现代分子生物学课件-第六章

6.1 基因表达研究技术
6.1.1 基因表达系列分析技术
基因表达系列分析技术（ SAGE ）是一种 以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达 模式的技术。
SAGE的操作过程如下图或书中图6-1所示。
mRNA
生物素酰化的Oligo-dT引导合成 cDNA双链 AAAAAA TTTTTT 锚定酶（设为Nla)酶切，磁珠吸附 AAAAAA TTTTTT 分成两池，加入接头A，B AAAAAA TTTTTT AAAAAA TTTTTT 标签酶酶切，释放标签，末端补平 CATG GTAC 平端连接

特点：可识别稳定结合于DN码基因。

原理：
将已知的特定顺式作用元件构建到带 有报告基因最基本启动子 (pmin) 的上游， 然后编码待测转录因子 cDNA 与已知酵母 转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵 母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用 元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报 告基因得到表达。
若把某一生物体内全部基因分别点到 DNA 微 列阵或者基因芯片上，再用不同发育阶段的 cDNA与之杂交，就能了解某些基因对特定生 长发育阶段的重要性。
基因芯片还可用于进行基因诊 断。先建立正常人特定组织、器官 的基因芯片，给出标准杂交信号图， 用可疑病人的 cDNA 做探针与之杂 交，检哪些基因的表达受抑制或激 活。
CATG GTAC CATG GTAC CATG GTAC CATG GTAC CATG GTAC CATG
A B
A
B
A
CATG GTAC
B PCR扩增，锚定酶酶切
GTAC 连接，形成多联体 CATG GTAC 克隆，测序
CATG GTAC
计算机数据分析
6.1.2 RNA的选择性剪接技术
RNA选择性剪接是指用不同的剪接方式从一 个mRNA前体产生不同的mRNA剪接体的过程。
图6-15 酵母单杂交的基因原理示意图
6.3.2 酵母双杂交系统
酵母双杂技术主要用于研究蛋白质之间的 相互作用。 酵母双杂系统利用了真核生物转录调控因 子的组件式结构特征：DNA结合结构域；转录 激活结构域。
酵母双杂原理示意图：图6-17。
选择性剪接一般分为：平衡剪接，5’ 选择性剪接， 3’选项择性剪接，外显子遗漏和相互排斥性剪接。 如6-2。
发现新的可变剪接体（ splice variant），确 定每个异构体（isoform）的独特功能和生物学意 义并阐明其调节机制，是功能基因组时代的一个 重要特征。
BTLAs（BTLA splice variant）
6.3.5 RNAi技术及其应用
RNAi（RNA interference ，RNA干扰）技术： 利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源 mRNA从而阻断靶基因的表达，使细胞胞出现 靶基因缺失的表型。 dsRNA ：双链 RNA ； siRNA ： short interfering RNA，小分子干扰RNA。 RNAi作用机制示意图：图6－24。
图6-24 RNAi作用机制图解
6.4 基因芯片及数据分析
基因芯片（ gene chip ）或又称为 DNA 微列阵 （DNA microarray）技术：能够同时监测大量 靶基因表达的实验手段，迅速准确地在基因组 水平上阐棕不同生物组织或细胞中各种转录本 的变化规律。
用机械手把已知或未知的 DNA 片段点到玻片 或其它载体上并使之固定，用不同细胞周期 发育阶段的cDNA作探针系统性地研究细胞中 任何时期特异表达的基因。
6.3.1 酵母单杂交系统(yeast one-hybrid system) 20世纪90年代发展，用于研究蛋白质—DNA相 互作用。在酵母细胞内研究真核生

用途：研究DNA-蛋白质之间的相互作用， 筛选转录调控因子。
图6-17 酵母双杂交技术原理示意图
6.3.3 体外蛋白质相互作用技术
1、Far Western 印迹技术 2、GST融合蛋白沉淀技术 3、蛋白质芯片技术 4、等离子表面共振技术
5、免疫共沉淀技术
6.3.4 细胞内蛋白质相互作用技术 ——FRET技术
将蛋白质标上荧光探针，当蛋白质间不发 生相互作用时，其相对距离较大，无荧光共振 能量转移（ FRET ）现象；而蛋白质发生相互 作用时，其相对距离缩小，FRET发生(图6-23 )。
荧光原位杂交（FISH）
荧 光 原 位 杂 交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放 射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非 放射性分子细胞遗传技术。FISH的基本原理是 首先对寡核苷酸探针进行特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或 DNA上特定的 序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克 隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
6.1.4 基因定点突变技术
基因定点突变技术常用于研究某个（些） 氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结 合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元 件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位 点等。
主要采用PCR法：重叠延伸技术和大引物诱变 法。
6.2 基因敲除技术
6.2.1 基本原理
*经典遗传学：从表型出发，研究基因型。
BTLA剪接体基因的结构分析
RT-PCR法克隆人BTLA编码区基因电泳结果
BTLAs编码的异构体蛋白BTLAi序列分析及其预测
异构体BTLAi（BTLA isoform）的氨基酸序列比Ai的跨膜螺旋段预测结果
A: BTLA实现
真核生物的转录因子大多是由两个结构 上分开、功能上独立的结构域组成的。如 GAL4 的 N 端 1-147aa 是 DNA 结合域（ BD ）， 其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般 情况下， BD 能与 GAL4 效应基因启动子上游 的特定 DNA 区段（ UAS ）相结合， AD 则推 动了转录起始。
被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间 结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。 因而可用于筛选目的蛋白。 图6-36
图6-36 噬箘体展示技术研究蛋白质相互作用
蛋白质磷酸化技术

底物蛋白磷酸化和蛋白激酶活性检测 蛋白质分离、SDS-PAGE、体外磷酸化 反应（图6-38）
图6-38 蛋白激酶体外磷酸化活性分析
2、条件型基因敲除
条件型基因敲除：通过定位重组系统实现特定 时间和空间的基因敲除。
对有重要生理功能的基因，完全基因敲除使有 关基因功能的研究无法开展。 Cre/LoxP和FLP/FRT系统，具有可调节性。
图6-11。
图6-11 条件型基因敲除策略
图6-12 基因敲除 的主要技术 策略与步骤
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
融合蛋白BTLAs-DsRed2和BTLAs-DsRed2的 在转染细胞膜上表达的检测
图3.5 流式细胞术检测HVEM-Fc融合蛋白和单抗MIH26与基因转染细胞结合的结果
激光共聚焦观察DsRed2和GFP在转染细胞的分布
6.1.3 原位杂交技术
原位杂交是用标记的核酸探针，经过放射 自显影或放射检测体系，在组织、细胞、间期 核及染色体上对核酸进行定位和相对定量的一 种方法。 RNA原位杂交：在mRNA水平上，用标记 的探针与固定的组织切片反应后进行显色反应， 从而对该基因的表达进行定性定量分析。
6.6 其它分子生物学技术
凝胶滞缓实验（EMSA）：是体外分析DNA与 蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 基本原理是蛋白质与DNA结合后将大增加相对 分子质量，没有结合蛋白的DNA片段跑得快， 而与蛋白质形成复合物的DNA由于受到阻滞而 跑得慢。
噬菌体展示技术：是将外源蛋白或多肽的DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位 置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同 时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌 体表面的生物技术。
第六章 分子生物学研究法（下）
——基因功能研究技术
本章主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技 术和方法，比如通过这些方法研究： （ 1 ）单个或多个基因在生物体的某些特定发育阶 段或在不同环境下的表达模式； （ 2 ）某基因缺失后生物体表型变化 分析该基因 功能； （3）蛋白质相互作用认识信号转导通路等。
* 现代遗传学：从基因序列出发，推测表型， 从而推导出该基因功能。 基因敲除：又称为基因打靶，该技术通过外源 DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确 的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色 体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
1、完全基因敲除
完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细胞 或动物个体中的靶基因活性。 一般采用取代型或插入型载体在ES细胞中根据 正负双向选择原理进行完全基因敲除。 图6-9；图6-10。