IBDV超强毒株NJ09株在DF-1细胞上的增殖工艺
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IBDV超强毒株NJ09株在DF-1细胞上的增殖工艺
揭鸿英;朱亚露;毕志香;赵阳;何家惠;于漾;侯继波
【摘要】为完善现有鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,简称IBDV)灭活疫苗生产工艺,形成适用于批量生产的抗原制备技术流程,对IBDV NJ09株病毒在DF-1细胞上的增殖工艺进行研究.通过培养基筛选、血清最适浓度比较、接毒量测定等相关试验,明确了规模化生产工艺,即将DF-1细胞以1:3、1:4比例分瓶(0.85×105~1.2×105个/mL)传代培养,细胞生长36~48h后按体积分数0.1%~0.2%接种IBDV NJ09株毒种,接毒后36~48h收毒;同时筛选出适宜IBDV NJ09株病毒增殖的MD611培养基及小牛血清,既可以满足高滴度抗原增殖的生长需要,又降低了疫苗生产成本,形成了适用于规模化生产的抗原接种、收获、处理工艺技术指标,按上述工艺所增殖的IBDV NJ09株抗原病毒含量稳定在
108.0TCID50/mL以上,可满足含IBDV组分的系列灭活疫苗生产需要,为该病毒灭活疫苗大规模生产提供了技术支持.
【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2017(045)017
【总页数】4页(P152-155)
【关键词】鸡传染性法氏囊病毒;NJ09株;DF-1细胞;生产工艺
【作者】揭鸿英;朱亚露;毕志香;赵阳;何家惠;于漾;侯继波
【作者单位】江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省
农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州225009
【正文语种】中文
【中图分类】S858.315.3
DF-1细胞是一种可以持续传代的鸡胚成纤维细胞系,由美国明尼苏达大学的Himly等于1998年用10日龄EV-0鸡胚胎制备而成[1]。
与传统的鸡成纤维(chicken embryo fibroblast,简称CEF)细胞相比,该细胞系在产业化生产中有着明显的优势,目前已广泛应用于禽类病毒的增殖研究及疫苗的规模化生产中[2-3],其中在鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,简称IBDV)的增殖研究上也有相关报道[4-9]。
IBDV是鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease)的致病病原,鸡感染该病毒不仅会引起雏鸡发病死亡,更重要的是会破坏雏鸡法氏囊组织,导致免疫抑制,诱发机体对其他病原的敏感性,威胁禽养殖业的健康发展[10-13]。
在IBDV的疫苗研究中,近年来也有利用传代细胞培养病毒的报道,但由于IBDV包含多个株系,受毒源株系差别、培养体系等因素的影响,IBDV在DF-1等传代细胞上的增殖条件也各不相同[14-18]。
为提高IBDV NJ09株在DF-1细胞上增殖的病毒含量,同时考虑大规模培养的生产成本,笔者所在实验室对IBDV NJ09株细胞适应毒在DF-1细胞上的增殖进行不同条件的筛选,拟确定IBDV NJ09株在DF-1细胞上的最佳生产工艺。
1.1 材料
25 cm2细胞瓶、细胞计数板、96孔细胞培养板,均购自美国Corning Coster公
司;DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、小牛血清、胎牛血清,均
购自GIBCO公司;MD611培养基,购自北京清大天一科技有限公司;DF-1细胞,从美国ATCC公司购入,由国家兽用生物制品工程技术研究中心传代、建库和保存;鸡传染性法氏囊病毒NJ09株细胞适应毒F3代,病毒含量为108.0
TCID50/mL(TCID50表示半数组织感染量),由笔者所在实验室培育和保存。
1.2 DF-1细胞传代比例筛选
选择细胞生长良好、致密度为95%以上的25 cm2细胞瓶,弃去培养液,用0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)轻轻荡洗2次,加入0.1%胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)液2 mL进行消化。
当细胞面呈毛玻璃状,弃去消化液,利用瓶内残留的0.5 mL
消化液继续消化,当细胞面出现松散脱落时,加入不同比例含5%小牛血清的
MD611培养液轻轻吹打,悬浮细胞,进行细胞计数,使细胞生长液中DF-1细胞数分别为0.5×105~0.7×105个/mL(传代比例1 ∶6)、0.67×105~0.83×105个/mL(传代比例1 ∶5)、0.85×105~1.0×105个/mL(传代比例1 ∶4)、1.0×105~1.2×105个/mL(传代比例1 ∶3),在25 cm2细胞瓶中加入10 mL细胞悬液,在37 ℃条件下培养,观察细胞的贴壁情况、生长状态及细胞的密度。
1.3 IBDV NJ09株在DF-1细胞上的最佳接毒量的确定
取已长满单层的25 cm2细胞瓶12个,分4组,每组3个重复,分别按0.1%、0.2%、0.5%、1.0%接毒量(体积分数)接毒。
接毒后,观察细胞病变出现情况,待80%以上细胞出现病变时,收获细胞毒。
收获的细胞毒反复冻融3次后,12 000
r/min 离心 10 min,取上清测定病毒含量。
1.4 不同营养液对扩繁DF-1细胞的影响
DF-1细胞分别用3种细胞生长液(DMEM+5%小牛血清、DMEM/F12+5%小牛
血清、MD611+5%小牛血清)连传3代后,消化细胞,进行细胞计数。
1.5 不同营养液扩繁DF-1细胞对IBDV增殖的影响
取分别用3种细胞生长液(DMEM+10%小牛血清、DMEM/F12+10%小牛血清、MD611+5%小牛血清)连传细胞长满单层的25 cm2细胞瓶9个,3个1组,每
个细胞瓶按 0.1%(体积比)接毒。
第1组维持液为DMEM培养基(DMEM+2%小牛血清),第2组维持液为DMEM/F12培养基(DMEM/F12+2%小牛血清),第3组
维持液为MD611培养基(MD611+2%小牛血清)。
接毒后观察细胞病变情况,各
组均在接毒后细胞病变数量超过80%时收毒,收获的细胞毒反复冻融3次后,12 000 r/min离心10 min,取上清测定病毒含量。
1.6 不同血清对IBDV增殖的影响
取已长满单层细胞的25 cm2细胞瓶6个,3个1组,按 0.1%(体积比)接毒。
第
1组维持液为含2%小牛血清的培养基,第2组为含2%胎牛血清的培养基。
接毒
后观察细胞病变情况,各组均在接毒后细胞病变数量达到80%以上时收毒,-20 ℃冻存,12 000 r/min离心10 min,取上清测定病毒含量。
1.7 IBDV收毒时冻融次数对病毒含量的影响
取已长满单层细胞的25 cm2细胞瓶6个,3个1组。
按0.1%(体积比)接毒。
接
毒后观察细胞病变情况,当细胞病变数量超过80%时收毒,第1组将所取的3个
方瓶细胞毒悬液混匀,反复吹打,不冻融,收获病毒液。
第2组将细胞置于-20 ℃ 冻融,分别在冻融1、2、3次时取样。
所有样品经 12 000 r/min 离心10 min,
取上清测定病毒含量。
1.8 毒价测定方法
已长满单层细胞的96孔细胞板,弃去培养液,每孔用PBS洗涤1次。
将病毒用
无血清的培养液作10倍系列稀释,从最低稀释度的病毒液开始接种细胞,每个稀
释度接4个孔,每孔100 μL,在37 ℃ CO2培养箱中吸附1 h之后,每孔加入100 μL维持液(血清终浓度为2%)。
放入37 ℃ CO2培养箱中培养,每天观察并
记录细胞病变情况,连续观察7 d,计算TCID50。
2.1 DF-1细胞传代比例筛选
由表1可以看出,将DF-1细胞按1 ∶3~1 ∶6不同比例分瓶传代,在一定时间
内均能长成致密单层。
但随着分瓶比例的加大,长成致密单层的时间延长。
DF-1
细胞按1 ∶3、1 ∶4 比例分瓶传代时,接种后24~48 h能长成致密单层,培养
48 h 时细胞数较多;而按1 ∶5~1 ∶6分瓶培养48 h细胞数少于1 ∶3、1 ∶4
比例分瓶试验组,且于接种后60~84 h才长成致密单层。
因此,以1 ∶3、1 ∶4的传代比例培养36~48 h 为最佳。
2.2 IBDV在DF-1细胞上的最佳接毒量的确定
IBDV NJ09株在DF-1细胞上按0.5%~1.0%的量接毒,细胞在接毒后24 h出现病变,24~36 h细胞全部脱落,由表2可见,接种量0.5%~1.0%条件下,收毒
时间为28~30 h,病毒含量为107.4~107.8 TCID50/mL。
按0.1%~0.2% 的量接毒,细胞在接毒后24~36 h开始出现病变,36~48 h 80%的细胞出现病变,
病毒含量为108.0~108.2 TCID50/mL。
因此,按0.1%~0.2%接毒量接毒时,36~48 h收毒的病毒含量最高。
2.3 不同营养液对DF-1细胞增殖的影响
由表3可知,培养48 h时,含DMEM培养基的营养液中的细胞数为67万个/mL,DMEM/F12培养基中的细胞数为70万个/mL,而MD611培养基中的细胞数为100万个/mL,高于另2种培养基;在生产成本上,MD611培养基增殖DF-1细胞的生产成本明显低于DMEM、DMEM/F12培养基,因此MD611培养基是经
济又适宜的DF-1细胞培养基。
2.4 不同营养液对IBDV增殖的影响
由表4可知,3种营养液中,含DMEM培养基的营养液中IBDV的增殖效价最低,病毒含量为107.67 TCID50/mL,而含DMEM/F12、MD611培养基的营养液中IBDV病毒含量分别为108.20、108.27 TCID50/mL,两者IBDV的增殖量相当,
而在生产成本上,DMEM/F12生产成本大约是MD611的3倍(表3),因此
MD611是一种适宜IBDV NJ09株病毒在DF-1上增殖的培养基。
2.5 不同血清对IBDV增殖的影响
利用不同血清培养IBDV NJ09株病毒的3次试验结果显示,小牛血清中IBDV NJ09株病毒增殖后的含量为108.10~108.20 TCID50/mL,胎牛血清中IBDV NJ09株病毒增殖后的含量为108.20~108.30 TCID50/mL,但胎牛血清比小牛血清价格高(表5)。
因此可见,选择小牛血清的生产成本更低。
2.6 IBDV收毒时不同冻融次数对病毒含量的影响
由表6可知,细胞冻融次数对 IBDV细胞毒含量的影响较小,不冻融的病毒液病毒含量为108.0TCID50/mL;冻融1次、冻融2次病毒含量均为108.1
TCID50/mL;冻融3次病毒含量为108.2 TCID50/mL。
但在具体操作时,不冻融往往会因少数细胞未脱壁而导致收毒不完全,但冻融后无此问题,因此推荐收毒时进行冻融操作。
DF-1作为一种重要的禽传代细胞,目前已在多种禽病毒增殖研究中被应用,如IBDV、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒等[19-20]。
笔者所在实验室前期已经驯化获得1株DF-1细胞适应毒——IBDV NJ09株,基于该细胞毒,本研究对其在DF-1细胞上进行增殖培养时的接毒量、营养液、血清、收毒方法等方面进行了条件优化,为进一步完善该毒株的疫苗生产工艺提供支持。
从不同分瓶传代比例看,DF-1细胞按1 ∶3~1 ∶6传代,细胞都能长成单层,但长成单层需要的时间不同。
因此可以根据不同的目的,选择不同的分瓶比例。
当需要接毒时,可以选择1 ∶3~1 ∶4的比例传代,细胞在培养24~48 h时可以长成致密单层。
如果仅是维持细胞的传代需要,可以选择1 ∶5~1 ∶6的比例分瓶,这样既保存了细胞,又减轻了工作量。
不同营养液对DF-1细胞的增殖结果显示,DMEM、DMEM/F12培养基培养细胞
48 h,细胞数约增殖2倍,用MD611培养DF-1 48 h后,细胞数增殖3倍左右,而且MD611价格便宜,仅为DMEM价格的1/2左右、DMEM/F12价格的1/3
左右。
病毒接毒量研究结果显示,IBDV NJ09株在DF-1细胞上按1.0%的接毒量接毒,毒价并不是最高,这一结果说明了1.0%的接毒量过大,导致细胞病变出现过早,毒价亦未因接种量的增加而更高。
病毒接毒量不是越大越好,细胞接毒量太大会造成细胞病变提前,导致细胞迅速圆缩脱落,毒价反而不高;而接毒量过少时又会造成细胞病变出现延迟,细胞衰老、状态差也会影响病毒增殖的毒价,前人研究IBDV在细胞上的增殖时也有类似的发现[21-22]。
最佳接毒量应该用每个细胞的
病毒感染复数(MOI)表示更科学,而本试验中,由于细胞培养工艺比较成熟,细胞数也比较稳定,且毒种的病毒含量是稳定的,故接毒量用占维持液的百分比表示,在具体操作中更便捷。
不同血清对IBDV增殖影响的研究结果显示,胎牛血清中IBDV NJ09株的病毒增
殖后的含量比小牛血清略高,而成本比小牛血清高300元/L,结合生产实际,选
择性价比高的小牛血清。
IBDV收毒时,冻融次数对病毒含量影响的研究结果显示,不冻融虽然对病毒含量影响不大,但有一部分细胞未脱壁,不能完全收清,而冻融1、2次后少量未脱璧的细胞也能脱落,利于完全收获。
通过系列试验对DF-1的培养及IBDV NJ09株细胞毒生产工艺条件进行了研究,
确定了培养基及血清,同时制定了适用于规模化生产的抗原接种、收获、处理工艺技术指标:(1)DF-1细胞在传代时,以1 ∶3、1 ∶4比例传代,培养36~48 h后能长成致密单层,适合接毒;(2)选用MD611培养基+2%小牛血清浓度维持液增
殖IBDV病毒,既可以确保增殖抗原的高滴度,又降低了生产成本;(3)IBDV
NJ09株最适接毒量为0.1%~0.2%(体积分数),接毒时间为细胞生长36~48 h后,
收毒时间为接毒36~48 h(80%以上细胞出现细胞病变)后,可确保病毒含量不低于108.0 TCID50/mL;(4)IBDV NJ09株在DF-1细胞上增殖收毒时的冻融次数,对抗原病毒含量影响不明显,为确保病毒收获完全,建议选择冻融1~2次。
[1]Himly M,Foster D N,Bottoli I,et al. The DF-1 chicken fibroblast cell line:transformation induced by diverse oncogenes and cell death resulting from infection by avian leukosis viruses[J]. Virology,1998,
248(2):295-304.
[2]Lee C W,Jung K,Jadhao S J,et al. Evaluation of chicken-origin (DF-1) and quail-origin (QT-6) fibroblast cell lines for replication of avian influenza viruses[J]. Journal of Virological Methods,2008,153(1):22-28.
[3]Maas R,van Zoelen D,Oei H,et al. Replacement of primary chicken embryonic fibroblasts (CEF) by the DF-1 cell line for detection of avian leucosis viruses[J]. Biologicals,2006,34(3):177-181.
[4]Hui R K,Leung F C. Differential expression profile of chicken embryo fibroblast DF-1 cells infected with cell-adapted infectious bursal disease virus[J]. PLoS One,2015,10(6):e0111771.
[5]Rekha K,Sivasubramanian C,Chung I M,et al. Growth and replication of infectious bursal disease virus in the DF-1 cell line and chicken embryo fibroblasts[J]. Biomed Res Int,2014,2014:1-6.
[6]Wang Y Q,Qi X L,Gao H L,et al. Comparative study of the replication of infectious bursal disease virus in DF-1 cell line and chicken embryo fibroblasts evaluated by a new real-time RT-PCR[J]. Journal of Virological Methods,2009,157(2):205-210.
[7]Yip C W,Hon C C,Zeng F,et al. Cell culture-adapted IBDV uses
endocytosis for entry in DF-1 chicken embryonic fibroblasts[J]. Virus Research,2012,165(1):9-16.
[8]沈佳,姜北宇,章振华,等. 鸡传染性法氏囊病病毒BJQ902株在悬浮培养DF-1细胞上的增殖特性研究[J]. 中国家禽,2016,38(1):16-20.
[9]沈佳,章振华,李林,等. 鸡传染性法氏囊病病毒BJQ902株对三种传代细胞敏感性的比较研究[J]. 中国家禽,2016,38(16):17-21.
[10]Cho Y,Edgar S A. Characterization of the infectious bursal agent[J]. Poultry Science,1969,48(6):2102-2109.
[11]Faragher J T,Allan W H,Cullen G A. Immunosuppressive effect of the infectious bursal agent in the chicken[J]. Nature:New Biology,1972,237(73):118-119.
[12]Li K,Courtillon C,Guionie O,et al. Genetic,antigenic and pathogenic characterization of four infectious bursal disease virus isolates from China suggests continued evolution of very virulent viruses[J]. Infection,Genetics and Evolution,2015,30:120-127.
[13]Sharma J M,Kim I J,Rautenschlein S,et al. Infectious bursal disease virus of chickens:pathogenesis and immunosuppression[J]. Developmental and Comparative Immunology,2000,24(2/3):223-235.
[14]Lu Z,Zhang L Z,Wang N,et al. Naturally occurring reassortant infectious bursal disease virus in northern China[J]. Virus Research,2015,203:92-95.
[15]Wang Y S,Wang Z C,Tang Y D,et al. Comparison of four infectious bursal disease viruses isolated from different bird species[J]. Archives of Virology,2007,152(10):1787-1797.
[16]高立,李凯,祁小乐,等. 三株传染性法氏囊病病毒超强毒株全基因组的克隆与序列分析[J]. 中国兽医科学,2014,44(9):887-894.
[17]孙晓媛,周继勇,廖敏. 5株传染性囊病病毒超强毒株的分离与鉴定[J]. 中国
兽医杂志,2014,50(11):21-23.
[18]詹丽娥,陆冰洋,刘华栋,等. 鸡传染性法氏囊病超强毒株的分子鉴定[J]. 华北农学报,2013,28(3):234-238.
[19]刘玉鹏,赖汉漳,李延鹏,等. 马立克氏疫苗病毒在鸡传代细胞上的培养工艺[J]. 中国兽医学报,2014,34(8):1244-1247,1252.
[20]史爱华,姜北宇,沈佳,等. 3株H9亚型禽流感病毒在3种传代细胞系上增殖效果研究[J]. 黑龙江畜牧兽医,2013(21):111-113.
[21]章振华,李林,景小冬,等. 鸡传染性法氏囊病病毒BJQ902株在DF-1细胞系上增殖工艺研究[J]. 中国畜牧兽医,2016,43(10):2775-2779.
[22]王永生,周欣,杨霞,等. 鸡传染性法氏囊病毒在DF-1细胞系上繁殖特性研究[J]. 河南农业大学学报,2011,45(6):662-667.
【相关文献】
[1]Himly M,Foster D N,Bottoli I,et al. The DF-1 chicken fibroblast cell line:transformation induced by diverse oncogenes and cell death resulting from infection by avian leukosis viruses[J]. Virology,1998,248(2):295-304.
[2]Lee C W,Jung K,Jadhao S J,et al. Evaluation of chicken-origin (DF-1) and quail-origin (QT-6) fibroblast cell lines for replication of avian influenza viruses[J]. Journal of Virological Methods,2008,153(1):22-28.
[3]Maas R,van Zoelen D,Oei H,et al. Replacement of primary chicken embryonic fibroblasts (CEF) by the DF-1 cell line for detection of avian leucosis viruses[J]. Biologicals,2006,34(3):177-181.
[4]Hui R K,Leung F C. Differential expression profile of chicken embryo fibroblast DF-1 cells infected with cell-adapted infectious bursal disease virus[J]. PLoS One,2015,10(6):e0111771.
[5]Rekha K,Sivasubramanian C,Chung I M,et al. Growth and replication of infectious
bursal disease virus in the DF-1 cell line and chicken embryo fibroblasts[J]. Biomed Res Int,2014,2014:1-6.
[6]Wang Y Q,Qi X L,Gao H L,et al. Comparative study of the replication of infectious bursal disease virus in DF-1 cell line and chicken embryo fibroblasts evaluated by a new real-time RT-PCR[J]. Journal of Virological Methods,2009,157(2):205-210.
[7]Yip C W,Hon C C,Zeng F,et al. Cell culture-adapted IBDV uses endocytosis for entry in DF-1 chicken embryonic fibroblasts[J]. Virus Research,2012,165(1):9-16.
[8]沈佳,姜北宇,章振华,等. 鸡传染性法氏囊病病毒BJQ902株在悬浮培养DF-1细胞上的增殖特性研究[J]. 中国家禽,2016,38(1):16-20.
[9]沈佳,章振华,李林,等. 鸡传染性法氏囊病病毒BJQ902株对三种传代细胞敏感性的比较研
究[J]. 中国家禽,2016,38(16):17-21.
[10]Cho Y,Edgar S A. Characterization of the infectious bursal agent[J]. Poultry Science,1969,48(6):2102-2109.
[11]Faragher J T,Allan W H,Cullen G A. Immunosuppressive effect of the infectious bursal agent in the chicken[J]. Nature:New Biology,1972,237(73):118-119.
[12]Li K,Courtillon C,Guionie O,et al. Genetic,antigenic and pathogenic characterization of four infectious bursal disease virus isolates from China suggests continued evolution of very virulent viruses[J]. Infection,Genetics and Evolution,2015,30:120-127.
[13]Sharma J M,Kim I J,Rautenschlein S,et al. Infectious bursal disease virus of chickens:pathogenesis and immunosuppression[J]. Developmental and Comparative Immunology,2000,24(2/3):223-235.
[14]Lu Z,Zhang L Z,Wang N,et al. Naturally occurring reassortant infectious bursal disease virus in northern China[J]. Virus Research,2015,203:92-95.
[15]Wang Y S,Wang Z C,Tang Y D,et al. Comparison of four infectious bursal disease viruses isolated from different bird species[J]. Archives of Virology,2007,152(10):
1787-1797.
[16]高立,李凯,祁小乐,等. 三株传染性法氏囊病病毒超强毒株全基因组的克隆与序列分析[J].
中国兽医科学,2014,44(9):887-894.
[17]孙晓媛,周继勇,廖敏. 5株传染性囊病病毒超强毒株的分离与鉴定[J]. 中国兽医杂志,2014,50(11):21-23.
[18]詹丽娥,陆冰洋,刘华栋,等. 鸡传染性法氏囊病超强毒株的分子鉴定[J]. 华北农学报,2013,28(3):234-238.
[19]刘玉鹏,赖汉漳,李延鹏,等. 马立克氏疫苗病毒在鸡传代细胞上的培养工艺[J]. 中国兽医学报,2014,34(8):1244-1247,1252.
[20]史爱华,姜北宇,沈佳,等. 3株H9亚型禽流感病毒在3种传代细胞系上增殖效果研究[J]. 黑龙江畜牧兽医,2013(21):111-113.
[21]章振华,李林,景小冬,等. 鸡传染性法氏囊病病毒BJQ902株在DF-1细胞系上增殖工艺研究[J]. 中国畜牧兽医,2016,43(10):2775-2779.
[22]王永生,周欣,杨霞,等. 鸡传染性法氏囊病毒在DF-1细胞系上繁殖特性研究[J]. 河南农业大学学报,2011,45(6):662-667.
中图分类号: S858.315.3。