乳酸菌发酵甘蔗糖蜜产乳酸的培养条件优化

CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS 2018年第37卷第10期
·4006·
化 工 进
展
乳酸菌发酵甘蔗糖蜜产乳酸的培养条件优化
杜刚1，刘赟1，詹梦涛1，胡秋月2，张振宇3，杨海英2
（1云南民族大学民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室, 云南 昆明 650500； 2云南民族大学
化学与环境学院，云南 昆明 650500；3云南省药物研究所，云南 昆明 650111）
摘要：乳酸是有广泛应用的有机酸，廉价原料是降低乳酸生产成本的重要因素。

以实验室前期筛选的植物乳杆菌sy4为出发菌株研究了利用甘蔗糖蜜生产乳酸的培养条件。

在确定发酵温度和初始pH 后，通过Plackett-Burman 实验和中心复合实验优化乳酸发酵条件。

结果表明：植物乳杆菌sy4乳酸发酵的最适条件为温度32℃、60h 、初始pH 6.5；Plackett-Burman 实验表明酵母提取物、糖蜜和碳酸钙是影响乳酸产量的主要因素；中心复合实验得到三因素的最优组合为：酵母提取物13.19g/L 、糖蜜476.63g/L 和碳酸钙134.82g/L ，确定了最适发酵培养基。

在此条件下乳酸产量为(145.53±1.24)g/L ，与模型预测值147.23g/L 接近。

本研究为以甘蔗糖蜜为原料生产乳酸提供了技术支持。

关键词：乳酸；植物乳杆菌；甘蔗糖蜜；发酵条件优化
中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2018）10–4006–07 DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2017-2487
Fermentation condition optimization for lactic acid production with cane
molasses by Lactobacillus
DU Gang 1, LIU Yun 1, ZHAN Mengtao 1, HU Qiuyue 2, ZHANG Zhenyu 3, YANG Haiying 2
(1Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources, State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education, Kunming 650500 ,Yunnan, China; 2 School of Chemistry and Environment, Yunnan Minzu University, Kunming 650500,
Yunnan, China; 3 Yunnan Institute of Materia Medica, Kunming 650111, Yunnan, China)
Abstract: Lactic acid is a widely used organic acid. Using the cheap raw material is the key factor for reducing the production cost of the lactic acid. Lactobacillus plantarum sy4, which was screened in our previous work, was used as an original strain for the lactic acid production with cane molasses. The fermentation conditions of the lactic acid were optimized with the Placket-Burman Design and the Central Composite Design after studying the fermentation temperatures and initial pH. The results showed that the optimal fermentation conditions for sy4 were 32℃, 60h, and initial pH 6.5. The results of Placket-Burman Design showed that the yeast extract, cane molasses and calcium carbonate were the main factors for the lactic acid production. And the results of the Central Composite Design showed that the optimal combination of those three factors were yeast extract 13.19g/L, cane molasses 476.63g/L and calcium carbonate 134.82g/L. The optimal fermentation medium was confirmed and the lactic acid production was (145.53±1.24)g/L, which was closed to the predicted value 147.23g/L. The research provided the technical support for future lactic acid production with the cane molasses.
Key words: lactic acid; Lactobacillus plantarum ; cane molasses; fermentation condition optimization
E-mail ：***************.cn 。

通讯作者：杨海英，教授，硕士生导师，研究方向为微生物化学。

E-mail ：********************.cn 。

收稿日期：2017-12-04；修改稿日期：2018-04-03。

基金项目：国家自然科学基金项目（21462051）。

第一作者：杜刚（1973—），男，博士，副教授，研究方向为微生物。

第10期杜刚等：乳酸菌发酵甘蔗糖蜜产乳酸的培养条件优化·4007·
乳酸是易溶于水和乙醇的无色天然有机酸，广泛应用于日化、医药，也可作为生产植物生长调节剂和特殊化学中间体的原料[1-3]。

乳酸聚合成的聚乳酸可作为生物相容性很好的可降解聚合材料，生产环境友好的包装材料而取代部分石化产品，因此市场对聚乳酸单体乳酸需求日益增长[4]。

乳酸的生产主要有化学合成和微生物发酵两种方法，微生物发酵具有成本低、生产条件温和和低能耗等优点，已成为乳酸生产的主流方法[5]。

乳酸发酵中成本控制是最重要的考虑因素之一，因此很多廉价的原料被尝试用于发酵乳酸，如含淀粉的日本烧酒、麦麸、马铃薯皮和咖啡残渣等[6-7]，含糖的粗制糖、甘蔗汁、糖用甜菜、精制糖蜜、甜菜糖蜜、玉米糖浆和乳清等[8-10]。

甘蔗糖蜜是蔗糖生产过程中产生的副产品，含有约46%的糖、3%的粗蛋白和维生素等营养成分[11]，通常甘蔗糖蜜用来发酵酒精和作为饲料添加剂[12-13]。

有研究用甘蔗糖蜜发酵生产乳酸，SANGPROO等[14]以工程菌株产酸克雷伯菌进行糖蜜产乳酸发酵，可获得33～34g/L的D-乳酸，SRIV ASTA V A等[12]以德氏乳酸杆菌NCIM 2025发酵甘蔗糖蜜，经硫酸处理糖蜜，可获得84.5g/L的乳酸。

本文以前期筛选出的从德宏傣家酸鱼中分离得到的植物乳杆菌sy4为发酵菌株[15]，对未经前处理的甘蔗糖蜜进行乳酸发酵优化研究，通过Plackett-Burman实验和中心复合实验，以期获得最佳乳酸发酵条件，为利用甘蔗糖蜜发酵生产乳酸提供技术支持。

1 材料与方法
1.1 菌株
植物乳杆菌sy4分离自云南德宏傣家酸鱼，结合菌株形态及16SRNA分析鉴定为植物乳杆菌，登录号为：KJ801851。

1.2 培养基
MRS培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，吐温-80 1mL，柠檬酸三铵2g，CH3COONa 1g，MnSO4 0.25g，MgSO4 0.58g，KH2PO4 2g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然。

固体培养基添加1.8%的琼脂，供菌株保存、活化、种子培养等使用。

糖蜜发酵培养基：糖蜜200g/L，蛋白胨10g，酵母浸出物5g，吐温-80 1mL，柠檬酸三胺2g，CH3COONa 1g，K2HPO4 2g，KH2PO4 2g，MgSO4 0.2g，FeSO4 0.01g，MnSO4 0.25g，NaCl 0.01g，CaCO3 60g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然。

该培养基为初始培养基。

1.3 药品与设备
甲醇为色谱纯，Fisher公司；实验用水为超纯水和蒸馏水；乙酸、乳酸纯度大于99%；NaH2PO4（AR）、磷酸（AR）、柠檬酸三铵（AR）、CH3COONa （AR）、MnSO4（AR）、MgSO4（AR）、KH2PO4（AR）、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等，国药集团化学试剂有限公司。

Agilent 1200高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；LE204E电子天平、FE20K pH计，Mettler Toledo 公司；上海安亭/飞鸽台式离心机；蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂LDZX-40BI型；隔水式恒温培养箱，上海一恒科技有限公司HP-900型；高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂TGL-15B型；无菌操作台，苏净集团安泰公司SW-CJ-ZFD型；恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司ZHWY-2102型。

1.4 实验方法
1.4.1 乳酸的测定
参照张振宇等[15]的方法，用乙二胺四乙酸（EDTA）络合滴定法对乳酸钙进行定量，取样10mL，5000r/mim离心5min，用移液管准确吸取2mL上清液于80mL蒸馏水中，加入1mol/L的NaOH 5mL调节体系pH，加入钙紫红素指示剂少许，用0.05mol/L的EDTA标准溶液进行络合滴定，至体系由紫红色变为纯蓝为滴定终点。

根据消耗的EDTA与Ca2+之间的定量关系，对发酵液中乳酸钙进行定量。

按照式(1)进行乳酸换算。

EDTA EDTA
2
c V
W=M
V
×
×
乳酸乳酸
样
(1)
式中，W乳酸为乳酸的质量浓度，g/L；M乳酸为乳酸的分子量，取90.08；C EDTA为EDTA标准溶液的浓度，mol/L；V EDTA为滴定消耗EDTA标准溶液的体积，mL；V样为量取发酵液样品的体积，mL。

1.4.2 发酵温度对乳酸产量的影响
以发酵培养基为基础，按5%接种量接种各实验组，每组3瓶。

在30℃、32℃、34℃、36℃、38℃不同温度下，150r/min振荡培养60h，取样测定各实验组的产酸量。

1.4.3 初始pH对乳酸产量的影响
以发酵培养基为基础，调节基质初始pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0共4组，每组3瓶。

按5%接
化工进展 2018年第37卷·4008·
种量接种培养60h，取样测定各实验组的乳酸产量。

1.4.4 Plackett-Burman实验设计
选择糖蜜（A）、酵母膏（B）、碳酸钙（C）、柠檬酸三铵（D）、氯化钾（E）、氯化铵（F）、氯化钠（G）、硫酸镁（H）、硫酸铵（J）、硫酸锰（K）、硫酸亚铁（L）、硝酸钾（M）、吐温-80（N）、乙酸钠（O）、磷酸氢二钾（P）、磷酸二氢钾（Q）、硝酸钠（R）、硝酸铵（S）、柠檬酸钠（T）等19个可能对菌株产酸有影响的培养基成分，通过Design-Expert 8.0.6软件进行N=20的Plackett-Burman实验设计，筛选出对菌株产乳酸具有显著影响的因素。

由于甘蔗糖蜜成分的非单一性，Plackett-Burman实验设计时将部分因素的低水平值选择为0。

每组均做3个平行。

系数为正值表明该因素对产乳酸有正效应，系数为负值说明该因素对产酸有负效应，系数绝对值的大小则反映出这种效应的强弱。

1.4.5 中心复合实验设计
在Plackett-Burman实验的基础上，根据响应面中心复合设计理论，确定主要影响因子的最佳组合。

如表1所示，以酵母提取物20g/L、碳酸钙100g/L、糖蜜400g/L为中心点，乳酸产量为响应值，通过Design-Expert 8.0.6软件设计3因素5水平的中心复合实验，培养基其他成分为：硫酸铵0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、硝酸钠2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、吐温-80 1g/L。

表1 中心复合设计实验因素与水平
水平A糖蜜/g·L–1B酵母膏/g·L–1C碳酸钙/g·L–1
–1.682 231.82 3.18 15.91
–1 300 10 50
0 400 20 100
1 500 30 150
1.682 568.18 36.82 184.09
2 结果与分析
2.1 发酵温度对乳酸产量的影响
在实验组温度条件下，菌株的产酸量存在差异。

实验结果如图1所示，在32℃以下，随着发酵温度的升高，菌株产酸量呈上升趋势；在32℃以上，产酸量随发酵温度的升高而下降。

推测菌株sy4为中温菌株，适宜在较低温度下进行发酵生产。

因此，选择32℃作为其最适发酵温度。

2.2 初始pH对产酸的影响
初始pH对乳酸产量的影响如图2所示，初始
图1 发酵温度对乳酸产量的影响
图2 初始pH对乳酸产量的影响
pH为5.5～7.0时培养基对乳酸产量无显著影响，实验组乳酸产量在72～75g/L之间。

因发酵培养基自然pH为6.5左右，故后续实验不调整pH。

2.3 Plackett-Burman实验
Plackett-Burman实验结果见表2，Plackett- Burman实验的回归分析见表3。

从表3可看出：糖蜜（A）、酵母膏（B）、碳酸钙（C）、硫酸镁（H）、硫酸铵（J）、硫酸锰（K）、磷酸二氢钾（Q）和硝酸钠（R）对乳酸产量有正效应，其余因素为负效应，其中酵母膏(a)、糖蜜(b)和碳酸钙(c)是影响增加乳酸产量的主要因素（P＜0.05），从而确定这3个因素为响应面实验的3个实验变量。

2.4 中心复合设计实验
中心复合设计实验设计与响应值如表4所示。

从表5回归模型的方差分析和表6二次多项式回归分析可看出，此模型P值为0.0008，表明模型在5% 的水平上是显著的；此外A、C、AC、A2、B2、C2为模型显著项。

利用Design-Expert 8.0.6软件进行回归分析，得到二阶经验模型如式(2)。

Y = –905.80+3.62A+20.64B+2.35C–0.02AB+0.0068AC–
0.0315BC–0.0045A2–0.2441B2–0.0192C2 (2)
以上模型中，Y代表乳酸钙产量，g/L；A、B、
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表2 Plackett-Burman 实验结果
培养基成分/g·L –1
乳酸产量
/g·L –1
A B C D E F G H J K L M N O P Q R S T 150 40 2 0.5 0.5 0.5 0.5
1 0.5
0.5 30.17 150 10 20 2 0.50.5 0.20.01
1 0.5
0.5 36.31 150 10 40 0.5 0.50.5 0.5 0.2
0.5
2
43.59
80 10 40 2 0.5
0.01
0.5
1 0.5
2 0.5 26.44
80 10 20 2 0.5 0.5 0.50.2
1 2 0.5 0.5 29.01 150 20 0.5 0.5 0.20.01
0.5
1 0.5
0.5 0.5 26.99 80 40 2 0.5 0.5 0.5 0.2 0.50.5 0.5 0.5 21.44 150 10 20 0.5 0.5
0.5 0.5
1 1 0.5
0.5
39.93 80 10 40 2 0.5 0.5 0.5 0.01 1 1 0.5
28.43 80 20 2 0.5 0.5 0.50.2
0.01
0.5 1 0.5
2
21.63
80 40 0.50.5 0.5 0.5
0.010.5
1 0.5 0.5 20.78 150 20
2 0.5
0.5 0.5
1 1 0.5
2 0.5
28.42
150 10 40 2 0.50.2
0.5
1 0.5
0.5 44.61
80 20 21.39 80 10 20 0.5 0.5 0.5 1 0.5
0.5
2 0.5 0.5 26.76 150 20 2 0.5 0.50.5 0.5 0.01 0.5 2 0.5 28.98 150 10 40
0.5 0.5
0.01
0.5
0.5
2 0.5
47.73
150 40 0.5 0.20.01 1 1 2 0.5 0.5 32.45 80 10 20 0.5 0.5 0.50.20.01
0.5
1 0.5
0.5 27.03 80 40 0.5
0.5 0.5
0.2
1 1 0.5
0.5
2
21.49
表3 Plackett-Burman 实验的回归分析
项目 系数估计
标准误差
P 值
常量 51.68 0.17 0.000 A 9.83 0.17 0.0109①
B 8.23 0.17 0.0130①
C 2.63 0.17 0.0406①
D –1.09 0.17 0.0977
E –0.24 0.17 0.3938
F –1.26 0.17 0.0843
G –1.59 0.17 0.0671
H 1.06 0.17 0.1005 J 1.64 0.17 0.0651 K 0.47 0.17 0.2185 L –0.86 0.17 0.1228 M –0.92 0.17 0.1152 N –0.17 0.17 0.0773 O –1.96 0.17 0.0545 P –0.50 0.17 0.2075 Q 0.017 0.17 0.9358 R 0.81 0.17 0.1307 S –0.29 0.17 0.3362 T
–0.75 0.17 0.1401
①表示重要因素。

表4 中心复合设计实验设计与响应值
序号
糖蜜
/g·L –1
酵母提取物/g·L –1
碳酸钙/g·L –1
乳酸产量/g·L –1 1 –1 1 –1
57.98
2 0 0
0 115.55
3 0 0 –1.682 19.77
4 0 0 0 106.02
5 0 0
0 117.36
6 0 1.682 0 95.5
7 7 0 0 0 118.31
8 –1.682 0 0
33.58
9 1 1 1 97.45 10 –1 –1 1 51.43 11 1 –1
1 103.39
12 0 –1.682 0 76.32 13 1.682 0 0
71.05
14 1
1
–1 41.64
15 1 –1 –1 65.71 16 –1 –1 –1 38.30 17 –1 1 1 39.31 18 0 0
0 119.43
19 0 0 1.682 74.23 20 0
0 118.83
化 工 进 展 2018年第37卷
·4010·表5 回归模型的方差分析
方差来源 总偏差
平方和
自由度 均方 F 值 P 值 模型 100600 9 11182.27 9.41 0.0008*残差 11877.97 10 1187.80 失拟项
5218.84 5 1043.77 0.78 0.6022 纯误差
6659.13 5 1331.83 总离差
112500 19 注：R 2=0.8944；Adj R 2=0.7994；Pred R 2=0.5626；信噪比8.481在5%的
水平上显著，*表示显著。

表6 二次多项式回归分析 项目 系数 标准误 P 值
模型
227.79 14.06 0.0008* A 30.62 9.33 0.0082*
B –6.28 9.33 0.5161
C 30.03 9.33 0.0092*
AB –20.88 12.19 0.1173
AC 34.04 12.19 0.0190* BC –15.77 12.19 0.2247
A 2
–44.76 9.08 0.0006*
B 2 –24.41 9.08 0.0228*
C 2 –47.98 9.08 0.0004* 注：在5%的水平上显著，*表示显著。

C 分别代表发酵培养基中糖蜜、酵母提取物、碳
酸钙的添加量，g/L 。

通过表5的回归模型方差分
析和表6的二次多项式回归分析可看出模型的P
值为0.0008，远小于0.05，表明此模型在5%的水
平上显著；失拟项为0.6022远大于0.10，表明模
型失拟项在5%的水平上不显著；A 、C 、AC 、A 2、
B 2、
C 2的P 值也均小于0.05，表明这6项在5%
的水平上具有显著性。

模型信噪比（Adeq
Precision ）为8.481，大于4，表示模型具有足够
的信号支持；R 2为89.44%，表示模型中89.44%的
数据都能用此模型来解释，回归方程的拟合优度
较好。

通过Design-Expert 8.0.6软件分析得到影响乳
酸产量的3个主要因素中两两因素的响应面分析图
见图3。

从图3(a)可看出，糖蜜浓度和酵母提取物
浓度在水平取值范围内存在乳酸发酵的最优糖蜜浓
度和最优酵母提取物浓度，说明两者的交互作用对
乳酸发酵影响显著；图3(b)中糖蜜浓度和碳酸钙浓
度对产物对乳酸发酵的交互作用显著；图3(c)中碳
酸钙浓度和酵母提取物浓度同样存在显著的交互 作用。

以Design-Expert 8.0.6软件分析实验结果，进
行综合寻优，得到3因素的最优组合如下：糖蜜
476.63g/L 、酵母提取物13.19g/L 、碳酸钙134.82g/L 。

在此基础上确定糖蜜发酵最优培养基的组成为：糖蜜476.63g/L 、酵母提取物13.19g/L 、碳酸钙134.82g/L 、硫酸铵0.5g/L 、硫酸镁0.5g/L 、硫酸锰
0.2g/L 、硝酸钠2g/L 、磷酸二氢钾0.5g/L 、吐温-80
1g/L 。

通过模型预测，在上述最优组合下的乳酸产
量为147.23g/L 。

2.5 模型的验证 为验证模型的准确性和有效性，在预测所得最
优培养基组合下进行发酵实验。

重复3次实验，获
得的乳酸产量分别为144.27g/L 、145.58g/L 、
146.74g/L ，3次实验的标准差为1.2358，平均值为
145.53g/L 。

与模型预测值较为接近，说明该模型能
较好地预测发酵终点的乳酸产量。

3 结论
本文以前期从傣家传统酸鱼制品中分离筛选
出植物乳杆菌sy4为出发菌株，首先确定了发酵温度为32℃，初始pH 为6.5左右；通过Plackett-Burman
实验考察了19种培养基成分对乳酸产量的影响，确定其中硝酸钠、硫酸镁、硫酸铵、硫酸锰、酵母提取物、磷酸二氢钾、糖蜜和碳酸钙对乳酸产量有正效应，其余因素为负效应，其中酵母提取物、糖蜜和碳酸钙是影响增加乳酸产量的主要因素（P ＜0.05）。

通过Design-Expert 8.0.6软件分析，糖蜜、酵母提取物和碳酸钙浓度两两之间存在显著交互作用。

进行回归分析，得到二阶经验模型为：Y = –905.80 +3.62A +20.64B +2.35C –0.02AB +0.0068AC –0.0315BC –0.0045A 2 –0.2441B 2 –0.0192C 2，进行综合寻优，得到3因素的最优组合如下：糖蜜476.63g/L 、酵母提取物13.19g/L 、碳酸钙134.82g/L 。

确定糖蜜发酵最优培养基的组成为：糖蜜476.63g/L 、酵母提取物13.19g/L 、碳酸钙134.82g/L 、硫酸铵0.5g/L 、硫酸镁0.5g/L 、硫酸锰0.2g/L 、硝酸钠2g/L 、磷酸二氢钾0.5g/L 、吐温-80 1g/L 。

在上述最优组合下模型预测乳酸产量为147.23g/L ，模型验证乳酸产量为145.53g/L ，说明该模型能较好地预测发酵终点的乳酸产量。

本工作以甘蔗糖蜜为原料，在不经前处理情况下进行乳酸发酵，经60h 发酵，乳酸产量可达
(145.53±1.24)g/L ，为进一步利用甘蔗糖蜜进行乳酸生产提供了技术支持。

第10期 杜刚等：乳酸菌发酵甘蔗糖蜜产乳酸的培养条件优化 ·4011
·
图3 不同因素组合对乳酸钙产量的等高线和响应面图
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