转座子的插入突变及转座子的应用

受体也被交错切割
图 23-42 交换结构经剪切释放 后导致非复制型转座子插入到靶 DNA 中，DR 包在两侧，供体留 下了一个双链缺口。
供体被释放
Tn 连接到靶上
图 23-43 Tn 的两条链先后被切割，然后转座子与切开 的靶位点连接。
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（二）复制型 转座
特征：
1、转座后原来 位置上的转 座因子保持 不变；
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一、转座子的发现
• 现在的研究说明，在生物界中转座子 是普 遍存在的，并认为在生物的遗传进化方面
有重要作用。转座子从一个位置转座到 另一个位置的转入和切出过程，改变了
原有基因的结构和排序，从而产生了突 变。
• 目前生物体中所发现的10％的突变是由于 它抑制其他基因的表达而形成的。
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1、基因的标定
若要获得引起新突变的未知基因，则用 随机诱变策略(非目的诱变)，即将带有功能 性转座因子的显性纯合系植株与不带转座因 子的同种植株杂交，产生的F1子代再自交， 在F2代中就可筛选到转座子随机插人引起 突变表型的突变株，然后选择感兴趣的新突 变株进行研究。
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2、构建突变体库
转座子具有可选择的抗性标记而容易在体 内鉴定突变，经转座子诱变的突变子含有 已知的DNA片段，可以通过转座子序列的 杂交来鉴定突变基因的位置，经转座子诱 变的突变体具有高度的极性，使得被诱变 的基因以及同一操纵子内的下游基因完全 丧失功能。
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2、构建突变体库
正因为以上转座子的特征，转座子才被广
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反向PCR法
• 该方法的操作步骤为，提取转座子插 入形成的突变体的染色体，用适宜的 限制性内切酶消化后，用连接酶进行酶
切片段的分子内自连，然后用一对位于
转座子上的外向型引物进行PCR 扩增， PCR产物直接测序或克隆在T载体上测 序， 获取转座子插入位点周围序列的 信息。
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转座子可以在不同复制子之间转移，以非 正常重组方式从一个位点插入到另外一个 位点，对新位点基因的结构与表达产生多 种遗传效应。
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一、转座子的发现
• 转座子是1951年美国玉米遗传育种学家 Mcclintock最早发现的，是针对玉米籽粒 中色斑不稳定现象而提出来的。
• 当时这是一个新概念，它突破了以往人们 认为基因在染色体上的位置是固定不变的 认识，所以一开始并不被大家接受，直到 1967年在大肠杆菌(E．coli)的半乳糖操纵 子研究中发现了这类插入序列，才得以被 普遍认同。
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六、转座子的应用
❖ 基因的标定
❖构建突变体库 ❖ 鉴别菌株及群体多样性 ❖生态环境污染的生物修复 ❖转基因生物的克隆
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1、基因的标定
所要分离和克隆的基因不同，在定位 和标定时所用的方法也不同。若要获得 感兴趣的己知目的基因，则采用目的诱变
策略，即用一个稳定遗传的隐性纯合体与 一个带有活跃转座子的显性纯合体杂交， 可以在F1代标定目的基因。
泛应用于构建插入突变体库，现已成为研 究基因功能的重要手段之一。目前研究和 应用得较多的有Tn10、Tn5、Tn3和Mu噬 菌体 。
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3、鉴别菌株及群体多样性
转座子通常限制性地分布于特定的真菌菌
株或群体中，可以作为特定菌株的诊断工 具，已用于丝状真菌群体多样性分析。在 医药工业方面已用于有益菌株的鉴别，
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（4）外显子改组
❖ 当两个转座子被同一转座酶识别而整合到染 色体的邻近位置时，则位于它们之间的序列 有可能被转座酶作用而转座，如果这个DNA 序列中含有外显子，则被切离并可能插入另 一基因组中，这种效应称为外显子改组 （exon shuffling）。外显子改组将导致基 因组中新基因的产生。
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二、转座子的分类
（一）简单转座子（插入序列，IS）
结构特征：
1、含短的末端反向重复序列（ 15-25bp）; 2、含编码转座酶的基因; 3、靶位点存在 5-9 bp 的短正向重复序列。
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二、转座子的分类
（二）复合转座子 结构特征： (1)中间区域含编码转座酶以外的标记基因； (2)两端具有插入序列； (3)两末端是反向重复序列； (4)靶位点存在短正向重复序列。
转座子的插入突变及转座子的应 用
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内容提要
一、转座子的发现
二、转座子的分类 三、转座子的转座机制 四、转座子的遗传效应 五、转座子插入位点的鉴定方法 六、转座子的应用
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一、转座子的发现
转座子（transponson,简称Tn）, 又称易 位子，是指存在于染色体DNA上可以自主 复制和位移的一段DNA序列。
2、转座过程中 有一共整合 体。
Tn 靶
单链交错切割从 3’ 末端复 产生共合体共合体 重组
转座子被切开的 末端和靶被切开 的末端连接
交叉结构(单链转移复合
图 23－41 转座模型。Mu 转座产生交换结构，此结构通过复制产生共合体， 共合体中的转座子之间发生交换产生 2 个重组子。
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在植物病理学方面已用于鉴别特定的病 原。
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4、生态环境污染的生物修复
由于基因的可变性及转座子的遗传调控， 许多微生物能够利用人工合成的化学物 质，与微生物分解代谢相关的基因往往 与插入元件相连。当环境污染时，转座 子转移频率提高，增加了微生物种群的生
物降解潜力。
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五、转座子插入位点的鉴定方法
质粒拯救法
反向PCR法
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质粒拯救法
该方法的操作步骤为，将转座子插入后形 成的突变体的染色体或质粒DNA用限制性内 切酶消化，凝胶电泳分离后，以转座子上的片 段为探针， 进行 Southern杂交， 确定转座 子插入位点所在片段的大小， 即在电泳分离 条带上所处的位置。
5、转基因生物的克隆
在细胞工程中，转座子可作为有力的工具 和基因载体系统用于克隆转基因生物。基 因组插入质粒P因子已成功克隆转基因果蝇。 通常认为，转座子的插入能引起新的突变 体形成，但其副作用也许会抵消由转基因 提供的任何优势，以可移动DNA片段作为 载体尚存在转移基因结果的不稳定现象和 内源跳跃基因的相互影响。因此，这方面 的应用还处于探索阶段。
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三、转座子的转座机制
据转座子的移动机制，转座可分为：
（一）复制型转座
（二）非复制型转座
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（一）非复 制型转座
特征
1、断裂和重接 反应使靶重 构。
2、供体保持 裂缺。
3、不形成共
整合体。
转座酶结合在 Tn 两端 转座子末端被交错剪切
+
另一条链也被切
四、转座的遗传学效应
❖ （1）插入突变失活或改变基因表达的模 式。
插入突变失活是转座的最直接效应，但 转座也可以通过干扰宿主基因与其调控元件 之间的关系或改变DNA的结构而影响基因的 表达。
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四、转座的遗传学效应
（2）插入位置上出现新的基因。
（3）改变染色体结构。（见下图）
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然后将这一部分DNA回收， 连接在如 pUC18等克隆载体上，转化大肠杆菌， 并根 据一定的基因标记筛选克隆有转座子插入位点 的片段的菌株。
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质粒拯救法
质粒拯救法是转座子应用于分子生物学研究后 应用最广泛的转座子插入位点周围序列鉴定的方 法。但这种方法实验周期比较长， 操作相对繁琐， 为保留选择标记， 有时适宜的限制性内切酶的选 取非常困难。对于一个突变体中有多处转座子插 入的研究以及需要鉴定的突变体数量众多的研究 而言， 这种方法不是一个理想方法。