siRNA介导的ADAM17基因沉默对前列癌PC3细胞增殖和凋亡的影响

文章编号：1007 — 4287(2020)07—1183 —04
siRNA介导的ADAM17基因沉默对
前列癌PC3细胞增殖和凋亡的影响
李雪，冯树强，李然伟*，田文杰，姜爽，杨贺
(吉林大学第二医院泌尿外科，吉林长春130041)
摘要：目的探究R N A干扰靶向沉默ADAM17基因对前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的影响。

方法构建针对ADAM17的小干扰RNA(siRNA)表达质粒PGC-siADAM17,脂质法稳定转染PC3细胞，采用逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR)检测转染细胞ADAM17 m R N A的基因表达，唾唑蓝（M T T)法测定瘤细胞增值率，原位未端标记(TUNEL)法检测瘤细胞凋亡率，流式细胞术（FCM)检测瘤细胞周期比例。

结果 PGC-si ADAM17使PC3细胞AD-AM17蛋白分泌水平下调，对PC3细胞增殖的抑制率为53. 6%，对细胞凋亡率为12. 7%，同时使GO/G1期细胞增多，S期细胞减少。

上述所有统计数据分别与相应的对照组比较，差异均有统计学意义（P<0. 05)。

结论 ADAM17- si R N A表达质粒可抑制前列腺癌细胞增殖并促进其凋亡，ADAM17有望成为提高前列腺癌靶向治疗的新基因。

关键词：前列腺癌；ADAM17基因；R N A干扰
中图分类号：R737.25 文献标识码：A
Effect of siRNA mediated ADAM 17 gene silencing on proliferation and apoptosis of PC3 cells LI Xue,FEN G Shu-qiang A A Ran-wei yet a l.{Department o f Urology^the Second Hospital o f Jilin University^Changchun 130041 ,C/z/72a) Abstract ：Objective To investigate the effect of RNA interference targeting ADAM17 gene silencing on the prolif­eration and apoptosis of prostate cancer PC3 cells.Methods a small interfering RNA (siRNA)expression plasmid PGC siadaml7 was constructed for ADAM17. PC3 cells were stably transfected by lipid method.The expression of ADAM17 mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PC R)，the increment rate of tumor cells by M TT,apoptosis rate by TUNEL,and cell cycle ratio of tumor cells by FCM.Results PGC si ADAM17 down regulated ADAM17 protein secretion in PC3 cells,the inhibition rate on proliferation of PC3 cells was 53. 6%,the apoptosis rate was 12. 7%.All the above statistical data were compared with the corresponding control group,the difference was sta­tistically significant (P<C0. 05). Conclusion ADAM17 siRNA expression plasmid can inhibit the proliferation and pro­mote the apoptosis of prostate cancer cells.ADAM17 is expected to be a new gene for targeted therapy of prostate cancer.
Key words：prostate cancer；ADAM17 gene；RNA interference
{C h i n]L a b2020,24：1183)
据流行病学资料统计，前列腺癌（prostate c a n c­e r,P C a)是危及男性健康的主要疾病 ，尤其是西方国 家男性发病率最高的恶性肿瘤，死亡率仅次于肺癌[1]。

近年来随着人口老龄化到来和高龄人群增多，我国P C a的发病率和死亡率也呈逐年上升趋势[2]。

早期肿瘤可以通过外科手术、放射治疗达到 临床治愈，但晚期肿瘤则需要采用激素治疗。

去势 治疗虽然有效，然而绝大多数患者在治疗过程中因转归为雄激素非依赖性而最终需要化疗，但副作用 大且疗效差m。

因此人们开始探索新的分子耙向用 药的基因治疗。

随者研究的深人，发现A D A M17
基金项目：吉林省科学技术厅申报择优支持项目（编号=2019110 2012YY)的异常表达与P C a细胞增殖和侵袭等生物学功能和效应密切相关，在P C a的发生发展和转移的全过程中扮演着极其重要的角色，也发挥着十分关键的作用[4<5]。

鉴子R N A干扰技木被普遍认为能从源头上使某些致癌基因“沉默”，从而抑制肿瘤细胞增殖及转移[6]。

故我们应用R N A干扰（R N A i)技术，设计针对A D A M17-s i R N A表达载体，转染P C3细 胞后观察A D A M17在P C a中表达的变化，并探讨 其变化对P C3细胞增殖和凋亡的影响，旨在为提高 临床P C a的治疗水平提供实验依据和新的思路。

1材料和方法
1.1 主要材料人前列腺癌P C3细胞株购自
A T C C公司，P G C s i-U6/N e o/G F P购于上海吉凯基因化学公司，T r lz〇l试剂为G i b c o公司产品，限制
*通讯作者
性内切酶和工具酶购于大连T a k a r a公司，R P-
M I1640培养基，，小牛血清为H g c l o n e公司产品，
转染试剂 L i p o f e t a m i n e T M2000 购于 Invitrogen公
司，G418购于S i g m a公司，A D A M17定量检测试剂
盒购于晶美公司，流式细胞仪（F C M)购自美国C l o-
m e c h公司，噻唑蓝（M T T)购自上海吉凯基因化学
公司，原位未端标记（T U N E L)细胞凋亡检测试剂
盒购自北京中山生物公司。

1.2 实验方法
① s h R N A设计和质粒构建：根据s h R N A设计 原理，设计针对A D A M17 s i R N A表达质粒，，另设
计一个不含持异性的A D A M17序列的P G C-C O N T
作为对照（以下称阴性对照组）。

序列编号为：A D-
A M17 意义链 S'-G A T C C A A T G G A T G T C T A T C A-
T T C A A G A G A T G A T A G A C A T C C A T G A A C T T T-
T T T T G G A A A;反义链 5:A G C T T T T C C A A A A A-
A A G T T C A T G G A T G T C T A T C A T C T C T T G A A T-
G A T A G A C A T C C A T G A A C T G。

P G C-C O N T意义链
S'-G A T C C A A T G G A T G T C T A T C A T T C A A G A G-
A T G A T A G A C A T C C A T G A A C T T T T T T T G G A-
A A;反义链5A G C T T T T C C A A A A A A A G T-
T C A T G G A T G T C T A T C A T C T C T T G A A T G A T A-
G A C A T C C A T G A A C T G。

将互补的意义链和反义链分别引入H a m h I和
H i n d f f l酶切位点，每对单链寡核苷酸片段等量混
匀，91°C变性6 m i n后，75X：退火12 m i n实时与
H a m h I 和 Hindfll双酶切线的 P G C s i-U6/N e o/G F P
质粒链接，连接产物分别命名为P G C-s i A D A M17,
P G C-C O N T。

连接产物常规转化大肠杆菌D H5a
感受态细胞，测序正确后提取质粒转染P C3细胞。

② P C3细胞培养及转染：P C3细胞培养于含10%小牛血清的不含抗生素的R P M1640培养液
中.在37"C，5%C02培养箱中培养至对数生长期
时.按L i p o f e t a m i n e t m2000使用说明书要求程序转
染，转染细胞在500 m g/L的G418压力下筛选阳性
克隆。

③ R T-P C R检测P C3细胞A D A M17的表达；提取P C3细胞总R N A，R T-P C R扩增A D A M17片
段，以p-c a c t i n作为内参。

A D A M17引物：上游引
物 5’-C A G A A G G A G G A G G G C A G A A H，下游
弓丨物 5’-T G G C C T T G G T G A G G T T T G A T-3、扩
增片段256 b p。

P C R产物经2%琼芝糖凝胶电泳分
离，于紫外灯下拍照。

④ M T T法检测P C3细胞增殖率：取对数生长
期的各组细胞接种于96孔培养板，每组3复孔，每
孔细胞数为1X105个，37’C培养48 h后变换培养
液，继续培养72 h,每孔分别加人M T T20 juI，37'C
孵育4 h，轻轻吸去上清，加入100 ul D M S0,37°C振
荡降解25 m i n后，检测A590值，结果取3孔平均
值。

⑤ T U N E L法测定P C3细胞凋亡率：在胰酶消 化后的各组细胞悬液中滴加T U N E L反应液37X：
湿盒卵育2 h，P B S洗涤3次，滴加过氧化物酶标记
的抗地高辛抗体37€湿盒卵育25 m i n。

D A B显
色，苏木精复染。

以P B S代替T U N E L反应液作为
阴性对照。

阳性对照切片经D N A酶I预处理8
m i n后按T U N E L法步骤进行染色。

结果判定：凋
亡细胞的胞核呈棕黄色，每张切片观察5个视野，每
个视野计数200个细胞，计算凋亡细胞所占的百分
率（凋亡率）。

⑥ F C M检测P C3细胞周期变化：分别收集上述3组细胞，每组I X106个，胰酶消化制成单细胞
悬液，冰P B S洗涤3次后逐滴缓慢加人一2C T C预冷
的70%乙醇中，4C固定36 h，P B S洗涤去除固定
液，加人核糖核苷酸A重悬细胞，避光染色3 h。

F C M检测各组P C3细胞的周期分布清况。

实验重
复3次，用M P I A S-500多媒体彩色病理图文分折系
统对阳性细胞着色的平均灰度进行定量分析结果。

1.3统计学分析采用S P S S11. 5统计软件对数
据进行处理，所有实验数据均采用均数士标准差表
示，以P<0. 05为差异有统计学意义，P>0. 05为
差异无统计学意义。

2 结果
2.1 P G C-s i A D A M17表达载体的鉴定及筛选对
2个重组质粒进行测序，结果与所设计的A D A M17
s i R N A寡核苷酸序列一致，证明P G C-s i A D A M17
及P G C-C O N T重组质粒构建成功。

采用脂质体法
将重组质粒和对照质粒分别转染P C3细胞，经
G418筛选，35 d后获得阳性细胞克隆。

2.2 A D A M17-s i R N A 对 P C3 细胞 A D A M17 表达
的影响各转染组细胞A D A M17 m R N A表达结果
如图1所示，A图为R T-P C R产物电泳结果，B图为
所得的比值。

与未转染组比较：载体组的A D A M17
m R N A表达水平下调。

这表明A D A M17 s i R N A
抑制了 P C3细胞A D A M17的表达，发挥了特异的
R N A i作用。

2.3 M T T法检测结果若将未转染组细胞增殖设
bp
2 000
1 000
750 500 250
0-actir
A D A M 17
定为100%，则P G C -C O N T 及P G C -si A
D A M
17增
C O N T 的阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P
殖率分别为91. 7%和53. 6%，与空质粒P G C -
<0.05,图2)。

阴性对照组载体转染组
图1
稳定转染细胞ADAM 17的RT -P C R 结果
A:RT-PCR 电泳图（M:marker;l :载体转染组；2:阴性对照组；3:未转染组 B:光密度扫描ADAM17/p-actin 表达水平比值
*与阴性对照组相比，PCO. 01
载体转染组阴性对照组
未转染组
53.6%
I 95.2%
100%
A(590 mm)
图2 M T T 法检测瘤细胞增殖率*与阴性对照组相比，PCO.Ol
2.4
F C M 测定结果未转染组，阴性对照组和 A D A M
17 s i R N A 组
G
0/G 1期细胞所占的比例分另I J
为 46. 9±0. 9%、48. 5±1. 5% 和 59. 8±1. 4%，与对 照比较，A
D A M
17si R
N A
组中G 0/G 1期细胞所占比
例明显增加，S 期细胞显著减少（P <0. 05,表1)。

2.5 TUNEL 法检测结果未转染组，阴性对照组
和载体转染组的瘤细胞凋亡率分别为1. 3%、2. 8% 和12. 7%，组间比较差异具有显著统计学意义（P <
0.01，图 3),
表1 F C M 检测瘤细胞G 0/G 1期和S 期细胞比例
不同期的细胞比例（％)
Go/G ,期S 期
G2/M 期未转染组46. 9士0. 9
29. 6士 1. 223. 5 土 0. 6
阴性对照组48. 5 士 1.527. 6士 1.623. 9±2. 2载体转染组
59.8 士 1.4*
18. 9士0.8*
21. 3 土 0.5
注：与阴性对照组比较，•■?<0. 01
A=3.8%
未转染组
0.0.0.0.0.0
.
J n
运
-Ca
/Z T K V O V
图3 T U N E L
法检测瘤细胞凋亡率
3讨论
P C a是一个多因素、多坏节、多阶段的复杂疾病，R N A i技术本身则可以针对多个基因或者基因
族的共有序列来抑制多个基因的表达，从而诱导肿 瘤细胞调亡、抑制肿瘤生长[7]。

本研究应用R N A 干扰技术，针对A D A M17设计了 A D A M17 s i R N A 表达质粒，结果发现其在体外对前列腺癌P C3细胞 具有抑制生长并促进凋亡的作用。

到目前为止的研 究普遍认为，A D A M17在包括P C a在内的人体多种 恶性肿瘤中表达阳性，尤其在P C a中高表达，其表 达水平不但与肿瘤的发生发展有关，而且还和远处 转移以及患者的生存期缩短有关，是一个预后不良和术后复发风险高的指标，它已成为目前研究的热点癌基因[8_9]。

本实验通过A D A M17 s i R N A沉默 A D A M17达到了较好的抑制前列腺癌P C3细胞增 殖和促进其凋亡的效果。

实验数据结果显示，P G C-s i A D A M17的载体转染组对癌细胞抑制率为53. 6%，凋亡率为12. 7%，而且是癌细胞大多停滞在G O/G I期，不能向成熟癌细胞迁移、分化。

这是 我们初步认为以R N A于扰为基础的靶向A D A M17 的基因治疗极有可能是提高前列腺癌疗效的新的有 效方法之一。

但由于令人鼓舞的本研究成果只是在 单细胞水平上取得的，因而其更确切的实用临床意义还有待动物实验和临床试验的进一步验证，本课 题组成员将在此基础上进行更深人的后续研究。

希 望通过对A D A M17的研究，能够为明确和厘清肿瘤发生、发展和转移的机制带来一定帮助，从而提高前 列腺癌患者的临床疗效和治疗水平。

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(收稿日期=2020 —05—16)。