RNA-seq技术原理及应用-课件PPT
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2. 2005 年以来，以 Roche 公司的 454 技术、 Illumina 公司的 Solexa 技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序技术相继诞生，又称作深 度测序技术。
3.把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成 的 cDNA 上，从而获得来自不同基因的RNA 片段 在特定样本中的含量，这就是 RNA测序或 RNA-
总结
高通量测序技术的应用面非常广，RNA-seq 只是 其中一个方面，除此之外，基因组的从头测序和重 测序 、染色质免疫沉淀测序、甲基化测序等技术都 同样有着广泛的应用。
进一步，通过对供体和受体位点的读段计数，结合 外显子其他区域的读段数据，还能定量地计算选择性 剪接事件之间的比例。
三、RNA-seq结果分析
两类样本 RNA-seq 数据比较分析的框架
四、RNA-seq技术应用
1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰
富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、 UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq 还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。
三、RNA-seq结果分析
2. 基因表达水平估计 RNA-seq 数据最基本的应用是检测基因的表达水 平 ，与基因芯片数据相比 ，RNA 测序得到的是数字 化的表达信号，具有灵敏度高、分辨率高、无饱和区 等优势。 RNA 测序数据是对提取出的 RNA 转录本中随机 进行的短片段测序，如果一个转录本的丰度高，则测 序后定位到其对应的基因组区域的读段也就多，可以 通过对定位到基因外显子区的读段计数来估计基因表 达水平。
二、RNA板扩增
序列
1234
TTTT…
簇序列读取反应
二、RNA-seq技术原理
RNA-seq实验流程图
三、RNA-seq结果分析
为了便于测序数据的发布和共享，高通量测序数据以 FASTQ 格式来记录所测的碱基读段和质量分数。 NCBI、EBI、 DDBJ 等数据中心建立了大容量的数据库 SRA来存放共享的测 序数据。
三、RNA-seq结果分析
RNA-seq 数据的基本处理
三、RNA-seq结果分析
1. 序列定位算法 （1）空位种子索引法：首先将读段切分，并选取其中一段 或几段作为种子建立搜索索引，再通过查找索引、延展匹配来 实现读段定位 ，通过轮换种子考虑允许出现错配的各种可能的 位置组合（Maq）。 （2） Burrows-Wheeler 转换技术：通过B-W 转换将基因组 序列按一定规则压缩并建立索引，再通过查找和回溯来定位读 段，在查找时可通过碱基替代来实现允许的错配（Bowtie）。 （3）改进的 SmithWaterman 动态规划算法：随着读长的 增加，允许读段序列中存在插入删除(indel)的定位（BFAST、 SHRiMP、Mosaik）。
二、RNA-seq技术原理
Illumina/Solexa 测序技术的基本原理是边合成边 测序，即测序过程是以 DNA 单链为模板，在生成 互补链时，利用带荧光标记的 dNTP 发出不同颜色 的荧光来确定不同的碱基。
新加入 dNTP 的末端被可逆的保护基团封闭，既 保证单次反应只能加入一个碱基，又能在该碱基读 取完毕后，将保护基团除去，使得下一个反应可继 续进行。为了增加荧光强度，使之更易被成像系统 所采集，该技术在测序之前还需要对待测片段做桥 式扩增。
RNA-seq技 术原理及应用
主要内容
1、RNA-seq技术简介 2、RNA-seq技术原理 3、RNA-seq结果分析 4、RNA-seq技术应用
一、RNA-seq技术简介
1.诞生于 20 世纪 70 年代的 Sanger 法是最早被 广泛应用的 DNA 测序技术，也是完成人类基因组 计划的基础。
三、RNA-seq结果分析
3. 选择性剪接事件识别和剪接异构体表达水平推断
只要测序深度足够深，就能检测到所有转录本的全 部序列，包括来自剪接接合区的序列。Tophat 等软件 定位剪接接合区读段的策略能标定出剪接事件中的两 个剪接位点：供体位点和受体位点。通过比较供体位 点和受体位点的组合，就能识别选择性剪接事件。
2、转录本变异研究 在发现序列差异方面，如融合基因鉴定、编码
序列多态性研究等，RNA-seq也具有很大的潜力。
四、RNA-seq技术应用
3、非编码区域功能研究 转录组学研究的一个重要方面就是发现和分
析 ncRNA，在表观遗传、转录及转录后等多个层面 调控基因表达。
4、基因表达水平研究 RNA-Seq一个特别强大的优势是它可以捕捉不同 组织或状态下的转录组动态变化而无需对数据集进 行复杂的标准化。
3.把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成 的 cDNA 上，从而获得来自不同基因的RNA 片段 在特定样本中的含量，这就是 RNA测序或 RNA-
总结
高通量测序技术的应用面非常广，RNA-seq 只是 其中一个方面，除此之外，基因组的从头测序和重 测序 、染色质免疫沉淀测序、甲基化测序等技术都 同样有着广泛的应用。
进一步，通过对供体和受体位点的读段计数，结合 外显子其他区域的读段数据，还能定量地计算选择性 剪接事件之间的比例。
三、RNA-seq结果分析
两类样本 RNA-seq 数据比较分析的框架
四、RNA-seq技术应用
1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰
富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、 UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq 还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。
三、RNA-seq结果分析
2. 基因表达水平估计 RNA-seq 数据最基本的应用是检测基因的表达水 平 ，与基因芯片数据相比 ，RNA 测序得到的是数字 化的表达信号，具有灵敏度高、分辨率高、无饱和区 等优势。 RNA 测序数据是对提取出的 RNA 转录本中随机 进行的短片段测序，如果一个转录本的丰度高，则测 序后定位到其对应的基因组区域的读段也就多，可以 通过对定位到基因外显子区的读段计数来估计基因表 达水平。
二、RNA板扩增
序列
1234
TTTT…
簇序列读取反应
二、RNA-seq技术原理
RNA-seq实验流程图
三、RNA-seq结果分析
为了便于测序数据的发布和共享，高通量测序数据以 FASTQ 格式来记录所测的碱基读段和质量分数。 NCBI、EBI、 DDBJ 等数据中心建立了大容量的数据库 SRA来存放共享的测 序数据。
三、RNA-seq结果分析
RNA-seq 数据的基本处理
三、RNA-seq结果分析
1. 序列定位算法 （1）空位种子索引法：首先将读段切分，并选取其中一段 或几段作为种子建立搜索索引，再通过查找索引、延展匹配来 实现读段定位 ，通过轮换种子考虑允许出现错配的各种可能的 位置组合（Maq）。 （2） Burrows-Wheeler 转换技术：通过B-W 转换将基因组 序列按一定规则压缩并建立索引，再通过查找和回溯来定位读 段，在查找时可通过碱基替代来实现允许的错配（Bowtie）。 （3）改进的 SmithWaterman 动态规划算法：随着读长的 增加，允许读段序列中存在插入删除(indel)的定位（BFAST、 SHRiMP、Mosaik）。
二、RNA-seq技术原理
Illumina/Solexa 测序技术的基本原理是边合成边 测序，即测序过程是以 DNA 单链为模板，在生成 互补链时，利用带荧光标记的 dNTP 发出不同颜色 的荧光来确定不同的碱基。
新加入 dNTP 的末端被可逆的保护基团封闭，既 保证单次反应只能加入一个碱基，又能在该碱基读 取完毕后，将保护基团除去，使得下一个反应可继 续进行。为了增加荧光强度，使之更易被成像系统 所采集，该技术在测序之前还需要对待测片段做桥 式扩增。
RNA-seq技 术原理及应用
主要内容
1、RNA-seq技术简介 2、RNA-seq技术原理 3、RNA-seq结果分析 4、RNA-seq技术应用
一、RNA-seq技术简介
1.诞生于 20 世纪 70 年代的 Sanger 法是最早被 广泛应用的 DNA 测序技术，也是完成人类基因组 计划的基础。
三、RNA-seq结果分析
3. 选择性剪接事件识别和剪接异构体表达水平推断
只要测序深度足够深，就能检测到所有转录本的全 部序列，包括来自剪接接合区的序列。Tophat 等软件 定位剪接接合区读段的策略能标定出剪接事件中的两 个剪接位点：供体位点和受体位点。通过比较供体位 点和受体位点的组合，就能识别选择性剪接事件。
2、转录本变异研究 在发现序列差异方面，如融合基因鉴定、编码
序列多态性研究等，RNA-seq也具有很大的潜力。
四、RNA-seq技术应用
3、非编码区域功能研究 转录组学研究的一个重要方面就是发现和分
析 ncRNA，在表观遗传、转录及转录后等多个层面 调控基因表达。
4、基因表达水平研究 RNA-Seq一个特别强大的优势是它可以捕捉不同 组织或状态下的转录组动态变化而无需对数据集进 行复杂的标准化。