血凝(HA)—血凝抑制(HI)试验操作要点

血凝(HA)—血凝抑制(HI)试验操作要点
黄艳羚;孙淑兰
【摘要】兽医实验室检测禽流感和鸡新城疫抗体采用血凝(HA)-血凝抑制(HI)试验.该试验有些因素会影响试验结果,是试验的关键环节,如配制1%鸡红细胞时其浓度的高低会影响抗体滴度的高低;4单位抗原的配制需要回滴正确;试验的反应时间和温度也要符合要求.只有掌握好试验的关键点,才能得出准确无误的试验结果.对该试验的操作要点及注意事项进行了介绍.
【期刊名称】《湖北畜牧兽医》
【年(卷),期】2016(037)012
【总页数】2页(P22-23)
【关键词】禽流感抗体检测;鸡新城疫抗体抗体检测;血凝(HA)-血凝抑制(HI)试验;操作要点
【作者】黄艳羚;孙淑兰
【作者单位】广西南宁市动物疫病预防控制中心,南宁 530001;广西南宁市动物疫病预防控制中心,南宁 530001
【正文语种】中文
【中图分类】S851.3
实验室检测禽流感及鸡新城疫抗体滴度采用血凝（HA）—血凝抑制（HI）试验，是利用了禽流感病毒、鸡新城疫病毒的血凝素能凝集鸡红细胞的特性。

现将HA－HI试验操作步骤及注意事项介绍如下，供参考。

1.1 阿氏液配制
称量葡萄糖2.05 g、柠檬酸钠0.80 g，柠檬酸0.055 g、氯化钠0.42 g，加蒸馏
水至100mL，加热溶解后调pH至6.1，高压灭菌，4℃保存备用。

1.2 1%鸡红细胞液的制备
因为每只鸡的血红细胞的结合性不一样，所以要取3～4只公鸡血，要求是SPF鸡，每3个月换一次鸡。

采血与等量阿氏液混合均匀，放入离心管中。

鸡红细胞的洗涤：将离心管中的血液经2 500 r／min离心5min，用吸管移去上清液及沉淀红
细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，用生理盐水配成1%红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5 d。

离心的时间、转速不一样，红血球压积不一样。

红血
球浓度低，检测出的抗体效价就低，反应时间变长。

红血球浓度高，检测出的抗体效价就高，会偏离正常值。

转速不能超过3 000 r／min，不然红细胞易破碎。

洗
红血球时需要用和稀释液一样的液体。

2.1 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）
在一次性微量反应板的1～12孔均加入25μL的生理盐水，吸取25μL抗原加入第一孔，混匀。

从第一孔倍比稀释至第11孔，从第11孔弃25μL，每孔再加入
25μL生理盐水，每孔均加入25μL 1%鸡红细胞悬液，振荡混匀，室温，25min
观察结果，使红细胞完全凝集的抗原最高稀释度为1个血凝单位。

2.2 血凝抑制（HI）试验（微量法）
4单位抗原配制：终点稀释倍数除以4即为含4 HAU的抗原的稀释倍数。

4单位
抗原在使用前最好做回滴试验，以确保配制的抗原正好为4单位抗原。

具体操作
方法如下：在微量反应板的1～6孔均加入25μL生理盐水，吸取25μL配好的4
单位抗原，分别加入第1孔和第2孔，混匀，从第2孔倍比稀释至第5孔，从第
5孔弃25μL，2～6孔再加入25μL生理盐水，1～6孔均加入25μL1%鸡红细胞
悬液，室温静置30min，判断结果。

将板倾斜，1～3孔红细胞全部凝集，第4孔
显泪滴状流淌，则配液正确。

调整抗原浓度，直到回滴正确。

配好的抗原使用时间不超过4 h。

4单位抗原配制是否正确，对试验结果影响很大。

抗原－20℃保存，用时恢复至室温。

抗原应分装，避免反复冻融，否则会降低效价。

在微量反应板的第1～11孔加入25μL生理盐水，第12孔加入50μL生理盐水。

吸取25μL待检血清加入第1孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25μL 弃去。

第1～11孔均加入4HAU混匀的抗原液25μL，室温静置30min，每孔加入25μL 1%的鸡红细胞悬液，混匀，室温静置30min。

结果判定：以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。

只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。

HI效价≤3log2判定HI试验阴性，HI效价＝4log2为可疑，HI效价≥5log2为阳性。

注意，稀释液的pH应在7.0～7.2，pH低时，看不见效价，pH大于7.8时，容易溶脱。

反应时，室温高于37℃时，血细胞易脱落，4℃以下会自凝。

温度24～25℃反应效果最好。

稀释溶液时，用10～100μL量程多道移液器，每孔反复吹吸6次，动作应均匀一致。

常用96孔V型板，一次性微量反应板，沉降快，清晰、易判。

用鸡红细胞检测鸭血清时，会出现非特异性凝集，最好用同源动物红血球。