、0.29 mg·mL-1，纯化后比纯化前
IC50值降低了63%，说明总皂苷是抗炎的主要药效物质。

罗氏海盘车是中药海星的药用品种，在复方中的应用主要应用于伤科接骨方中。

伤科接骨方由马钱子粉、三七、红花、海星、炙鸡骨、土鳖虫、朱砂、煅自然铜、炙没药、炙乳香、甜瓜子及冰片12味中药组成，有消肿止痛、舒筋壮骨、活血化瘀的功效，并具有抗炎、健骨、改善血液循环的药理作用。

海星作为伤科接骨方中一味主要的动物药，发挥着重要作用。

本试验基于伤科接骨方的抗炎作用，对伤科接骨方中的主药海星的抗炎药效物质基础进行初步研究。

经文献调研发现罗氏海盘车中皂苷类成分为其主要化学成分，目前对罗氏海盘车中皂苷类成分的抗真菌、抗肿瘤等活性均有研究，但对其抗炎药效物质基础及作用机制研究报道较少，且提取出的总皂苷组分纯度较低，或分离纯化罗氏海盘车皂苷类成分的方法冗长复杂[6-8]。

故本试验以罗氏海盘车皂苷类成分抗炎药效为基础，
从药材到组分的整体角度出发，从实际工业生产考虑对其提取纯化工艺进行优化。

优选出最佳提取条件为10倍量80%乙醇，回流提取3次，每次提取1 h。

得到罗氏海盘车皂苷类成分以齐墩果酸计含量为31.741 mg·g-1，出膏率为32.58%。

纯化后将纯度从9.74%提升到75.44%，纯化后IC50值从0.78 mg·mL-1下降到
0.29 mg·mL-1，比纯化前降低63%，证明罗氏海盘车皂苷类成分是其抗炎活性成分，且随着总皂苷纯度增加，其抗炎药效也显著提升。

该试验获得纯度较高的抗炎有效部位，为罗氏海盘车药效物质基础及作用机制研究奠定基础。

目前，市场上的抗炎药物主要有生物制剂、甾体类抗炎药、非甾体类抗炎药[17]。

由于生物制剂存在易产生耐药性等问题，在临床应用等方面还存在诸多限制。

而天然产物由于具有结构多样性、生物活性多样性、耐药性弱等特点可以直接提供新药，
现代研究表明天然药物已经在抗癌、抗感染、免疫等方面显示出优势[18]，在天然药物中寻找到抗炎又无耐药性的先导性化合物具有重要意义。

本试验对天然海洋药物罗氏海盘车中具抗炎生物活性的皂苷类成分进行富集纯化，获得纯度较高的有效部位，为罗氏海盘车抗炎药效物质基础及作用机制研究奠定基础。

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