蛹虫草多糖的分离纯化及促胆固醇逆向转运研究

蛹虫草多糖的分离纯化及促胆固醇逆向转运研究
对蛹虫草子实体多糖进行分离纯化、相对分子质量测定、单糖组成分析和体内胆固醇逆向转运活性研究。

采用阴离子交换色谱、分子排阻色谱分离纯化多糖，高效凝胶渗透色谱法测定相对分子质量，高效液相色谱结合柱前衍生法测定单糖组成，同位素示踪技术评价胆固醇转运活性。

最终获得3种纯多糖组分CMBW1，CMBW2和CMYW1，糖含量依次为87%，89%，95%，蛋白含量依次为6.5%，1.3%，2.8%，相对分子质量依次为772.1，20.9，13.2 kDa；CMBW1由Man，GlcN，Rha，GlcUA，Glc，Gal和Ara构成，摩尔比例为7.25∶0.17∶1.29∶0.23∶6.30∶11.08∶0.79；CMBW2由Man，GlcN，Gal和Ara组成，摩尔比例为2.40∶0.16∶2.92∶0.24；CMYW1由Man，GlcN，GlcUA和Glc组成，摩尔比例为0.59∶0.57∶0.45∶25.61；蛹虫草多糖50 mg·kg-1即可显著促进3H-胆固醇向小鼠血液转运和经由粪便排出。

所得3种蛹虫草多糖组分均为杂多糖，所得蛹虫草多糖具有促胆固醇逆向转运功能。

标签：蛹虫草多糖；分离纯化；单糖组成；胆固醇逆向转运
冬虫夏草具有抑制肿瘤生产、增强机体免疫力、降脂、抗菌等功能；但冬虫夏草自然资源稀少、价格昂贵、人工栽培困难等问题，制约着冬虫夏草应用推广。

蛹虫草Cordyceps militaris L. Link又名北虫草、北冬虫夏草等，其与冬虫夏草属于同属真菌，不仅具有与冬虫夏草相近的生物活性，且易于人工培养。

蛹虫草多糖是蛹虫草含量较高的生物活性物质之一，研究发现蛹虫草多糖具有增强免疫[1]、抗肿瘤[2-3]、抗病毒、抗衰老、降血糖等多种功能。

近年研究发现蛹虫草多糖具有类似于冬虫夏草多糖的生物活性[4-6]。

蛹虫草多糖的单糖组成、相对分子质量、糖苷键连接方式可对其生物活性产生重要影响。

单纯的水提醇沉法获得多糖的方法工艺流程简单，但获得的多糖相对分子质量范围广，组成成分复杂，不利于多糖构-效关系的阐述，又不利于产品质量的控制。

2013年至今，先后有国内外研究者报道了蛹虫草的降脂效果[7-8]，而胆固醇逆向转运是药物降脂的重要一环。

本文以人工培养获得的蛹虫草子实体为原料，采用先进的柱色谱手段对蛹虫草多糖进行分离纯化、单糖组成分析、相对分子质量测定，并对蛹虫草中的多糖成分是否具有胆固醇逆向转运活性进行了初步研究。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂蛹虫草子实体（泰安市岱珍营养保健食品有限公司提供）；Q-sepharoseTM Fast Flow和Sephacryl S200HR柱填料（美国GE Healthcare）；葡萄糖（Glc），甘露糖（Man），半乳糖（Gal），阿拉伯糖（Ara），岩藻糖（Fuc），鼠李糖（Rha）、核糖（Rib）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、半乳糖醛酸（GalUA）、木糖（Xyl）、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、葡萄糖胺（GlcN）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），乙腈，Dextran 对照品（相对分子质量1 100.0，667.8，409.8，
273.0，147.6，48.6，23.8，11.6，5.0 kDa）购于Sigma-Aldrich；3H标记胆固醇购于北京（中国）同位素公司；BCA蛋白定量分析试剂盒（上海申能博彩生物科技有限公司）；透析袋（MWCO 8000-14000）（北京Solarbio科技有限公司）；其余试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（美国Agilent公司）；TOSOH TSKgel G5000PWXL不锈钢色谱柱（7.8 mm×300 mm）（日本TOSOH公司）；阴离子交换色谱柱（5 cm×40 cm）和分子排阻色谱柱（1.6 cm×100 cm）（中国上海康华生化仪器制造厂）；BSZ-100自动部分收集器（中国上海青浦沪西仪器厂）；快速蛋白纯化系统（AKTA-FPLC）（美国GE公司）；2695型高效液相色谱（HPLC）（美国Waters公司）；RID -10A示差折光检测器（日本Shimaduz公司）；Laboroto-4002型低压旋转蒸发仪（德国Heidolph集团）；FD-1C-50 低温冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；TDL-5000B型低速冷冻离心机（中国上海嘉鹏科技有限公司）；液体闪烁计数仪LS-6500（美国Beckman公司）。

1.1.3 动物22周雄性C57 BL/6小鼠购自北京大学实验动物中心，合格证号SCXK2009-0004。

1.2 方法
1.2.1 多糖的提取及纯化烘干的蛹虫草子实体、粉碎、乙醇脱脂、热水回流提取、提取液经浓缩、分级醇沉、透析、冷冻干燥得蛹虫草多糖。

多糖重溶于去离子水中，配制成10 g·L-1的溶液进行Q-SepharoseTMFast Flow阴离子交换柱色谱（5.0 cm × 40 cm），采用AKTA-FPLC进行线性洗脱，洗脱溶液为浓度0～2.0 mol·L-1的氯化钠溶液。

采用自动收集器收集洗脱液，苯酚-硫酸法检测并绘制洗脱曲线[7-8]。

再采用Sephacryl S200HR凝胶柱（1.6 cm×100 cm）对经阴离子交换柱色谱后所得的各洗脱组分作进一步的分离纯化，采用AKTA-FPLC进行梯度洗脱。

凝胶柱装柱后采用0.2 mol·L-1的碳酸氢铵溶液平衡48 h，流速为18 mL·h-1。

自动收集器5 mL每管收集洗脱液，苯酚-硫酸法检测并绘制洗脱曲线。

据洗脱曲线分别收集相应的多糖洗脱组分，低压旋转蒸发仪除去碳酸氢铵，冷冻干燥，得纯化后的多糖组分[9-11]。

1.2.2 纯度验证及相对分子质量测定精密称取各相对分子质量的右旋糖酐，分别溶于1.0 mL的流动相中，置4 ℃冰箱中储存备用。

分析柱为TOSOH TSKgel G5000PWXL不锈钢色谱柱（7.8 mm×300 mm）；流动相为0.2 mol·L-1的硫酸钠溶液，流速为0.3 mL·min-1；柱温为35 ℃；进样量为20 μL；检测器Shimaduz RID-10A示差折光检测器。

运用GPC分析软件以标准右旋糖酐重均相对分子质量的对数值（logMw）为纵坐标，以保留时间为横坐标作图，绘制标准曲线并得出回归方程。

将样品溶液（5 g·L-1）的保留时间代入回归方程即可得出样品相对分子质量的对数值，再将其转换即可得出样品的相对分子质量[11-12]。

1.2.3 单糖组成分析分别精密称取适量的12种单糖对照品，加去离子水配制成10 mmol·L-1的单糖对照品储备液。

衍生过程详见参考文献[12]。

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相0.2 mol·L-1
磷酸盐缓冲液-乙腈（83∶17，pH 6.7）；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；紫外检测波长245 nm。

多糖样品经4 mol·L-1三氟乙酸于120 ℃酸水解3 h，低压旋转蒸发去除三氟乙酸。

多糖完全酸水解后采用PMP柱衍生。

将多糖组分色谱峰面积代入相应单糖标准曲线回归方程即可得出各多糖组分单糖摩尔比例。

1.2.4 胆固醇逆向转运活性研究小鼠适应环境2周后，随机分成对照组、蛹虫草多糖低剂量组（25 mg·kg-1）、蛹虫草多糖中剂量组（50 mg·kg-1）和蛹虫草多糖高剂量（100 mg·kg-1）。

对照组ig生理盐水，蛹虫草多糖组ig多糖水溶液2周。

末次给药0.5 h后，每只小鼠腹腔注射0.2 mL吞噬有3H-胆固醇的巨噬细胞混悬液，制备过程详见参考文献，用肝素化采血管分别于0，6，24 h由小鼠眼眶静脉丛取血80 μL，并收集各组24 h内的小鼠粪便用于放射活度检测[13]。

1.2.5 统计学分析采用SPSS 17.0进行统计学分析，数据以平均值±s标准差的形式表示，组间比较采用t检验，P≤0.05则具有统计学意义。

2 结果
2.1 多糖的提取及分离纯化
已有研究表明，蛹虫草子实体多糖存在相对分子质量为几千道尔顿的多糖，因此，本研究中首先采用常规的80%乙醇浓度获得多糖组分，再采用90%乙醇浓度获得相对分子质量更小的多糖。

实验结果如下：蛹虫草子实体1 000 g经脱脂、水提醇沉得80%乙醇沉蛹虫草多糖（CMB）粗品65.8 g；离心所得上清液调整醇浓度至90%，所得沉淀冷冻干燥即得90%乙醇沉蛹虫草多糖（CMY）粗品18.6 g。

CMB和CMY的得率分别为6.58%，1.86%。

CMB经Q-SepharoseTM Fast Flow阴离子交换柱色谱获得2个组分，水洗脱组分CMBW和0.6 mol·L-1的氯化钠洗脱组分CMBS（图1）。

CMY经阴离子交换柱色谱可获得CMYW和0.5 mol·L-1的盐洗脱组分。

本文主要对蛹虫草多糖水洗脱部分CMBW和CMYW采用Sephacryl S200HR凝胶柱分离纯化。

其中，CMBW获得2个多糖组分白色的CMBW1和黄色的CMBW2；CMYW主要获得一个黄色的CMYW1。

以葡萄糖做对照品，苯酚硫酸法测得CMBW1，CMBW2和CMYW1的糖质量分数分别为87%，89%，95%；BCA蛋白含量分析CMBW1，CMBW2和CMYW1的蛋白质量分数分别为6.5%，1.3%，2.8%。

2.2 多糖的纯度及相对分子质量测定
采用TOSOH TSKgel G5000PWXL不锈钢色谱柱（7.8 mm × 300 mm）进行纯度分析及相对分子质量测定。

9种相对分子质量分布范围较广的右旋糖酐对照品的保留时间与其重均相对分子质量的对数值（logMw）绘制的标准曲线图谱（图2），可见右旋糖酐对照品的保留时间与其相对分子质量的对数值之间存在良好的线性关系，线性回归方程为Y=-0.803 9X+11.873；R2=0.996 3。

CMBW1，CMBW2和CMYW1的保留时间分别为7.45，9.4，9.65 min。

由色谱图可以看出，3种多糖均呈单一的对称峰，说明3种多糖组分的纯度较好，可以进行下一步的相关分析。

经计算CMBW1，CMBW2和CMYW1的相对分子质量分别为772.1，20.9，13.2 kDa，所得多糖相对分子质量在Dextran对照品制作的线性范围之内，测定结果准确有效。

2.3 多糖的单糖组成分析
样品经PMP衍生后经ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离的衍生产物采用UV检测器进行检测（图3）。

图3中a为12种单糖经PMP柱前衍生后得出的HPLC色谱图，图中的标注以单糖名称代指其衍生产物。

从该色谱图中可以清楚的看出衍生时引入的杂质的保留时间小于15 min，而单糖衍生物的保留时间在18 min以上，实现了衍生过程中引入的杂质与样品衍生产物之间的有效分离。

由图3中b～d可知CMBW1由Man，GlcN，Rha，GlcUA，Glc，Gal和Ara构成，摩尔比例为7.25∶0.17∶1.29∶0.23∶6.30∶11.08∶0.79；CMBW2由Man，GlcN，Gal和Ara组成，摩尔比例为2.40∶0.16∶2.92∶0.24；CMYW1由Man，GlcN，GlcUA和Glc组成，摩尔比例为0.59∶0.57∶0.45∶25.61。

由以上分析可知：CMBW1为含有少量GlcN，Rha，GlcUA 和Ara的半乳葡萄甘露聚糖，CMBW2为含有少量GlcUA和GlcN的半乳甘露聚糖，CMYW1为含有少量Man，GlcN和GlcUA的葡聚糖。

3种多糖的精细结构尚待进一步的甲基化分析和核磁共振波谱解析。

2.4 体内胆固醇逆向转运
与对照组相比，蛹虫草多糖可增加3H-胆固醇向C57 BL/6小鼠血液中转运的速度；在6 h时，中剂量组（50 mg·kg-1）和高剂量组（100 mg·kg-1）与对照组相比表现出显著性差异。

同时，蛹虫草多糖可促进3H-胆固醇由粪便排出，表现为粪便中放射活度的增加；以24 h内的粪便进行统计分析，可见中剂量组（50 mg·kg-1）和高剂量组（100 mg·kg-1）与对照组相比3H-胆固醇在粪便中的含量显著增加（图4）。

3 讨论
蛹虫草多糖是蛹虫草的主要活性成分之一，其与空白组比较，1）P＜0.05；2）P＜0.01；A.3H-胆固醇在小鼠血液中的分布百分比；B.3H-胆固醇在小鼠粪便中的分布百分比。

图4 蛹虫草多糖对C57 BL/6小鼠胆固醇逆向转运功能的影响
Fig.4 Effect of Cordyceps militaris polysaccharides on reverse cholesterol transport in C57 BL/6 mouse
价值逐渐被国内外学者认识与了解，近年来备受关注。

水提醇沉是常用的多糖制备方法，本研究中采用该法获得多糖的得率为8.55%，与之前的研究报道相近[14]，而且采用90%乙醇浓度获得了相对分子质量较小的多糖CMYW1。

本文采用阴离子交换柱色谱和凝胶渗透柱色谱法，获得3种高纯度的蛹虫草多糖，CMBW1，CMBW2和CMYW1，相对分子质量依次为772.1，20.9，13.2 kDa。

相对分子质量达772.1 kDa的多糖属于首次报道，先前研究所得蛹虫草多糖的相对分子质量一般为几万道尔顿[15-17]。

单糖组成分析结果与吴凤瑶等[16]研究结果相近，但与其他研究者的报道不同[16-17，19]，这可能是由蛹虫草的培养条件及多糖提取方法有关。

近年研究表明蛹虫草多糖具有降脂功效[7-8]，而胆固醇逆向转运是药物降脂作用的重要一环；本文对蛹虫草多糖的胆固醇逆向转运功能的初步研究结果显示：蛹虫草多糖中剂量组（50 mg·kg-1）和高剂量组（100 mg·kg-1）可显著增加3H-胆固醇向C57 BL/6小鼠血液中转运的速度，并显著促进3H-胆固醇经由粪便排出。

基于本研究的实验结果和胆固醇沉积与心血管疾病的相关理论背景，可以推测蛹虫草多糖具有一定的抗动脉粥样硬化的作用，相关实验正在进行中。

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Separation，purification and primary reverse cholesterol transport study of
Cordyceps militaris polysaccharide
GUO Shou-dong*，CUI Ying-jie，WANG Ren-zhong，WANG Ren-yuan，WU Wen-xue，MA Teng
（Key Laboratory of Atherosclerosis in Universities of Shandong，Institute of Atherosclerosis，
Taishan Medical University，Taian 271000，China）
[Abstract]The authors designed to separate，purify and determine the monosaccharide composition of the polysaccharide from Cordyceps militaris，and study its effect on reverse cholesterol transport in vivo by isotope tracing assay. Polysaccharides were separate and purify by ion exchange column Q-sepharoseTM Fast Flow and size exclusion column Sephacryl S200HR；the molecular weight and monosaccharide composition of the polysaccharides were determined by high performance gel permeation chromatography and high performance liquid chromatography coming with pre-column derivation，respectively. Finally，three purified polysaccharides CMBW1，CMBW2 and CMYW1 were obtained，their total carbohydrate contents were 87%，89%，95%，respectively；their protein contents were 6.5%，1.3%，2.8%，respectively；their molecular weights were 772.1，20.9 ，13.2 kDa，respectively；CMBW1 was composed of mannose，glucosamine，rhamnose，glucuronic acid，glucose，galactose and arabinose with a molar ratio of 7.25∶0.17∶1.29∶0.23∶6.30∶11.08∶0.79；CMBW2 was composed of mannose，glucosamine，galactose and arabinose with a molar ratio of 2.40∶0.16∶2.92∶0.24；CMYW1 was composed of mannose，glucosamine，glucuronic acid and glucose with a molar ratio of 0.59∶0.57∶0.45∶25.61. Polysaccharide at 50 mg·kg-1 could significantly improve the transport of 3H- cholesterol to blood and excretion from feces. All of the three purified polysaccharides CMBW1，CMBW2 and CMYW1 were heteropolysaccharide；and they could improve reverse cholesterol transport in vivo，the underlying mechanisms are being studied.
[Key words]Cordyceps militaris polysaccharide；separation and purification；monosaccharide composition；reverse cholesterol transport
doi：10.4268/cjcmm20141721。