阮长耿 血小板的研究进展.ppt
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血小板的研究进展
苏州大学附属第一医院 江苏省血液研究所 阮长耿
一、血小板黏附、活化在血栓形成中的重要性
• 在生理性止血及动脉血栓形成过程中，血小板粘附到暴露的 血管内皮下基质并发生血小板活化是血栓形成的起始阶段， 进而产生血小板聚集和释放反应，最终导致血小板血栓形成。
• 现状：参与黏附的相关分子的结构、信号传导以及这些分子 缺陷所引起的临床疾病和症状；
实验室检查
血常规、血管内溶血相关检查 vWF多聚体分析 vWF-cp活性测定 vWF-cp抗原测定 vWF-cp自身抗体测定 vWF-cp基因突变检查 ADAMTS-13/FXI Complex ELISA
vWF多聚体分析
vWF-cp活性测定
SDS-PAGE加免疫印迹（Furlan方法） 双向免疫辐射计（Obert方法） 残余胶原结合试验（Gerristsen方法） 残余瑞斯脱霉素辅因子活性试验(Bohm方法） 特异性微小重组底物（GST-VWF73-H）用于vWF-cp活性 检测
ADAMTS13 抗原测定（ELISA）
ADAMTS13 自身抗体测定（ ELISA）
治疗：
诊断明确或高度怀疑本病时应尽早开始治疗。 1，血浆置换及输注新鲜血浆
仍是目前最有效方法，60％－90％病例有效，血 浆置换量每天2－3升（20ml—30ml/Kg），严重者可 增加至40ml—80ml/Kg。病情稳定后继续1－2周。 2，免疫抑制剂
在狒狒的Folts模型中，6B4 Fab片断2 mg·kg－1注射。GPIb封闭率 69%；股动 脉CFR抑制率100%；瑞斯托霉素诱导的 血小板聚集抑制率100%；血小板数、出 血时间无明显变化，PT、APTT正常。
Folts 模型
Reopro对CFRs发生的影响
2.5ug/ml Reopro
在狒狒动脉血栓形成实验中，82D6A3 0.3 mg·kg－1可完全抑制 股动脉血管内血栓形成， vWF与胶原结合能力抑制96％；实验 动物的血小板数、凝血指标、VWF水平和出血时间均无明显改 变。
抗血小板粘附药物的优点
1. 在动脉内高剪切力条件下，血小板有效粘附和血栓形成 必需依赖胶原-vWF-GPIb轴，对此途径的抑制可更为特 异地防止动脉内的血栓形成，而对静脉系统的影响小， 出血副作用轻。
Tsp1: thrombospondin motif;
Cys: cys-rich domain.
CUB: complement -Uregf-Bmp-1 domain
COOH
vWF-cp结构模式图
vWF-cp结构图及基因突变位点：
*
* 我所发现的新突变位点
临床表现：
见于任何年龄，大多数在15—50岁；女性多见。 ▶出血：以皮肤粘膜出血为主，严重者可发生颅内出血。 ▶微血管病性溶血性贫血：黄疸，血红蛋白尿。 ▶神经精神症状：意识紊乱、头痛、失语、惊厥、视力 障碍、谵妄及偏瘫等；以一过性，反复性和多变性为特 征。 ▶肾脏损害：蛋白尿、血尿、肌酐升高，肾功能衰竭。 ▶发热：热型不一，体温常达38℃～40.5℃。
Gas6受体为血小板膜表面蛋白Mer（Ax1,Tyro3)， 两者结合后，通过蛋白磷酸化途径（涉及PI-3K）活 化血小板。根据Gas6-Mer作用特点，其功能发挥主 要在血栓形成后期，对血栓形成有促进和稳定作用。
Gas6受体knockout对血小板聚集功能的影响
Gas6受体knockout对血小板伸展功能的影响
有关血小板胶原受体在血小板黏附及活化过程中 的相对作用一直存在争议。
最近发现GPIb/IX/V与GPⅥ可发生免疫共沉淀，结 合两者有相似的信号转导途径，故有人提出 GPIb/IX/V与GPⅥ在血小板膜上相互彼邻，在功 能上相互协同。
GPVI缺乏患者的血小板聚集和释放反应图
Moroi M等1989年报导一名GPVI缺乏患者有出血倾向，而胶原（2ug/ml)诱导的血小板聚集为3%（正常 对照：50-75%）ATP不释放。ADP和瑞斯托霉素诱导的血小板聚集和释放正常。
Moroi M, et al . J Clin Invest, 1989;84:1440
Aggregation of platelets from 2 deficient mice in response to soluble collagen. Integrin 2-deficient mice develop normally, are fertile, and display no obvious anatomical
• 进展：vWF-A1/GPIb, vWF-A2/ADAMTS13, vWF-A3-胶原
• 抗血栓药物：抗GPIb/IX/V－vWF－胶原轴； 抗GPⅥ/α2β1－胶原轴制剂；
GPIb-IX-V
platelet
21
GPVI-Fc
A1 A2 A3
Exposed collagen
血小板胶原受体
血小板的黏附过程
Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20:2303-2308.
AJvW-2 抗血管内膜增殖效应
活化血小板可释放出多种活性物质如PDGF、 PAF、CD40L、MIP-1α和P选择素等，介导血管 损伤部为的炎性反应，出现炎性细胞迁移、平 滑肌细胞和成纤维细胞的增殖，促进动脉粥样 斑块的发展。
长春新碱每周1－2mg×4－6周；
或泼尼松1mg/kg，酌情增减。
3，抗血小板GPIIb/IIIa单抗可阻断血小板聚集， 4，抗CD20抗体、免疫球蛋白、切脾对难治、复发
或存在自身抗体的TTP有效。
三、血小板血栓形成调控因素
黏附、活化后的血小板从血流中募集/聚集血小板， 形成稳定的血小板血栓。
除已知的调控因素外，目前发现有多种新的调控 途径参与血小板血栓的稳定过程。
研究进展
GPIba
ADAMTS-13 collagen
842Tyr- 843Met
二、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)
• 五联征：发热、血小板减少性紫癜、微血管性溶血性 贫血、中枢神经系统异常、肾脏受累
• 发病机制：
vWF-cp质或量异常(vWF-cp基因变异、抗 vWF-cp自身抗体) 血管内皮损伤（抗内皮细胞自身抗体、细胞毒素） 血小板活化 凝血酶敏感蛋白1
抗vWF A1区单抗AJvW-2 可使受损的豚鼠颈动 脉血管内膜/中层比下降65%，对血小板数、出 血时间、PT、APTT无影响。
以上结果表明抑制血小板粘附可减少血小板活 化及血小板来源的细胞因子释放，减轻炎性反 应和细胞增殖，有助于延缓动脉内膜病变。
抗vWF A1区单抗AJW200
AJW200人体实验（24例），AJW200 0.05 mg·kg－1，血浆vWF封闭率为62.4％； vWF：Rcof活性为34％±16％（对照116％ ±41％）；PFA-100血流停止时间为 202±78秒（对照 80±19秒）；所有志愿者 出血时间和vWF抗原水平均无显著变化。
抗vWF A1区单抗AJW200
在狗冠状动脉Folts’实验模型中， AJW200 0.3mg·kg－1，冠状动脉内血栓形 成抑制率达96％，体外血小板聚集抑制率 81%；血小板数无明显变化，但出血时间有 延长（5～22分）。
Bar graph showing inhibitory effect of AJvW-2 on neointima formation 14 days after balloon injury. AJvW-2 was administered as a single bolus injection at doses of 0.6 mg/kg (n=11) and 1.8 mg/kg (n=10). *P<0.01 vs control (n=11).
ADAMTS-13 缺乏相关性TTP发病机制模式图
SP
NH2
metalloproteinase
Tsp1
spacer
propeptide
Dis Cys
CUB
Abbreviations include:
Tsp1 repeat
SP: signal peptide;
Dis: disintegrin-like domain;
抗GPⅥ单克隆抗体： JAQ1 9O12、6B12、 11A12、SZ118等
体外实验中，JAQ1完全抑制胶原诱导的血小板聚集，对凝血酶和 佛波酯诱导的聚集无影响。 体内实验中，JAQ1抑制胶原诱导的血小板聚集和促凝活性表达。 肺栓塞模型中，95%对照小鼠在栓塞诱发后5分钟内死亡，而经 JAQ1处理小鼠均存活。使用JAQ1后出血的副作用轻。
不同剂量813-F(ab)2、Reopro对猴股动脉CFRs 发生的影响
CFR（％ of pre-control)
140
*
*
120
100
80
*
60
40
20
0 0.0.0 3.03.0 6.06.0 1
88113-3F-(Fa(ba)b2 )2
*
* 0.01<P<0.05
0.0.0 2.52.5
RReeoopprroo
82D6A3
环氧酶抑制剂
临床应用
ADP活化抑制剂
临床应用
GPIIb-IIIa受体抑制剂 临床应用
GPVI（胶原）受体抑制剂 动物实验
“vWF-GPIb”抑制剂 动物实验
“vWF-胶原” 抑制剂 动物实验
抗GPⅥ/α2β1－胶原轴制剂
抗GPIa/IIa抗体：15D7和6F1
体外实验表面可抑制胶原诱导的血小板聚集；抑制高剪切力条件 下血小板与固定的纤维状胶原表面的黏附
defects—Homozygous 2-deficient mice are viable and show no striking phenotypical differencewhen compared with their heterozygous and wild type littermates.
2. 血小板粘附后的信号转导和血小板活化则主要依赖胶原GPVI轴，对此途径的抑制即可在更早阶段阻止血小板活 化，进而抑制血栓形成。
3. 在较早阶段抑制了血小板与病变部位的粘附及血小板活 化，可明显减少血小板释放CD40, PDGF等细胞因子， 能显著减轻血管炎性反应和细胞增殖，有助于延缓动脉 内膜病变，减少再梗死的发生。
抗GPIb/IX/V－vWF－胶原轴
抗GPIb单克隆抗体: 6B4
在狒狒的Folts模型中，6B4 Fab片断2 mg·kg－1注射。GPIb封闭 率 69%；股动脉CFR抑制率100%；瑞斯托霉素诱导的血小板聚 集抑制率100%；血小板数、出血时间无明显变化，PT、APTT 正常。
VWF A3区单克隆抗体 82D6A3：
抗黏附治疗作用策略：
血小板与胶原表面的有效黏附是血栓形成的必备条件之一， 因而GPIb/IX/V-vWF-胶原轴和GPⅥ/α2β1-胶原轴为抗血小 板粘附治疗的主要靶点。
6B4 1GPIb/IX/V－vWF－胶原轴
抗GPIb单克隆抗体: 6B4 (SZ2)
Brass L. ATVB 2004;24:989-991
Gas6的结构及作用
Gas6 ( growth arrest-specific 6 )是一种维生素K依 赖蛋白，结构类似蛋白S，分子量75kDa，存在于静 息血小板的α颗粒中。血小板活化后，Gas6被释放 至血小板表面和液相介质中。
体内和体外实验均证明Gas6具有促进血小板活化 作用，Gas6基因剔除或抗体抑制均可抑制血小板聚 集及血栓形成。
Holtkotter O,et al.J Biol Chem, 2002:277:10789
各粘附分子缺乏患者出血程度
GPVI
—
GPIa-IIa
±
GPIb-IX
++
GPIIb-IIIa
+++
抗血小板药物
药物
作用环节
第一代 阿司匹林
第二代 第三代
Ticlopidine Reopro JAQ1
AjvW2, 6B4
高剪切力条件下血小板初期不稳定粘附依赖 GPIb/IX/V复合物和GPⅥ的协同作用 黏附后的血小板活化由GPⅥ介导 血小板牢固粘附则依赖GPIa/IIa和GPIIb/IIIa的共 同作用 活化的血小板释放ADP、 TXA2，进一步加强 血小板粘附和聚集
Primary Platelet Adhesion Receptors
苏州大学附属第一医院 江苏省血液研究所 阮长耿
一、血小板黏附、活化在血栓形成中的重要性
• 在生理性止血及动脉血栓形成过程中，血小板粘附到暴露的 血管内皮下基质并发生血小板活化是血栓形成的起始阶段， 进而产生血小板聚集和释放反应，最终导致血小板血栓形成。
• 现状：参与黏附的相关分子的结构、信号传导以及这些分子 缺陷所引起的临床疾病和症状；
实验室检查
血常规、血管内溶血相关检查 vWF多聚体分析 vWF-cp活性测定 vWF-cp抗原测定 vWF-cp自身抗体测定 vWF-cp基因突变检查 ADAMTS-13/FXI Complex ELISA
vWF多聚体分析
vWF-cp活性测定
SDS-PAGE加免疫印迹（Furlan方法） 双向免疫辐射计（Obert方法） 残余胶原结合试验（Gerristsen方法） 残余瑞斯脱霉素辅因子活性试验(Bohm方法） 特异性微小重组底物（GST-VWF73-H）用于vWF-cp活性 检测
ADAMTS13 抗原测定（ELISA）
ADAMTS13 自身抗体测定（ ELISA）
治疗：
诊断明确或高度怀疑本病时应尽早开始治疗。 1，血浆置换及输注新鲜血浆
仍是目前最有效方法，60％－90％病例有效，血 浆置换量每天2－3升（20ml—30ml/Kg），严重者可 增加至40ml—80ml/Kg。病情稳定后继续1－2周。 2，免疫抑制剂
在狒狒的Folts模型中，6B4 Fab片断2 mg·kg－1注射。GPIb封闭率 69%；股动 脉CFR抑制率100%；瑞斯托霉素诱导的 血小板聚集抑制率100%；血小板数、出 血时间无明显变化，PT、APTT正常。
Folts 模型
Reopro对CFRs发生的影响
2.5ug/ml Reopro
在狒狒动脉血栓形成实验中，82D6A3 0.3 mg·kg－1可完全抑制 股动脉血管内血栓形成， vWF与胶原结合能力抑制96％；实验 动物的血小板数、凝血指标、VWF水平和出血时间均无明显改 变。
抗血小板粘附药物的优点
1. 在动脉内高剪切力条件下，血小板有效粘附和血栓形成 必需依赖胶原-vWF-GPIb轴，对此途径的抑制可更为特 异地防止动脉内的血栓形成，而对静脉系统的影响小， 出血副作用轻。
Tsp1: thrombospondin motif;
Cys: cys-rich domain.
CUB: complement -Uregf-Bmp-1 domain
COOH
vWF-cp结构模式图
vWF-cp结构图及基因突变位点：
*
* 我所发现的新突变位点
临床表现：
见于任何年龄，大多数在15—50岁；女性多见。 ▶出血：以皮肤粘膜出血为主，严重者可发生颅内出血。 ▶微血管病性溶血性贫血：黄疸，血红蛋白尿。 ▶神经精神症状：意识紊乱、头痛、失语、惊厥、视力 障碍、谵妄及偏瘫等；以一过性，反复性和多变性为特 征。 ▶肾脏损害：蛋白尿、血尿、肌酐升高，肾功能衰竭。 ▶发热：热型不一，体温常达38℃～40.5℃。
Gas6受体为血小板膜表面蛋白Mer（Ax1,Tyro3)， 两者结合后，通过蛋白磷酸化途径（涉及PI-3K）活 化血小板。根据Gas6-Mer作用特点，其功能发挥主 要在血栓形成后期，对血栓形成有促进和稳定作用。
Gas6受体knockout对血小板聚集功能的影响
Gas6受体knockout对血小板伸展功能的影响
有关血小板胶原受体在血小板黏附及活化过程中 的相对作用一直存在争议。
最近发现GPIb/IX/V与GPⅥ可发生免疫共沉淀，结 合两者有相似的信号转导途径，故有人提出 GPIb/IX/V与GPⅥ在血小板膜上相互彼邻，在功 能上相互协同。
GPVI缺乏患者的血小板聚集和释放反应图
Moroi M等1989年报导一名GPVI缺乏患者有出血倾向，而胶原（2ug/ml)诱导的血小板聚集为3%（正常 对照：50-75%）ATP不释放。ADP和瑞斯托霉素诱导的血小板聚集和释放正常。
Moroi M, et al . J Clin Invest, 1989;84:1440
Aggregation of platelets from 2 deficient mice in response to soluble collagen. Integrin 2-deficient mice develop normally, are fertile, and display no obvious anatomical
• 进展：vWF-A1/GPIb, vWF-A2/ADAMTS13, vWF-A3-胶原
• 抗血栓药物：抗GPIb/IX/V－vWF－胶原轴； 抗GPⅥ/α2β1－胶原轴制剂；
GPIb-IX-V
platelet
21
GPVI-Fc
A1 A2 A3
Exposed collagen
血小板胶原受体
血小板的黏附过程
Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20:2303-2308.
AJvW-2 抗血管内膜增殖效应
活化血小板可释放出多种活性物质如PDGF、 PAF、CD40L、MIP-1α和P选择素等，介导血管 损伤部为的炎性反应，出现炎性细胞迁移、平 滑肌细胞和成纤维细胞的增殖，促进动脉粥样 斑块的发展。
长春新碱每周1－2mg×4－6周；
或泼尼松1mg/kg，酌情增减。
3，抗血小板GPIIb/IIIa单抗可阻断血小板聚集， 4，抗CD20抗体、免疫球蛋白、切脾对难治、复发
或存在自身抗体的TTP有效。
三、血小板血栓形成调控因素
黏附、活化后的血小板从血流中募集/聚集血小板， 形成稳定的血小板血栓。
除已知的调控因素外，目前发现有多种新的调控 途径参与血小板血栓的稳定过程。
研究进展
GPIba
ADAMTS-13 collagen
842Tyr- 843Met
二、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)
• 五联征：发热、血小板减少性紫癜、微血管性溶血性 贫血、中枢神经系统异常、肾脏受累
• 发病机制：
vWF-cp质或量异常(vWF-cp基因变异、抗 vWF-cp自身抗体) 血管内皮损伤（抗内皮细胞自身抗体、细胞毒素） 血小板活化 凝血酶敏感蛋白1
抗vWF A1区单抗AJvW-2 可使受损的豚鼠颈动 脉血管内膜/中层比下降65%，对血小板数、出 血时间、PT、APTT无影响。
以上结果表明抑制血小板粘附可减少血小板活 化及血小板来源的细胞因子释放，减轻炎性反 应和细胞增殖，有助于延缓动脉内膜病变。
抗vWF A1区单抗AJW200
AJW200人体实验（24例），AJW200 0.05 mg·kg－1，血浆vWF封闭率为62.4％； vWF：Rcof活性为34％±16％（对照116％ ±41％）；PFA-100血流停止时间为 202±78秒（对照 80±19秒）；所有志愿者 出血时间和vWF抗原水平均无显著变化。
抗vWF A1区单抗AJW200
在狗冠状动脉Folts’实验模型中， AJW200 0.3mg·kg－1，冠状动脉内血栓形 成抑制率达96％，体外血小板聚集抑制率 81%；血小板数无明显变化，但出血时间有 延长（5～22分）。
Bar graph showing inhibitory effect of AJvW-2 on neointima formation 14 days after balloon injury. AJvW-2 was administered as a single bolus injection at doses of 0.6 mg/kg (n=11) and 1.8 mg/kg (n=10). *P<0.01 vs control (n=11).
ADAMTS-13 缺乏相关性TTP发病机制模式图
SP
NH2
metalloproteinase
Tsp1
spacer
propeptide
Dis Cys
CUB
Abbreviations include:
Tsp1 repeat
SP: signal peptide;
Dis: disintegrin-like domain;
抗GPⅥ单克隆抗体： JAQ1 9O12、6B12、 11A12、SZ118等
体外实验中，JAQ1完全抑制胶原诱导的血小板聚集，对凝血酶和 佛波酯诱导的聚集无影响。 体内实验中，JAQ1抑制胶原诱导的血小板聚集和促凝活性表达。 肺栓塞模型中，95%对照小鼠在栓塞诱发后5分钟内死亡，而经 JAQ1处理小鼠均存活。使用JAQ1后出血的副作用轻。
不同剂量813-F(ab)2、Reopro对猴股动脉CFRs 发生的影响
CFR（％ of pre-control)
140
*
*
120
100
80
*
60
40
20
0 0.0.0 3.03.0 6.06.0 1
88113-3F-(Fa(ba)b2 )2
*
* 0.01<P<0.05
0.0.0 2.52.5
RReeoopprroo
82D6A3
环氧酶抑制剂
临床应用
ADP活化抑制剂
临床应用
GPIIb-IIIa受体抑制剂 临床应用
GPVI（胶原）受体抑制剂 动物实验
“vWF-GPIb”抑制剂 动物实验
“vWF-胶原” 抑制剂 动物实验
抗GPⅥ/α2β1－胶原轴制剂
抗GPIa/IIa抗体：15D7和6F1
体外实验表面可抑制胶原诱导的血小板聚集；抑制高剪切力条件 下血小板与固定的纤维状胶原表面的黏附
defects—Homozygous 2-deficient mice are viable and show no striking phenotypical differencewhen compared with their heterozygous and wild type littermates.
2. 血小板粘附后的信号转导和血小板活化则主要依赖胶原GPVI轴，对此途径的抑制即可在更早阶段阻止血小板活 化，进而抑制血栓形成。
3. 在较早阶段抑制了血小板与病变部位的粘附及血小板活 化，可明显减少血小板释放CD40, PDGF等细胞因子， 能显著减轻血管炎性反应和细胞增殖，有助于延缓动脉 内膜病变，减少再梗死的发生。
抗GPIb/IX/V－vWF－胶原轴
抗GPIb单克隆抗体: 6B4
在狒狒的Folts模型中，6B4 Fab片断2 mg·kg－1注射。GPIb封闭 率 69%；股动脉CFR抑制率100%；瑞斯托霉素诱导的血小板聚 集抑制率100%；血小板数、出血时间无明显变化，PT、APTT 正常。
VWF A3区单克隆抗体 82D6A3：
抗黏附治疗作用策略：
血小板与胶原表面的有效黏附是血栓形成的必备条件之一， 因而GPIb/IX/V-vWF-胶原轴和GPⅥ/α2β1-胶原轴为抗血小 板粘附治疗的主要靶点。
6B4 1GPIb/IX/V－vWF－胶原轴
抗GPIb单克隆抗体: 6B4 (SZ2)
Brass L. ATVB 2004;24:989-991
Gas6的结构及作用
Gas6 ( growth arrest-specific 6 )是一种维生素K依 赖蛋白，结构类似蛋白S，分子量75kDa，存在于静 息血小板的α颗粒中。血小板活化后，Gas6被释放 至血小板表面和液相介质中。
体内和体外实验均证明Gas6具有促进血小板活化 作用，Gas6基因剔除或抗体抑制均可抑制血小板聚 集及血栓形成。
Holtkotter O,et al.J Biol Chem, 2002:277:10789
各粘附分子缺乏患者出血程度
GPVI
—
GPIa-IIa
±
GPIb-IX
++
GPIIb-IIIa
+++
抗血小板药物
药物
作用环节
第一代 阿司匹林
第二代 第三代
Ticlopidine Reopro JAQ1
AjvW2, 6B4
高剪切力条件下血小板初期不稳定粘附依赖 GPIb/IX/V复合物和GPⅥ的协同作用 黏附后的血小板活化由GPⅥ介导 血小板牢固粘附则依赖GPIa/IIa和GPIIb/IIIa的共 同作用 活化的血小板释放ADP、 TXA2，进一步加强 血小板粘附和聚集
Primary Platelet Adhesion Receptors