细胞培养基本技术ppt课件
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切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科 手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再 用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使 组织块自然沉淀到管底，弃去上清
消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量）， 与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇 动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液， 用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱 中培养
（2）例如：滋养层细胞分离与培养：
（A）真空负压抽吸的早期绒毛组织在无菌条件下置于 冰浴PBS（含1 mM葡萄糖）中取回。
（B）在无菌条件下立即用无Ca2+和Mg2+的PBS漂洗1520次以除去血块。
（C）用解剖刀片从基膜上轻轻刮下绒毛，用剪刀剪碎 至1-2毫米左右。
（D）加入5 ％胰蛋白酶330μl(1：25)至10ml细胞悬液 中，4℃消化45min。勿动，静置，然后去上清。
第三章 细胞培养基本技术
况海斌
南昌大学医学院生理学教研室 生殖内分泌研究室
内容：
原代细胞分离、培养（酶消化法和组织块培养 法）。 细胞生长状况的观察。 培养细胞一代生长过程。 传代。 冻存与复苏。 细胞培养注意事项（如细胞污染）。
细胞培养的一些专业术语介绍（如 细胞株、系，上皮细胞型、成纤维细胞型）
（E）重新加入消化液37℃消化10min。勿动，静置，然 后去一半上清。加等体积Ham’s F12:DMEM 1:1(FD)培 养液（内含10 ％胎牛血清、1 mM丙酮酸钠和2 mM谷氨 酰胺）终止消化，吹打细胞悬液。
（F）再加入终浓度为15 IU/ml的DNA酶Ⅰ37℃消化10 min。吹打细胞呈悬浮状，经80目和150目细胞筛过滤， 1,000×rpm离心10 min收集细胞。
第一节 细胞原代培养
• 原代培养也叫初代培养，是从供体取得 组织细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养组织或细胞的特点：
• 1．组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生 很大变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反 映体内生长特性，是药物测试、细胞分化等实 验的很好对象；
• 2. 缺点是成分组成比较复杂，因而原代培养 细胞部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严 格的对比性实验研究，还需对细胞进行短期传 代后进行。
----ห้องสมุดไป่ตู้实验前点燃酒精灯，一切操作如安装吸管 帽、打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经 过烧灼进行。
3、常用消化试剂：
胰蛋白酶、胶原酶、蛋白水解酶、EDTA
4、原代细胞培养程序
• 1、取材 • 2、漂洗 • 3、剪切 • 4、消化 • 5、过滤 • 6、清洗 • 7、计数 • 8、接种
（1）、培养细胞的取材
（3）计数：
细胞浓度的计算：
Volume (体积) =長 x 寬 x 深度 = 1 mm x 1 mm x 0.1 mm = 0.1 mm3 = 1 x 10-4 cm3 (ml)
细胞密度(个/mL) = 4个大方格的细胞总数/4 ÷10-4
=4个大方格的细胞总数/4 ×104
• 1. 取材的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡
于培养液内放置于冰浴或40C冰箱。若组织块很大，应先将其切成 1cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过24小时，因放置时间长 或组织块太大都易造成细胞的死亡；
• 2. 取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养
液的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化 学试剂及有害药物如碘、汞等。从消化道及周围有坏死组织等有污染 因素存在的区域取材时，为减少污染，可用含500~1000单位/ml的青、 链霉素BSS液漂洗5~10分钟，或用10% 达克宁注射液冲洗浸泡10分钟 再作培养；
• 3. 取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及 坏死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于
少量培养液中；
原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有 75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超 净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出 子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎， 剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
------培养室的消毒
• 培养室每天用0.2%的新洁尔灭或2%~5%的来苏儿拖 洗地面一次（拖布专用），30瓦紫外灯管照射消毒 30~50分钟。
-------超净工作台的消毒
2、无菌培养操作注意事项：
• （为保证无菌，除实验所需物品需预先消毒外， 实验中还需保持无菌操作）。
-----工作台面上的用品要布局合理，原则上是 右手使用的东西置右侧，左手使用的东西置左 侧，酒精灯置中央；
12
4.5
1～3
1×106
24孔板
24
2
0.5～2
5×105
48孔板
48
1
0.25～1
一、原代培养的方法
• (一)、消化培养法 • (二) 、组织块培养法 • （三）、其它（如机械方法）
(一)、消化培养法
1、培养前的准备
------培养用品的消毒
• 根据所要进行的具体培养对象如组织块贴壁原代培 养、末梢血白细胞培养、传代培养等，准备培养所 需器械和物品，清点无误后进行清洗、包装和消毒 灭菌。
（G）重复离心洗涤二次，再次重悬细胞，细胞悬液经 1.25-2.5％BSA（FD配制）的密度梯度沉降1 h。
（H）收集淡黄色的细胞滋养层细胞，清洗一次，接种 于涂有I型胶原的24孔培养板中，于37℃，95 ％空气 和5 ％CO2条件下培养。
（I）所得细胞经免疫荧光染色cytokeratin 7阳性， vimentin 阴性。本方法所获得细胞滋养层细胞纯度约 为95%左右。
动物细胞工程的实验室基础
培养器皿
培养器皿特性
培养物备份
每孔面积 /cm2
每孔推荐 液体量/ml
预计的HeLa细胞产量
多孔板
微量滴定板
96
0.32
0.1
l×105
微量滴定板
144
表表033.--3332培培养养器器皿皿特特性性
0.1
1×105
4孔板
4
2
2
5×105
6孔板
6
9.6
2～4
2×106
12孔板
消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量）， 与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇 动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液， 用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱 中培养
（2）例如：滋养层细胞分离与培养：
（A）真空负压抽吸的早期绒毛组织在无菌条件下置于 冰浴PBS（含1 mM葡萄糖）中取回。
（B）在无菌条件下立即用无Ca2+和Mg2+的PBS漂洗1520次以除去血块。
（C）用解剖刀片从基膜上轻轻刮下绒毛，用剪刀剪碎 至1-2毫米左右。
（D）加入5 ％胰蛋白酶330μl(1：25)至10ml细胞悬液 中，4℃消化45min。勿动，静置，然后去上清。
第三章 细胞培养基本技术
况海斌
南昌大学医学院生理学教研室 生殖内分泌研究室
内容：
原代细胞分离、培养（酶消化法和组织块培养 法）。 细胞生长状况的观察。 培养细胞一代生长过程。 传代。 冻存与复苏。 细胞培养注意事项（如细胞污染）。
细胞培养的一些专业术语介绍（如 细胞株、系，上皮细胞型、成纤维细胞型）
（E）重新加入消化液37℃消化10min。勿动，静置，然 后去一半上清。加等体积Ham’s F12:DMEM 1:1(FD)培 养液（内含10 ％胎牛血清、1 mM丙酮酸钠和2 mM谷氨 酰胺）终止消化，吹打细胞悬液。
（F）再加入终浓度为15 IU/ml的DNA酶Ⅰ37℃消化10 min。吹打细胞呈悬浮状，经80目和150目细胞筛过滤， 1,000×rpm离心10 min收集细胞。
第一节 细胞原代培养
• 原代培养也叫初代培养，是从供体取得 组织细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养组织或细胞的特点：
• 1．组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生 很大变化，仍具有二倍体遗传性，最接近和反 映体内生长特性，是药物测试、细胞分化等实 验的很好对象；
• 2. 缺点是成分组成比较复杂，因而原代培养 细胞部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严 格的对比性实验研究，还需对细胞进行短期传 代后进行。
----ห้องสมุดไป่ตู้实验前点燃酒精灯，一切操作如安装吸管 帽、打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经 过烧灼进行。
3、常用消化试剂：
胰蛋白酶、胶原酶、蛋白水解酶、EDTA
4、原代细胞培养程序
• 1、取材 • 2、漂洗 • 3、剪切 • 4、消化 • 5、过滤 • 6、清洗 • 7、计数 • 8、接种
（1）、培养细胞的取材
（3）计数：
细胞浓度的计算：
Volume (体积) =長 x 寬 x 深度 = 1 mm x 1 mm x 0.1 mm = 0.1 mm3 = 1 x 10-4 cm3 (ml)
细胞密度(个/mL) = 4个大方格的细胞总数/4 ÷10-4
=4个大方格的细胞总数/4 ×104
• 1. 取材的组织最好尽快培养，若不能及时培养，可将组织浸泡
于培养液内放置于冰浴或40C冰箱。若组织块很大，应先将其切成 1cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过24小时，因放置时间长 或组织块太大都易造成细胞的死亡；
• 2. 取材时严格无菌操作。用预先消毒好的器皿和带有少量培养
液的培养瓶进行取材。所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化 学试剂及有害药物如碘、汞等。从消化道及周围有坏死组织等有污染 因素存在的区域取材时，为减少污染，可用含500~1000单位/ml的青、 链霉素BSS液漂洗5~10分钟，或用10% 达克宁注射液冲洗浸泡10分钟 再作培养；
• 3. 取材时要细心去除组织中的血液、结缔组织、脂肪及 坏死组织等。修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于
少量培养液中；
原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有 75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超 净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出 子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎， 剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
------培养室的消毒
• 培养室每天用0.2%的新洁尔灭或2%~5%的来苏儿拖 洗地面一次（拖布专用），30瓦紫外灯管照射消毒 30~50分钟。
-------超净工作台的消毒
2、无菌培养操作注意事项：
• （为保证无菌，除实验所需物品需预先消毒外， 实验中还需保持无菌操作）。
-----工作台面上的用品要布局合理，原则上是 右手使用的东西置右侧，左手使用的东西置左 侧，酒精灯置中央；
12
4.5
1～3
1×106
24孔板
24
2
0.5～2
5×105
48孔板
48
1
0.25～1
一、原代培养的方法
• (一)、消化培养法 • (二) 、组织块培养法 • （三）、其它（如机械方法）
(一)、消化培养法
1、培养前的准备
------培养用品的消毒
• 根据所要进行的具体培养对象如组织块贴壁原代培 养、末梢血白细胞培养、传代培养等，准备培养所 需器械和物品，清点无误后进行清洗、包装和消毒 灭菌。
（G）重复离心洗涤二次，再次重悬细胞，细胞悬液经 1.25-2.5％BSA（FD配制）的密度梯度沉降1 h。
（H）收集淡黄色的细胞滋养层细胞，清洗一次，接种 于涂有I型胶原的24孔培养板中，于37℃，95 ％空气 和5 ％CO2条件下培养。
（I）所得细胞经免疫荧光染色cytokeratin 7阳性， vimentin 阴性。本方法所获得细胞滋养层细胞纯度约 为95%左右。
动物细胞工程的实验室基础
培养器皿
培养器皿特性
培养物备份
每孔面积 /cm2
每孔推荐 液体量/ml
预计的HeLa细胞产量
多孔板
微量滴定板
96
0.32
0.1
l×105
微量滴定板
144
表表033.--3332培培养养器器皿皿特特性性
0.1
1×105
4孔板
4
2
2
5×105
6孔板
6
9.6
2～4
2×106
12孔板