产壳聚糖酶海洋真菌鉴定、寡营养培养基优化及廉价培养基研究

产壳聚糖酶海洋真菌鉴定、寡营养培养基优化及廉价培养基研
究
朱利平;黄惠莉
【摘要】A chitosanase-producing marine strain was isolated by our laboratory. Identification by rDNA - ITS sequence analysis, and it is Penicillium oxalicum. This is the first time that Penicillium oxalicum＇ s the ability of producing chitosanase is reported. For the purpose of fermentation chitosanase in industrial, we studied oligotrophic medium components, such as source of carbon, nitrogen source, saltresistance, acidresistance and rotary speed. We explored different kinds of cheap medium for production of chitosanase. We found the soybean powder was the best, and the medium of soybean powder was as follow （g/L seawater）： soybean powder 25 g, and the optimal enzyme activity was 8.5 U/mL. This medium was insufficient 5% of the cost of original. It provided direct theory and experiment foundation on industrialized production of chitosanase.%对筛选出的产壳聚糖酶海洋真菌进行了rDNA—ITS序列分析技术鉴定，确定该菌为Penicillium oxalitun，这是首次报道该菌属具有产壳聚糖酶的能力。

该研究旨在为工业化发酵生产壳聚糖酶提供实验指导。

实验在已确定的寡营养培养基的基础上，探讨适宜碳源、氮源、耐盐性、耐酸性、摇床转速等发酵因素对产壳聚糖酶的影响，并探索不同种类的廉价培养基发酵产酶。

结果显示黄豆粉培养基的产酶效果较为理想，最终确定培养基为（g／L海水）：黄豆粉25g，酶活力最高为8．5U／mL，该培养基成本不足原发酵培养基成本的5％，为
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2011(037)005
【总页数】5页(P35-39)
【关键词】Penicillium;oxalicum;壳聚糖酶;寡营养海水培养基;廉价培养基
【作者】朱利平;黄惠莉
【作者单位】华侨大学化工学院,福建厦门361021;华侨大学化工学院,福建厦门361021
【正文语种】中文
【中图分类】TQ923
壳寡糖(chitosan oligosaccharide/chitooligosaccharide，COS)，又称低聚葡糖胺、低聚氨基葡萄糖等，是壳聚糖的降解产物，是目前仅知的唯一的碱性寡糖，具有独特的生物活性［1］。

由于壳寡糖与生物体细胞具有良好的生物兼容性，无毒性、环境友好型、易被生物体分解等许多特殊的理化性质，被广泛地应用于多个领域。

尤其是在医药和食品方面，壳寡糖具有提高食品质量和人体健康的重要功效［2－3］。

现阶段制备壳寡糖的方式主要有物理降解法、化学降解法和生物降解法(主要指酶法降解壳聚糖)。

酶解法自20世纪80年代出现以来，得到了广泛的重视，相对其他2种降解方法，酶降解法可特异性、选择性地切断壳聚糖的β-(1，4)糖苷键，降解过程和产物质量分布易于控制，且不造成环境的污染。

壳聚糖酶(Chitosanase，EC3.2.1.99)是1973年Monaghan等［4］在研究水解酶降解病原性真菌的细胞壁时首先提出来的，它是一种对线性壳聚糖具有分解作用
的专一性酶，主要存在于真菌和细菌的细胞中，包括细菌、放线菌、真菌、病毒等，另外在一些植物的叶子、种子和果实中也存在。

本研究对自筛的产壳聚糖酶的海洋青霉菌进行了分类鉴定和发酵条件的优化，发现利用加入研磨后黄豆粉(40目过筛)的海水培养基作为发酵培养基可达到较好的产
壳聚糖酶效果，该培养基成本不足原发酵培养基的5%，该研究为工业生产成本提供可能，为微生物工业化转化壳聚糖提供理论基础和实验依据。

1.1 材料
壳聚糖:脱乙酰度≥90.0%，SCRC国药集团化学试剂有限公司;低聚糖(工业级壳寡糖):分子量低于3 000，青岛弘海生物技术有限公司。

其它试剂均为国产分析纯;海水(取自厦门集美浔江海域)。

海洋青霉菌:本实验室自筛得到。

寡营养培养基(g/L):蛋白胨9 g，葡萄糖10 g，低聚糖10 g，pH7.2，盐度5%的海水。

1.2 实验方法
1.2.1 菌株的rDNA-ITS序列分析鉴定
菌种rDNA-ITS序列由生工生物(上海)有限公司进行测定，UNIQ-10柱式真菌基
因组抽提试剂盒进行提取菌株的基因组，得到的DNA溶液进行基因组电泳分析，PCR反应引物的设计:ITS1:5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG
3';ITS4:5'TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'。

PCR程序设定:预变性98℃ 5 mim;循环95℃ 35 s，55℃ 35 s，72℃ 40 s，35个循环，延伸8 min。

1%的琼脂糖凝
胶电泳检测PCR产物，紫外灯下切割含所需 DNA片段的凝胶条，利用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行回收。

对获取的DNA片段进行测序，既得产壳聚糖酶菌株的rDNA-ITS序列。

将获得的rDNA-ITS序列提交到网站(*****************)进行注册、
获得 GenBank登录号，测序结果在NCBI中进行nucleotide blast，鉴定所筛产
壳聚糖酶菌株的种属。

1.2.2 寡营养培养基的产酶研究
产酶变化和pH变化:结合以往实验室研究，利用本实验选定的海水寡营养培养基
进行产壳聚糖酶发酵研究，测定发酵过程中的酶活力变化和发酵液pH值变化。

1.2.3 发酵培养基碳源、氮源对产酶的影响
适宜碳源的选择:分别使用甘露糖、壳聚糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖、半乳糖、乳糖
和D-氨基葡萄糖作为寡营养培养基中的碳源进行发酵产酶，以产酶最高的酶活作
为基准(相对酶活力为100%)，确定发酵产壳聚糖酶的最适碳源。

适宜氮源的选择:分别使用尿素、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、蛋白胨、牛
肉膏、胰蛋白胨和大豆蛋白胨作为寡营养培养基中的氮源进行发酵产酶，以产酶最高的酶活作为基准(相对酶活力为100%)，确定发酵产壳聚糖酶的最适氮源。

1.2.4 发酵参数对发酵产酶的影响
1.2.4.1 菌株耐酸性、耐盐性发酵实验
分别调节发酵培养基的起始 pH值为2、3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10 和 11，进行发酵产酶，并测定酶活。

配制不同盐度(1%、2%、3%、4%、5%、7%、10%、14%)的海水，进行发酵产酶，并测定酶活。

考查不同盐度的海
水对菌株产酶的影响。

1.2.4.2 摇床转速对寡营养培养基
不同转速培养对寡营养培养基产壳聚糖酶的影响:接种后的寡营养培养基置于不同
的转速(100 r/min、120 r/min、150 r/min 和180 r/min)下发酵产酶，每隔24
h取样进行壳聚糖酶活力测定。

1.2.5 廉价培养基配方的确定
为了降低发酵产酶成本以适应于工业化生产，尝试多种廉价培养基的原料，研磨
40目过筛后，加入海水中进行寡营养发酵，并对发酵产酶效果进行了测定。

1.2.5.1 廉价培养基的寻找及黄豆粉剂量对发酵产酶的影响
选取黄豆、小麦、地瓜、玉米、食用过的甘蔗渣、生粉、糯米等研磨后40目过筛，各自作为单一营养源发酵产酶，并且以黄豆和牛肉膏作为氮源分别与其他营养成分混合发酵产酶，对比产酶结果，考查不同廉价营养物质对产酶的影响。

海水中分别添加不同剂量的黄豆粉发酵产酶，考查不同黄豆粉添加量对发酵产酶的影响。

1.2.5.2 摇床转速对黄豆培养基发酵产酶的影响
由于摇床转速对菌体的生长具有很大的影响，为使实验结果更加准确，测定不同摇床转速对黄豆培养酶活变化的影响。

不同转速培养对黄豆培养基产壳聚糖酶的影响:接种后的黄豆培养基置于不同的转速(100 r/min、120 r/min、150 r/min 和 180 r/min)下发酵产酶，每隔24 h取样进行壳聚糖酶活力测定。

1.2.6 壳聚糖酶活力测定方法
酶活力测定方法采用DNS:取发酵粗酶液2 mL与壳聚糖底物2 mL混合，50℃下
保温10 min，调节混合液的pH值大于8.0，离心去除絮状沉淀。

取上清液1 mL，用DNS法测定还原糖含量。

酶活力单位定义为:上述条件下每分钟产生1 μmol还原糖所需酶量(U)。

2.1 菌种鉴定结果
收集PCR产物的电泳凝胶，提取PCR产物，测定其序列。

将获得rDNA-ITS序列提交到网站(****************)进行注册，获得GenBank登录号为
HQ424879，测序结果在NCBI中进行nucleotide blast，该菌株为Penicillium oxalicum，命名为Penicillium oxalicum PCS-7，并与GenBank中序列相似性
接近的菌株进行比较，用Clustalxl 1.82对所选序列进行比对，构建N-J系统进化树如图1所示。

这是首次发现该菌具有产壳聚糖酶的能力。

以往有报道青霉［6－7］产壳聚糖酶，
但是没有关于Penicillium oxalicum产壳聚糖酶的报道。

Penicillium oxalicum
的产酶报道多集中于果胶酶和纤维素酶二糖水解酶等方面，至今没有发现其具有产壳聚糖酶的能力，所以对该菌的综合应用及其降解产物［8］研究有待进一步的探讨。

2.2 寡营养培养基产酶变化和pH值变化结果
结合菌体产酶和发酵液pH变化曲线分析，发现随着产酶量的增加，发酵液的pH 值呈下降趋势，当产酶达到最大时，发酵液的pH值也降到最低，说明在菌体产酶的过程中还向外界环境中分泌酸性物质(与rDNA-ITS序列菌种鉴定结果相符)，可能具有提高环境中壳聚糖的溶解性、抑制周围微生物生长、以及维持酶稳定性的作用。

2.3 碳源、氮源对产酶的影响
2.3.1 不同碳源的影响
在含有不同类型的碳源(1%)的寡营养培养基上，于25℃、120 r/min进行发酵产酶实验，实验结果如图2所示。

由图2可知，不同碳源对发酵产酶的酶活大小的
影响顺序为:淀粉﹥氨基葡糖糖﹥葡萄糖﹥蔗糖﹥乳糖﹥甘露糖﹥半乳糖﹥壳聚糖。

2.3.2 不同氮源及碳氮比对发酵产酶的影响
在含有不同类型的氮源(1%)的寡营养培养基上，于25℃、120 r/min进行发酵产酶实验，实验结果如图3所示。

由图3可知，不同氮源对发酵产酶的酶活大小的
影响顺序为:胰蛋白胨﹥牛肉膏﹥蛋白胨﹥大豆蛋白胨﹥硝酸铵﹥氯化铵﹥尿素﹥
硫酸铵。

这说明该菌可以较好地利用有机氮源，但是对无机氮源的利用较差。

2.4 发酵参数对产酶的影响
2.4.1 菌株耐酸性发酵实验
发酵产酶的过程中菌体分泌一些酸性物质，这可能有2种作用:一是抑制其他微生
物的生长，二是稳定酶的性质。

考察不同pH值培养基对菌株的生长和产酶影响，
确定菌株的耐酸性能力，实验结果如图4所示。

由图4可知，菌株在发酵培养的
起始pH＜6的情况下产酶效果很好，相对酶活力都达到了80%以上，即使在起始pH为2的强酸性环境下，菌体的生长良好，没有产酶下降的趋势，即该菌具有超强的耐酸能力。

2.4.2 菌株耐盐性实验
为考察菌株在不同盐度海水中产酶发酵，确定菌株发酵对盐度的耐受性，利用不同盐度的海水发酵产酶，实验结果如图5所示。

由图5可知，在盐度0%～5%发酵
产酶，壳聚糖酶相对酶活力保持在80%以上，当盐度超过5%后，壳聚糖酶相对
酶活力就随着盐度的增加而下降。

结合上述分析，该菌体可以适应普通海水(约
3.5%)的发酵，即发酵所用海水不需做盐度的调整，可以直接作为发酵原料加以利用，这样就节省了该菌生长过程中所必需的有机与无机微量元素的营养成分，同时也可以节省发酵所需的淡水资源，降低发酵成本。

2.5 廉价培养基的探索结果
为进一步的降低培养基成本，与工业化生产壳聚糖酶接轨，利用多种廉价原料进行产壳聚糖酶菌株发酵的研究。

选取黄豆、小麦、地瓜、玉米、食用过的甘蔗渣、生粉、糯米等研磨后40目过筛，各自作为单一营养源发酵，并且以黄豆和牛肉膏作为氮源分别与其他营养成分混合发酵，利用海水配制不同营养物质的培养基(1%)，发酵产酶。

分析酶活力测定结果可知，当培养基中只有黄豆粉配制的海水培养基具有较好的产酶活力，酶活为4.6 U/mL。

黄豆和甘蔗、牛肉膏和地瓜为培养基的混合发酵，酶活分别为4.4 U/mL和4.2U/mL与单一黄豆粉发酵产酶的酶活差异不大，考虑培养基成本问题，选取黄豆粉作为最终的寡营养培养基原料。

为降低成本实现工业生产提供了有利的实验基础。

不同黄豆粉添加量对发酵产酶的影响结果:为进一步确定黄豆粉对发酵产酶的影响，海水中分别添加不同剂量的黄豆粉发酵产酶，实验结果见图6。

由图6可知，向海
水中添加0.2%的黄豆粉相对酶活力就可以达到70%左右;添加量达到1.4%时，菌体产酶趋于稳定，添加量大于1.4%的培养基产酶活力都稳定在90%以上，相对酶活力最高的添加量为2.5%。

该培养基的成本不足原发酵培养基的5%，大大降低
了壳聚糖酶产生菌培养基的成本。

2.6 摇床转速对寡营养培养基和黄豆培养基发酵产酶的影响及比较
不同的摇床转速对培养基中的溶氧量造成一定的影响，直接影响菌体的生长周期，所以采用跟踪监测的方法对2种培养基的在不同转速下发酵产酶进行了测定和对比。

优化好的寡营养培养基在不同转速下发酵实验结果如图7所示。

由图7可知，发
酵的前6 d，随着转速的增加酶活力呈现增加趋势，180 r/min的酶活力最高达
6.6 U/mL左右，且150 r/min和180 r/min的产酶周期都提前至5～6 d，比原
培养基转速(120 r/min)有明显的提前，这说明溶氧量的增加可以促进菌体产酶量
的增加。

黄豆培养在不同转速下发酵实验结果如图8所示。

由图8可知，黄豆培养基不同
转速实验与寡营养培养基的转速实验呈现的趋势略有区别，且总体产酶量更高。

图中150 r/min和180 r/min之间的酶活力变化曲线差异较小，摇床转速为150
r/min发酵时，酶活力最大值在第4天出现，比原发酵培养基的发酵时间提前了3天，酶活力最大值为8.5 U/mL左右，约是原发酵培养基的5倍。

通过对发酵液参数的测定结果、寡营养培养基的探索和研究，以及廉价培养基的寻找和探究，得出以下结论:
(1)通过rDNA-ITS序列分析技术，鉴定本研究筛选出的产壳聚糖酶的菌株为Penicillium oxalicum。

首次报道该菌具有产壳聚糖酶的能力。

并且菌株在产壳聚糖酶的过程分泌酸性物质且具有较强的耐酸性，这可能是菌体本身的自我保护机制，通过发酵过程中pH值的变化抑制其他微生物的生长、增加环境中壳聚糖的溶解度。

(2)首次研究利用海水作为发酵产壳聚糖酶的培养基成分，发现该菌产酶所需的部分微量营养成分可以使用一般海水直接代替，这样一方面可以减少发酵培养基的调配环节，另一方面可节约发酵所用的淡水资源。

(3)通过对多种廉价原料进行发酵产酶实验，确定发酵产壳聚糖酶的适宜廉价培养基成分(g/L):黄豆粉25 g，海水1 L。

这也是首次报道可以单一利用黄豆粉海水培养基进行发酵产壳聚糖酶，该培养基的成本不足原发酵培养基的5%，大大降低的壳聚糖酶产生菌培养基的成本。

(4)利用黄豆培养基发酵产酶，达到最高酶活力的发酵时间比原发酵培养基的发酵时间提前了3 d，在第4天时酶活力达到最大，最大值为8.5 U/mL。

后续菌株自身的改良［9］或利用基因工程的手段克隆该菌株产壳聚糖酶的基因［10］，进一步促进菌株产酶的研究有待深入研究。

【相关文献】
［1］ Xia Wenshui，Liu Ping，Zhang Jiali，et al.Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides［J］.Food Hydrocolloids，2011，25(2):170－179.
［2］ Na Young Yoon，Dai-Nghiep Ngo，Se-Kwon Kim.Acetylcholinesterase inhibitory activity of novel chitooligosaccharide derivatives［J］.Carbohydrate Polymers，2009，
78(4):869－872.
［3］ Dou Jiangli，Xu Qingsong，Tan Chengyu，et al.Effects of chitosan oligosaccharides on neutrophils from glycogen-induced peritonitis mice model［J］.Carbohydrate Polymers，2009，75(1):119－124.
［4］ Richard L Monaghan，Douglas E Eveleigh，Ram P Tewari，et al.Chitosanase，a Novel Enzyme［J］.Nature New Biology，1973，245(142):78－801.
［5］张惟杰.糖复合物生化研究技术［M］.(第二版).杭州:浙江大学出版社，1999:10－11. ［6］Andrea Rodríguez-Martín，Raquel Acosta，Susan Liddell，et al.Characterization of the novel antifungal chitosanase PgChP and the encoding gene from Penicillium chrysogenum［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2010，88(2):519－528. ［7］ Dennis M.Fenton，Douglas E.Eveleigh.Purification and Mode of Action of a Chitosanase from Penicillium islandicum ［J］.Journal of General Microbiology，198l，
126:151－165.
［8］陈小娥，夏文水，余晓斌.壳聚糖酶高产菌株的筛选及酶解产物的定性［J］.食品与发酵工业，2004，30(2):57－61.
［9］陈小娥，夏文水，余晓斌.壳聚糖酶高产菌株选育及发酵条件研究［J］.食品与发酵工业，2004，30(3):66－69.
［10］刘怀伟，鲍晓明.腐皮镰孢菌壳聚糖酶的酶学性质研究及其在酿酒酵母工业菌株中的表达［J］.微生物学报，2009，49(12):1607－1612.。