qPCR中文操作手册-120214

目录
1. 产品描述
2. 产品组分
3. 一般注意3.A 光谱3.B MgC 3.C 兼容
4. GoTaq® qP 4.A 应用4.B 应用4.C 应用4.D 应用5 附录 ........
5.A 快速5.B RT ‐q 5.C 实验5.D 引物5.E Real 5.F 相对5.G 常见5.H 相关
1. 产品描GoTaq® 料BRYT Gre 因定量，尤其GoTaq® BRYT Green®酶，MgCl 2，GoTaq®染料：与对PCR 反应与参比荧光染I 和ROX 完全DNA 聚在95℃加热并且与需要较DNA 模板中有GoTaq® 述 ...................分及储存条件意事项 ...........谱特性 .........Cl 2浓度 ........容仪器 .........PCR Master M 用ABI PRISM 用Bio ‐Rad iQ 用Roche Light 用Stratagene .....................速操作指南 .qPCR 实验方验条件的优化物设计及使用l Time PCR 数对定量 vs 绝见问题 .........关产品 .........描述
qPCR Maste een® dye ，此其适合低拷贝qPCR Maste ® dye ，低浓度dNTP 和专利® qPCR Mast SYBR® Gre 应无抑制作用染料CXR 的激全相同的设置合酶/缓冲液热2分钟时，酶较长预变性时有PCR 反应抑qPCR Maste .....................件 ........................................................................................................Mix 操作步骤M® 7500/7500Q5 Optical Sys tCycler 480 R Mx3005P TM ..........................................法 ................化 ..................用说明 ..........数据分析 .......绝对定量 .................................................r Mix 是采用此染料与双链贝基因的检测er Mix 产品提度的CXR （c 利的反应缓冲ter Mix 的优een I 染料相比，发出的荧光激发和发射波置。

液配方：GoTa 酶活性被完全时间的热循环抑制剂存在时r Mix 系统提..............................................................................................................................骤 ...................0 Fast/7900HT stem 的操作方Real Time PCR Real Time PC .............................................................................................................................................................................................用染料法进行链DNA 特异性测。

提供易用的、arboxy ‐X ‐rho 冲液。

另外独优点
比，GoTaq® q 光更强。

可以波长分别与S aq®热启动酶全激活。

专利环程序（95℃时，此缓冲液提供最小的批............................................................................................................................................T Real ‐Time P 方法 ............R 扩增仪的操CR 扩增仪的操....................................................................................................................................................................................行Real Time PC 性结合后，会2X 的预混液odamine ）参独立包装的1qPCR Master 以让样品的SYBR® Green 酶采用专利的利的酶/缓冲液℃，10min）兼液配方也能保批间差异，在...................................................................................................................................................PCR System 的.....................操作方法 ......操作方法 ..................................................................................................................................................................................................CR 的专用试会发出比SYB 液。

本产品中参比荧光染料00X CXR 用于Mix 专利染料C T 值更早出现I 和ROX 相近抗Taq 酶抗体液配方，能耐兼容。

对GC 保证扩增顺利宽广的线性范...................................................................................................................................................的操作方法 ..............................................................................................................................................................................................................................................................试剂。

本产品采R® Green I 更中已包含：专（性质与RO 于需要高浓度料BRYT Gree 现，线性范围近。

在实验过体，在室温时耐受更多的循含量较高（利进行。

范围内保证高
................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................采用一种新的更强的荧光信专利的双链D OX 相同），G 度参比荧光染en® dye 结合围更广。

BRY 过程中采用与时阻断Taq 酶循环数（45-560%以上）的高效、敏感的
................... ................... ................... ................... ................... ................... ................... ................... ................... ................... ................. 10................. 11................. 12................. 13................. 15................. 16................. 17................. 18................. 20................. 21的专利荧光染信号。

用于基NA 结合染料oTaq®热启动染料的仪器。

合双链DNA YT Green® dye SYBR® Green 酶的活性。

当50个循环），的DNA 片段的扩增。

2 3 4
4 4 4 5
6 7 8 0 1
2 3 5 6 7 8 0 1 染基料动
后e n 当或
2. 产品组
Pro GoT 包含
Pro
GoT 包含储存条件用过程中，所
组分及储oduct
Taq® qPCR M 含：
5 × 11002 × 13oduct Taq® qPCR M 含：
25 × 15 × 1010 × 1件：GoTaq® 所有组分可避储存条件Master Mix ml
μl 3ml
Master Mix 1ml 00μl 3ml
qPCR Master 避光2-8℃保
件
Go
Go r Mix 采用‐20保存3个月。

oTaq® qPCR M 100X CXR Re Nuclease ‐F oTaq® qPCR M 100X CXR Re Nuclease ‐F 0℃运输。

到
Size (50μl 反Master Mix, 2eference Dye Free Water
Size (50μl 反1Master Mix, 2eference Dye Free Water
到货后，将全反应体系)
200反应
2X
反应体系)
1000反应
2X
全部组分储存Cat.#A600Cat.#A6002存于-20℃，避# 1
# 2
避光保存。

使使
3. 一般注3.A 光谱GoTaq® 波长：493n 发射波长：6设置。

3.B MgCl 2GoTaq® 加入PCR 级3.C 兼容GoTaq® Mix 中已含有z z z z z z z z z z z z z 对于AB
请加入100×z z 注意事项谱特性
qPCR Maste m ，发射波长602nm 。

采用浓度
qPCR Maste 的高浓度镁离仪器
qPCR Maste 有低浓度的C Applied Bi Bio ‐Rad CF
Bio ‐Rad DN
Bio ‐Rad/M
Bio ‐Rad CF
Bio ‐Rad iC Bio ‐Rad M Cepheid Sm
Corbett Ro
Eppendorf
Roche Ligh
Stratagene
Stratagene
BI 仪器中除7CXR 参比荧Applied Bi Applied Bi 项
r Mix 采用的长：530nm 。

用GoTaq® qP r Mix 中的M 离子储存液er Mix 可用于CXR 参比染料osystems 750FX96 Real ‐Tim NA Engine Op MJ Research C FX96 Real ‐Tim ycler® iQ™ an
MyiQ™
Real ‐Ti martCycler® s otor ‐Gene™ 3f Mastercycle htCycler® 480e Mx3000P® a e Mx4000® M 7500和7500荧光染料至终osystems AB osystems 730
的专利染料B CXR 参比荧PCR Master M MgCl 2浓度已进（目录号：A 于任何能够检料。

对于以下00 and 7500 me PCR Detec pticon® and O Chromo4™ Re me PCR Detec nd iQ™ 5 Rea me PCR Dete system 3000 and 600er® ep realple 0 Real ‐Time P and Mx3005P Multiplex Qua 0 Fast 之外的终浓度为1×I PRISM® 70000 and 7900H RYT Green® d 荧光染料具有Mix 进行基因进行优化以达A3511，A351检测SYBR® Gr 下仪器，可直FAST Real ‐Tim ction System Opticon® 2 Re eal ‐Time Dete ction System al ‐Time PCR D ection System 00 Real ‐Time ex Real ‐Time PCR System P® Real ‐Time ntitative PCR 的型号，由于。

包括以下型00 and 7700 S HT Real ‐Time dye 具有与S 有与ROX™相因定量时使用达到最佳表现13）。

reen I 或FAM 直接使用，无me PCR Syste eal Time PCR ector Detection Syst m Rotary Analy PCR System PCR Systems R System 于仪器本身的型号：
Sequence Det PCR System SYBR® Green 同的光谱特性与SYBR® Gr 现。

如需对镁M™染料的仪器无需再加入参m Detection Sy tem zer s 的原因，需要tection Syste
I 相似的光谱性，激发波长reen I 和ROX 镁离子浓度进器。

GoTaq® 参比荧光染料ystems 要高浓度的参em
谱特性，激发长：580nm ，X 完全相同的进行调整，请qPCR Maste ：
比荧光染料，
发的请r ，
z z
4. GoTaq 本产品基的扩增试剂标准管和样以下步骤的用量。

以下模板，总体积由实验者z qPC z 带滤z 移液z 与z Mg
1) Go 离心2) 配制将反3) 将稀对应4) 反应5) 使用Rea
Applied Bi Applied Bi q® qPCR 基于BRYT G 以得到更佳品管的扩增反骤以20μl 反下操作步骤中积20μl ），如加者提供的材料CR 引物，DN 滤芯枪头，无液器、Real T Real Time PC gCl 2储存液（oTaq® qPCR M 心收集后使用制不加模板的反应混合液稀释好的标准应的反应孔中应板封口，轻用Real Time al Time PCR 扩osystems Ge osystems Ste Master M reen® dye 染的扩增效果。

反应（大约每反应体系为例中，DNA 模板加入DNA 模板料
NA 模板，阳无菌、无核酸Time PCR 仪、CR 仪器配套（可选） Master Mix 在用，避免剧烈的反应混合液18μl 分至各准品DNA 模中，注意防止轻微离心将所 PCR 扩增仪扩增仪，可参St St
St
neAmp® 570
epOne™ and S Mix 操作染料法Real T 。

为保证实验每20个反应进行PCR 扩增板的加入量占板量多于或少性对照模板酸酶离心管用、离心机
的96/384孔在室温融化后烈震荡，避免
液，吹打或轻反应孔； 板、样品DN 止各样品间交所有的反应组，按照以下通参考后续内容tage 1 预变性tage 2 热循环tage 3 熔解曲0 Thermal Cy StepOnePlus™作步骤
Time PCR 进行验的均一性，应，在配制时增，如需增大占反应总体积少于2μl ，请按，标准品
用于反应混合孔板及封口膜后置于冰上，用免形成泡沫或轻微震荡混匀NA 或Nuclea 交叉污染；组分离心至管通用的PCR 程容；如需条件性1 cycle 环40 Cycle
曲线(Dissocia ycler
™ Real ‐Time 行基因定量。

请预先配制需多配1个反大或减小反应积的10%（例按照总体积2合液的配制膜 用前颠倒、吹或长时间曝光匀，避免剧烈震ase ‐Free Wat 管底，并去除程序进行PC 件优化，可参95℃ 2 m 95℃ 15 60℃
1 m
ation stage)
PCR Systems 可直接替换制足够量的无反应）。

应体积，请按例如，18μl 反20μl 调整Nu 吹打或轻微震光； 震荡，避免形ter （用作阴性除气泡；
R 扩增反应参考附录5.C ）min sec min 换其他基于S 无模板反应混按比例增加或反应混合液加clease ‐Free W 震荡混匀，用形成泡沫或长性对照）各（针对不同品：
YBR® Green 混合液，用于或缩减各组分加入2μl DNA Water 的量。

用离心机轻微长时间曝光。

2μl 分别加入品牌及型号的I
于分A
微
入的
对于不4.A 应用请按照仪1) 按下组分Nuc 上游下游GoT CXR 总体* DNA 模模板的加如果待测一步反转DNA 模检测的重如果待测必要时可* 通常引性反应或* ABI 仪Mix 可直2) 进行建议扩增性能
同品牌及型号ABI PRIS 仪器使用说明下表配制PC 分
clease ‐Free W 游引物（10游引物（10Taq® qPCR M R 100X* 体积
模板的添加量加入量需要调测目的基因含转录反应采用板时的添加量重复性； 测目的基因含可进行梯度稀引物终浓度为或引物二聚体仪器除7500直接使用，无行Real Time 议采用下列图能较差时，可号的Real Tim M® 7500/明书并参考以CR 反应混合液Water
μM ） μM ） Master Mix, 2X 量通常在10调整； 含量较低，欲用的是Prom 量可以达到含量较高，如稀释，确定最为0.2μM 可得体时，可尝试和7500 Fast 之无需再加入C PCR 反应：
图表显示的两可以尝试进行
me PCR 扩增/7500 Fast 以下要求进行液（反应液配体积7μl
0.4μ0.4μX 10μ0.2μ18μ0ng 以下。

因欲使用本制品ega 的GoScr PCR 反应体系如内参基因β最佳的DNA 模得到较好结果试将引物浓度之外的型号需CXR 参比荧光两步法PCR 反行三步法PCR 仪，可以参考t/7900HT 行实验操作。

配制可在室温积（20μl 反应l l l l l
因不同种类的品进行2 Step ript™ Revers 系总体积的‐actin 、GAPD 模板添加量。

果。

可以在0度降至0.05需加入高浓度光染料。

反应程序。

如R 扩增反应考以下的操作T Real ‐Tim
温进行），并应体系） 的DNA 模板p RT ‐PCR 反应se Transcripti 20%。

通过多H 、18S 等，建。

0.1～1.0μM 范～0.1μM 。

度CXR 。

对于7如果使用的是（见附录5.C 作方法：
e PCR Sys 分至各反应管终浓
0.2μ0.2μ1X 1X
中含有的靶基应的第二步P ion System (多加入模板的建议减少DNA 范围内调整引500和7500 F 是Tm 值较低的实验条件的
stem 的操管，然后加入浓度 M* M* 基因的拷贝数PCR 扩增反应(A5000)，cD 的方式，提高A 模板加入量引物浓度。

当Fast ，GoTaq®的引物，两步的优化）。

操作方法
入2μl*模板：数不同，DNA 应时，如果第NA 产物作为高低拷贝基因量至0.4‐1μl ，当出现非特异 qPCR Maste 步法PCR 反应
：
A 第为因异r 应
ABI PR ABI PRISM ®3) 实验反应5.E
4.B 应用请按照仪1) 按下组分Nuc 上游下游GoT 总体
◆特别提本产品中同时GoTa 并且能够验要求延RISM ®
7500/7®
7500 Fast R 验结果分析
应结束后确认E Real Time PC Bio ‐Rad i 仪器使用说明下表配制PCR 分
clease ‐Free W 游引物（10游引物（10Taq® qPCR M 体积
提示：中使用的GoTa aq®热启动酶够耐受更多的延长预变性时7900HT Real Real ‐Time PCR 认Real Time CR 数据分析iQ5 Optica 明书并参考以R 反应混合液Water μM ） μM ） Master Mix, 2X aq®热启动酶酶具有更强的的循环数（45时间和增加循环-Time PCR S R System 采用PCR 的扩增析）。

al System 以下要求进行液（反应液配体积7.2μ0.4μ0.4μX 10μ18μ酶采用抗体法介热稳定性，‐50循环）。

环数。

System 采用下用下列设置：两步St St St 曲线和融解的操作方行实验操作。

配制可在室温积（20μl 反应l
l l l l
介导的热启动即使预变性时因此，使用G 下列设置：
两步法PCR Stage 1 Stage 2 Stage 3
步法快速PCR tage 1 预变性tage 2 热循环tage 3 熔解曲曲线，进行绝方法
温进行），并分应体系） 动，预变性9时间延长至9GoTaq® qPCR R 标准扩增程预变性1 cy 热循环40 熔解曲线(D 扩增程序： 性1 cycle 环40 Cycle
曲线(Dissocia 绝对定量时制分至各反应管终浓
0.2μ0.2μ1X
95℃、2分钟可95℃、10分钟R Master Mix 进程序： ycle 95℃Cycle
95℃60℃Dissociation st 95℃ 2 m 95℃ 3 s 60℃
30 ation stage)
制作标准曲线管，然后加入浓度 M* M* 可完全激活酶钟也不会降低进行实验，可 2 min 15 sec
1 min
tage) min sec sec
线等（见附录入2μl*模板：酶活性。

低酶活性，可根据实
录
* DNA 模模板的加如果待测一步反转DNA 模检测的重如果待测必要时可* 通常引性反应或2) 进行建议扩增性能3) 实验反应5.E Real 4.C 应用请按照仪1) 按下
◆特别提本产品中同时GoTa 并且能够验要求延模板的添加量加入量需要调测目的基因含转录反应采用板时的添加量重复性； 测目的基因含可进行梯度稀引物终浓度为或引物二聚体行Real Time P 议采用下列图能较差时，可验结果分析
应结束后确认 Time PCR 数Roche Lig 仪器使用说明下表配制PC 提示：中使用的GoTa aq®热启动酶够耐受更多的延长预变性时量通常在10调整； 含量较低，欲用的是Prom 量可以达到含量较高，如稀释，确定最为0.2μM 可得体时，可尝试PCR 反应：
图表显示的两可以尝试进行认Real Time 数据分析）。

ghtCycler 4明书并参考以CR 反应混合液
aq®热启动酶酶具有更强的的循环数（45时间和增加循环0ng 以下。

因欲使用本制品ega 的GoScr PCR 反应体系如内参基因β最佳的DNA 模得到较好结果试将引物浓度两步法PCR 反行三步法PCR PCR 的扩增480 Real T 以下要求进行液（反应液配酶采用抗体法介热稳定性，‐50循环）。

环数。

因不同种类的品进行2 Step ript™ Revers 系总体积的‐actin 、GAPD 模板添加量。

果。

可以在0度降至0.05反应程序。

如R 扩增反应曲线和融解Time PCR 行实验操作。

配制可在室温介导的热启动即使预变性时因此，使用G 的DNA 模板p RT ‐PCR 反应se Transcripti 20%。

通过多H 、18S 等，建。

0.1～1.0μM 范～0.1μM 。

如果使用的是（见附录5.C 两步
Stage 1 预Stage 2 热
Stage 3 熔曲线，进行绝扩增仪的
温进行），并动，预变性9时间延长至9GoTaq® qPCR 中含有的靶基应的第二步P ion System (多加入模板的建议减少DNA 范围内调整引是Tm 值较低的实验条件的步法PCR 标准预变性1 cy 热循环40 C 熔解曲线(Dis 绝对定量时制的操作方法分至各反应管95℃、2分钟可95℃、10分钟R Master Mix 进
基因的拷贝数PCR 扩增反应(A5000)，cD 的方式，提高A 模板加入量引物浓度。

当的引物，两步的优化）。

准扩增程序：ycle 95℃ Cycle 95℃ 60℃
ssociation sta 制作标准曲线法
管，然后加入可完全激活酶钟也不会降低进行实验，可数不同，DNA 应时，如果第NA 产物作为高低拷贝基因量至0.4‐1μl ，当出现非特异步法PCR 反应 2 min 15 sec 1 min
age)
线等（见附录入2μl*模板：酶活性。

低酶活性，
可根据实A 第为因异应
录：
组分Nuc 上游下游GoT 总体* DNA 模模板的加如果待测一步反转DNA 模检测的重如果待测必要时可* 通常引性反应或2) 进行建议扩增性
两步法
Pre ‐
denatu Amplificati Melting Cu
分
clease ‐Free W 游引物（10游引物（10Taq® qPCR M 体积
模板的添加量加入量需要调测目的基因含转录反应采用板时的添加量重复性； 测目的基因含可进行梯度稀引物终浓度为或引物二聚体行Real Time 议采用下列图能较差时，可PCR
标准扩增
循环数
ure 1 cycle
on 40 Cycle
rves (熔解曲线
Water μM ） μM
） Master Mix, 2X 量通常在10调整； 含量较低，欲用的是Prom 量可以达到含量较高，如稀释，确定最为0.2μM 可得体时，可尝试PCR 反应：
图表显示的两可以尝试进行增程序： 温度
95
℃
95℃
60℃
线)
体积7.2μ0.4μ0.4μX 10μ18μ0ng 以下。

因欲使用本制品ega 的GoScr PCR 反应体系如内参基因β最佳的DNA 模得到较好结果试将引物浓度两步法PCR 反行三步法PCR 时间 Ramp 2 min 4.4℃15 sec 4.4℃1 min 2.2℃
积（20μl 反应l
l l l l
因不同种类的品进行2 Step ript™ Revers 系总体积的‐actin 、GAPD 模板添加量。

果。

可以在0度降至0.05反应程序。

如R 扩增反应p Rate /秒 /秒 /秒
应体系） 的DNA 模板p RT ‐PCR 反应se Transcripti 20%。

通过多H 、18S 等，建。

0.1～1.0μM 范～0.1μM 。

如果使用的是（见附录5.C ◆特别提示：
本产品中使用
介导的热启动活酶活性。

同热稳定性，即钟也不会降低环数（45-50qPCR Mast 延长预变性时终浓
0.2μ0.2μ1X
中含有的靶基应的第二步P ion System (多加入模板的建议减少DNA 范围内调整引是Tm 值较低的实验条件的用的GoTaq®动，预变性95同时GoTaq®即使预变性时低酶活性，并0循环）。

因ter Mix 进行实时间和增加循浓度 M* M* 基因的拷贝数PCR 扩增反应(A5000)，cD 的方式，提高A 模板加入量引物浓度。

当的引物，两步的优化）。

®热启动酶采用5℃、2分钟可®热启动酶具有时间延长至95并且能够耐受更因此，使用Go 实验，可根据循环数。

数不同，DNA 应时，如果第NA 产物作为高低拷贝基因量至0.4‐1μl ，当出现非特异步法PCR 反应用抗体法可完全激
有更强的
5℃、10分更多的循oTaq® 据实验要求A 第为因异应
4) 实验反应5.E 4.D 应用请按1) 按下组分Nuc 上游下游GoT 总体* DNA 模模板的加如果待测一步反转DNA 模检测的重如果待测必要时可* 通常引性反应或2) 进行建议
应扩增性验结果分析
应结束后确认E Real Time PC Stratagen 按照仪器使用下表配制PCR 分
clease ‐Free W 游引物（10游引物（10Taq® qPCR M 体积
模板的添加量加入量需要调测目的基因含转录反应采用板时的添加量重复性； 测目的基因含可进行梯度稀引物终浓度为或引物二聚体行Real Time 议采用下列图
性能较差时，认Real Time CR 数据分析ne Mx300用说明书并参R 反应混合液Water μM ） μM ） Master Mix, 2X 量通常在10调整； 含量较低，欲用的是Prom 量可以达到含量较高，如稀释，确定最为0.2μM 可得体时，可尝试PCR 反应：
图表显示的两
，可以尝试进PCR 的扩增析）。

5P TM Real 参考以下要求液（反应液配体积7.2μ0.4μ0.4μX 10μ18μ0ng 以下。

因欲使用本制品ega 的GoScr PCR 反应体系如内参基因β最佳的DNA 模得到较好结果试将引物浓度两步法PCR 反进行三步法
P 曲线和融解l Time PCR 求进行实验操配制可在室温积（20μl 反应l
l l l l
因不同种类的品进行2 Step ript™ Revers 系总体积的‐actin 、GAPD 模板添加量。

果。

可以在0度降至0.05反应程序。

如PCR 扩增反应
S
S S 曲线，进行绝R 扩增仪的操作。

温进行），并分应体系） 的DNA 模板p RT ‐PCR 反应se Transcripti 20%。

通过多H 、18S 等，建。

0.1～1.0μM 范～0.1μM 。

如果使用的是应（见附录5
两步法P egment 1 预egment 2 热
egment 3 熔绝对定量时制的操作方法分至各反应管终浓
0.2μ0.2μ1X
中含有的靶基应的第二步P ion System (多加入模板的建议减少DNA 范围内调整引是Tm 值较低5.C 实验条件PCR 标准扩增预变性1 cycl 热循环40 Cyc 熔解曲线(Diss 制作标准曲线法
管，然后加入浓度 M* M* 基因的拷贝数PCR 扩增反应(A5000)，cD 的方式，提高A 模板加入量引物浓度。

当低的引物，两件的优化）。

增程序： e 95℃ ycle 95℃ 60℃
ociation stag 线等（见附录入2μl*模板：数不同，DNA 应时，如果第NA 产物作为高低拷贝基因量至0.4‐1μl ，当出现非特异两步法PCR 2 min 15 sec 1 min
ge)
录
A 第为因异反
3) 实验反应5.E
5 附录
◆特别提本产品中同时GoTa 并且能够验要求延验结果分析
应结束后确认E Real Time PC 提示：中使用的GoTa aq®热启动酶够耐受更多的延长预变性时认Real Time CR 数据分析
aq®热启动酶酶具有更强的的循环数（45时间和增加循环PCR 的扩增析）。

酶采用抗体法介热稳定性，‐50循环）。

环数。

曲线和融解介导的热启动即使预变性时因此，使用G 曲线，进行绝动，预变性9时间延长至9GoTaq® qPCR 绝对定量时制95℃、2分钟可95℃、10分钟R Master Mix 进
制作标准曲线可完全激活酶钟也不会降低进行实验，可线等（见附录酶活性。

低酶活性，
可根据实
录
5.A 快速用于实验合液的配制
96孔板上样
1 A B C D E F G H
简要操作步1)GoTaq 前混匀2)配制不避免剧3)将稀释分别加4)反应板
5)
使用
程序设置：
Stage 1 预Stage 2 扩Stage 3 溶
速操作指南验记录及实验、PCR 程序设样设置： 2
步骤（以20q® qPCR Mast 匀； 不加模板的反剧烈震荡。

将释好的标准品加入对应的反板封口，轻微Real Time PC ： 温度预变性 95 扩增
95 60
溶解曲线：加入南
验过程中随时设置、96孔板3
4
μl 反应体系加ter Mix 在室温反应混合液，将反应混合液品DNA 模板、样反应孔中； 微离心以收集组CR 扩增仪，进 时间 循℃ 2 min ℃ 15 sec 4℃ 1 min
入仪器的默认程时参考的快速板上样设置，5
加入2μl 模板为温融化后置于吹打或轻微震18μl 分至各反样品DNA 或H 组分并去除管进行PCR 扩增循环数 1 40
程序。

速操作指南，请根据实验6
7
为例）：
于冰上，用震荡混匀，反应孔； 2O 各 2 μl 管底气泡；增反应。

反应混合液组分
Nucle 上游引下游引GoTaq CXR 10总体积包括简化的验设计进行调8
所需材••••••••
液的配制：
ase ‐Free Wate 引物（10μM 引物（10μM q® qPCR Maste 00X 积
的操作步骤、调整和填写。

9
1
材料：
离心管及带滤芯枪移液器、Real Time
DNA 模板上/下游引GoTaq® q MgCl 2储存er ） ） er Mix, 2X 所需材料列 10 11
及96孔板、封枪头 离心机 e PCR 仪 板：标准品、引物
qPCR Master M 存液（可选）体积 ×样 μl 0.4μl 0.4μl 10μl μl 18μl
列表、反应混12
封口膜 样品 Mix
品个数 μl μl μl μl μl μl
混
5.B RT ‐qP 进行RT GoTaq® 2‐Ste Master Mix 。

Mix 的超亮荧z 高效z 低拷z 对多z 在抑z GoS 加至进行反转1) 按下*反* O 使用
使用1μl 也可终浓2) 将R 3) 按下
PCR 时的实T ‐qPCR 时，使ep RT ‐qPCR S GoTaq® 2‐S 荧光结合在一效合成全长c 拷贝和高拷贝多种样品均可抑制剂存在时Script™ Rever 至qPCR 反应转录反应时，下表配制模板组分
RNA (最高Oligo(dT)1Random P
Nuclease ‐终体积
反应体系可按ligo(dT)15 Pri 用单引物进行用单引物进行（终浓度0.0可使用基因特浓度1μM。

RNA 模板与引下表配制反转实验方法
使用Promeg System
由两部Step RT ‐qPCR 一起，可对各cDNA ；
贝靶标均可被可呈现良好的时仍具有强劲rse Transcript 应体系的20%，按以下步骤板RNA 与引物高5μg/反应)
5 Primer* Primer
Free Water(加比例放大
mer 与Rand 行反转录时，行反转录时，025μg/μl ）。

特异的引物引物的混合液转录混合液：
a GoTaq® 2‐S 部分组成：Go R 系统将 Go 各种长度的RN 被灵敏检测；的线性； 劲活性；
tion System 合。

通过增大模骤进行： 物的混合液：加至10μl) om Primer 同建议使用随使用量：Olig （gene ‐specifi 液70℃变性 Step RT ‐qPC oScript™ Reve oScript TM 逆转NA 靶标进行 合成的cDNA 模板的用量，
体积（20同时使用，可随机引物Ran go(dT)15 Prim c primer ）进5min，完成后R System （A erse Transcrip 转录酶的高效行优质、灵敏地A 产物对后续，可以提高低μl 反应体系） 10可有效提高反dom Primer 。

mer ，1μl （终浓进行反转录，使后置于冰上A6010），操作ption System 效逆转录活性地定量检测。

续qPCR 反应无低拷贝基因的*
μl
1μl 01μl 0μl 0μl
反转录效率， 浓度0.025μg 使用gene ‐sp 5min； 作更方便，结（A5001）和性和GoTaq® 。

此系统主要无抑制作用。

的检测准确度终浓度
0.025μg/μl 0.025μg/μl
建议同时使g/μl ）或Rand pecific primer 结果更可靠。

GoTaq® qPCR qPCR Maste 要功能包括：作为模板可度和重复性。

用。

dom Primer ，r 时建议加至R r
可
至
Nucl GoSc MgC PCR Reco GoSc 终体4) 向步5) 按下6) cDN 以上的操例如取消RN 15min 延伸亦简化及优化http://www.
lease ‐Free W cript™ 5X Rea Cl2, 25mM
Nucleotide M ombinant RN cript™ Revers 体积
步骤2)的模板下列程序进行NA 合成结束操作步骤采用NA 在70℃ 5亦可保证绝大，见GoTaq® 组分
Water(加至10action Buffer Mix, 10mM asin® Ribonu se Transcripta 板与引物混合行cDNA 第一Step Anneal
Extend Inactiva Chill
后可立即进行用标准的反应min 变性及大部分的RN ® 2‐Step RT ‐q m/resources/
0μl) clease Inhibit ase 合液中加入反一链的合成：ate 行后续的qP 应程序，以确25℃ 5min 退A 反转录成PCR System 的/protocols/tec Go 反转录tor 反转录混合液
温度 25℃ 42℃ 70℃ 4℃
PCR 基因定量确保全部RNA 退火，而将模cDNA ，能够的操作手册T chnical ‐manu oScript
录混合液
1.5μl
4μl 2μl 1μl 0.5μl 1μl 10μl
液； 时间5 min 1 hour 15 min Hold
量，也可储存能高效、全长模板RNA 、引物够进行成功的TM337：uals/101/gota 无酶阴性对照2.54210.5010n 于‐20℃备用长反转录成c 物、反转录酶qPCR 基因定aq ‐2‐step ‐rt ‐q
照
终浓5μl
μl μl 2.μl 0.5μl 20μl 0μl
用；
cDNA 。

简化的酶等混合后直定量。

关于反qpcr ‐system ‐
浓度 1X
5mM 5mM 0units
的反应程序，直接进行42℃反转录条件的protocol/。

℃ 的
5.C 实验成功的z 扩增
z 熔解z 扩增z PCR 对Real 1) 预变
全激也不组D 低，2) 引物一般现非3) 引物有非4) PCR 首次为提5) 镁离会提2mM
条件的优Real Time PC 增曲线呈“解曲线呈单峰增产物起峰早R 扩增效率高Time PCR 反变性时间：本激活酶活性。

不会降低酶活DNA 或质粒Ct 值很大，物浓度：通常般情况下，降非特异性反应物的退火温度非特异性扩增R 程序设置（次进行Real T 提高扩增效率离子浓度：反提高特异性。

M ‐5mM 范围优化
CR 实验应表现S ”形； 峰，将产物跑早（Ct 值小）高（接近理论应条件的优化本产品使用的同时GoTaq 活性，并且能DNA ，需要延扩增曲线不常引物终浓度降低引物浓度应或引物二聚度：首次进行增时，可适当（对反应的特Time PCR 时，率，可增加延反应体系中镁GoTaq® qPC 围内进行。

现为： 跑胶观察条带）；
论值100%）。

化主要从以下的GoTaq®热启q®热启动酶具能够耐受更多延长预变性时不完整时，可度为0.2μM 可度有助于提高聚体时，可尝行Real Time P 当提高退火温特异性和扩增可采用2步延伸时间或将镁离子浓度升CR Master
M 带无引物二聚
下几个方面进启动酶采用抗具有更强的热多的循环数（4时间时，可延可增加循环数可得到较好结高扩增的特异尝试将引物浓PCR 的引物，温度。

必要时增效率非常重步法标准延伸将两步法PCR 升高会提高PC Mix
中已含有聚体或其他非进行：
抗体法介导的热稳定性，即45‐50循环）。

延长至5‐10分数以得到完整结果。

可以在性，提高引物浓度降至0.05其退火温度时可进行梯度要）：
伸程序，当R 改为三步法CR 反应的效
有中等浓度的非特异性扩增的热启动，预即使预变性时。

因此，如果分钟。

当待测的扩增曲线在0.1～1.0μM 物浓度有助于～0.1μM 。

度可以设置在PCR，以确定Real Time PCR PCR ，如下图率，降低特异镁离子（
2m
增； 预变性95℃，时间延长至95果采用的PCR 测基因在样品。

范围内调整于提高扩增的在比引物Tm 值定最佳退火温R 反应扩增效图所示：
异性。

而降低mM ）。

需要调
2分钟可完5℃、10分钟R 模板是基因品中的含量极整引物浓度。

的效率。

当出值低5℃。

当温度。

效率较低时，低镁离子浓度调整时，可在
完钟因极出当度在
5.D 引物设计用于1) 引物2) 至少3) GC 含4) 引物提供* Pri http 5) 上游Tem * Tm http 6) 扩增对于大可以在0.05‐
物设计及使于Real Time 物长度15‐25少跨越一个内含量50%（2物的Tm 值建供的Primer B imer BLAST ：://www.ncbi 游引物和下游mperature) Ca m (Melting Tem ://www.prom 增片段的长度多数GoTaq®1μM 之间进使用说明
PCR 的引物个碱基；
内含子，以区20%‐80%）；
建议在65℃左BLAST*工具；
/游引物的Tm alculations fo mperature) C /res 度不宜过长，® qPCR 反应，进行。

，建议遵循以区分mRNA 和左右，以用于 /tools/primer 值要接近。

关r Oligos*”工Calculations fo sources/tools 一般为50‐2上下游引物以下原则：和基因组DNA 标准的两步法r ‐blast/index 关于Tm 值的工具； or Oligos ：
s/biomath ‐ca 250bp 之间。

各200nM 通A 的扩增片段法PCR 扩增程.cgi?LINK_LO 的计算，可以alculators/
通常能够得到段； 程序。

引物设OC=BlastHome 以使用Prome 到较好结果，当
设计工具，推e
ega 提供的“当需要优化引
推荐使用NCB “Tm (Melting 引物浓度时，
BI
g
5.E Real T Real Tim 有）、溶解曲扩增曲线标准曲线
熔解曲线Time PCR me PCR 实验曲线（只有染线（Amplific 线（Standard 线（
Dissocia 数据分析验完成后，通染料法才有）。

cation curve ）d curve ）：根tion curve ）
：析
通常可以得到。

对Real Tim ：根据扩增根据标准曲线
根据熔解曲以下三组数据me PCR 结果进曲线输出C T 线计算拷贝数
曲线判断产物据：扩增曲线进行分析，主值
数与扩增效率
物特异性
线、标准曲线
主要是研究此
线（只有采用
此三组数据。

用标准品时才
才。