电针联合补肾活血方对多囊卵巢大鼠围着床期子宫内膜组织形态学及ER、PR蛋白的影响

电针联合补肾活血方对多囊卵巢大鼠围着床期子宫内膜组织形
态学及ER、PR蛋白的影响
姜朵生;吴献群;吴松;杨会生;陈茜;鲍成
【摘要】目的:观察电针联合补肾活血方对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠围着床期子宫内膜形态学及ER、PR蛋白的影响.方法:将70只大鼠分为正常组(G)、模型组(M)、克罗米芬组(CC)、克罗米芬+补佳乐组(CC+ PVG)、克罗米芬+电针组(CC+A)、克罗米芬+补肾活血方组(CC+M)和克罗米芬+针药结合组(CC+M+A),每组10只.均于80日龄起进行干预,连续治疗5天.治疗结束后,各组于下午6:00与雄鼠按2:1比例合笼,次日早8:00查阴道涂片,以发现精虫者记为妊娠第1天(D1),于妊娠D4、D5下午4:00称重.电镜下观察饱饮突,免疫组化检测ER、PR蛋白.结果:子宫内膜组织形态学上,CC+M+A纽子宫内膜发育分化程度最好;子宫内膜成熟度及胞饮突情况比较:正常组与CC+M+A组之间无明显差异(_P＞0.05),两组与CC +A、CC +M组比较明显升高,有统计意义(P＜0.05),与CC+ PVG、模型组、CC 组比较有显著差异(P＜0.01).各组ER、PR免疫组化比较:正常组、CC+M+A组都有阳性表达,正常组与CC+M+A组之间无明显差异(P＞0.05),两组与CC +A、CC +M、CC+PVG组比较明显升高,有统计意义(P＜0.05),与模型组、CC组比较有显著差异(P＜0.0l).结论:在围着床期,电针、补肾活血方结合克罗米芬治疗多囊卵综合征与正常子宫内膜发育成熟度最好,这与该治疗方法提高子宫内膜上ER、PR蛋白表达有关.%Objective:To observe the effect on the endometrial morphology and ER,PR protein around the time of implantation of PCOS rats by electroacupuncture combined with Bushen Huoxue
prescription.Methods:Seventy SD rats were divided into normal group (g),model group (m),clomiphene citrate group (CC),CC +PGV group (CC +
PVG),clomiphene citrate + EA group (CC + A),clomiphene plus Bushen Huoxue prescription group (CC + M),clomiphene citrate plus acupuncture combined with medicine group (CC + M + A),with each group of 10 rats.Intervention was performed on the 80th day of the age,with continuous treatment for five days.At the end of treatment,in each group the rats were in cage with male rats by 2∶1 ratio at 6 P.M.and check vaginal smear on the next day,and detect sperm which was marked as the first day of gestation (D1),weigh at 4 P.M.of D4 and D5.The ER and PR protein were detected by immunohistochemistry.Results:For the endometrial tissue morphology,endometrial maturity and pinocytosis by comparison,in CC + M + A group the endometrium got the best split growth;CC + M + A group and the normal group had no significant difference (P ＞ 0.05);compared with CC + A and CC + M groups,the two groups increased significantly with statistical significance (P ＜
0.05);compared with CC + PVG of the model group and CC group,there were significant differences (P ＜0.01).Compared ER and PR in serum and endometrial hormone between groups,CC + M + A group and the normal group showed a positive expression and had no significant difference (P ＞0.05);compared with CC + A,CC + M and CC + PVG group,the two groups increased significantly with statistical significance (P ＜ 0.05),and compared with model group and CC group,there were significant differences (P ＜0.01).Conclusion:Normal endometrium development maturity is the best when electroacupuncture,Bushen Huoxue prescription combined with clomiphene are used for polycystic ovary syndrome around the time of
implantation,which is related to the increase of endometrial ER and PR protein expression.
【期刊名称】《针灸临床杂志》
【年(卷),期】2017(033)002
【总页数】6页(P53-58)
【关键词】电针;补肾活血方;PCOS;大鼠;围着床期;ER、PR蛋白表达
【作者】姜朵生;吴献群;吴松;杨会生;陈茜;鲍成
【作者单位】湖北省妇幼保健院,湖北武汉430070;湖北省中医院,湖北武汉430061;湖北中医药大学针灸治未病湖北省协同创新中心,湖北武汉430061;中国中医科学院针灸研究所,北京100700;湖北中医药大学针灸治未病湖北省协同创新中心,湖北武汉430061;湖北中医药大学针灸治未病湖北省协同创新中心,湖北武汉430061
【正文语种】中文
【中图分类】R246.3
目前体外受精胚胎移植技术虽然已经很大程度上解决了不孕问题，但子宫内膜容受性降低仍然是导致人工助孕失败的主要原因。

研究表明,发育良好的胚胎与其同步发育良好的子宫内膜容受性是胚泡成功着床的关键[1-2]。

着床是个高度协调的事件，子宫内环境的研究也逐渐被生殖医学界研究者所关注，目前子宫内膜容受性相关的因子和蛋白也逐渐被重视和研究。

有关影响子宫内膜容受性的因素很多,其中包括子宫内膜的厚度、形态、血供、局部的激素分泌、细胞因子和生长因子等[3-4]。

因此,研究如何改善子宫内膜形态,改善胚胎着床环境,提高子宫内膜容受性,使子
宫内膜发育与胚胎发育同步化,以提高胚胎着床率就显得尤为重要。

本研究着重于
妊娠D4、D5天，即围着床期，观察电针联合补肾活血方对子宫内膜容受性相关
的子宫内膜形态变化、胞饮突及ER、PR影响。

1.1 实验动物
所用实验大鼠均购自于湖北省实验动物研究中心，采用清洁级雌性SD大鼠70只[动物许可证号：SCXK(鄂)2008-0005]，21日龄，体质量60～80 g左右，动物
喂养于标准动物房，大鼠适应性喂养3天开始实验。

1.2 分组与处理
幼年SD清洁雌性大鼠均在21日龄断奶,喂以颗粒饲料,适应性喂养3天。

参照Lee MT等[5]的方法制作多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)大鼠
模型。

实验组于24日龄皮下注射DHEA(武汉远城科技发展有限公司，批号：20100405)6 mg/100 g体重/天+0.2 ml注射用油(天津市北辰方正试剂厂，批号：201407),连续注射20天。

正常组在同期皮下注射0.2 ml/天注射用油。

分组：10只皮下注射油作为正常组(G)，造模成功的大鼠采用随机数字表法分为模型组(M)、克罗米芬组(CC)、克罗米芬+补佳乐组(CC+PVG)、克罗米芬+电针组(CC+A)、克罗米芬+补肾活血方组(CC+M)、克罗米芬+针药结合组(CC+M+A)，每组10只。

处理：每组均于80日龄起进行干预，连续治疗5天；各组均于灌胃克罗米芬同时加补佳乐、电针、补肾活血方、针药结合，联合治疗5天。

采用许文生氏人与动物体表面积换算公式[6]，克罗米芬CC(枸橼酸氯米芬胶囊，
高特制药有限公司，批号：H20040352)灌胃：10 mg/100 g，每只大鼠1
ml/100 g灌胃；补佳乐(戊酸雌二醇片，拜耳医药保健有限公司广州分公司, 批号：J20130009)灌胃：补佳乐0.104 mg/kg,每只大鼠1 ml/100 g灌胃；中药颗粒(中国深圳三九医药公司，批号：1405271S)灌胃：按1:1比例，将16.5 g溶入
30 ml蒸馏水，每只大鼠1 ml/100 g灌胃，均连续灌胃5天。

中药补肾活血颗粒组方：当归颗粒3 g/包(相当于饮片10 g)、白芍颗粒1 g/包(相当于饮片10 g)、熟地颗粒3 g/包(相当于饮片10 g)、丹参颗粒1.5 g/包(相当于饮片10 g)、山茱萸颗粒1 g/包(相当于饮片6 g)、黄芪颗粒1 g/包(相当于饮片
10 g)、盐杜仲颗粒1 g/包(相当于饮片10 g)、桑寄生颗粒1 g/包(相当于饮片15
g)、续断颗粒1.5 g/包(相当于饮片10 g)、菟丝子颗粒0.5 g/包(相当于饮片10 g)、紫河车颗粒1 g/包(相当于饮片3 g)、制香附颗粒1 g/包(相当于饮片10 g)。

均以标准包装，每味药1∶1比例相混合并加入适量的沸水，用搅拌机搅拌均匀，无菌冲剂密封并保存在4℃冰箱。

电针治疗：大鼠穿自制鼠衣，选取关元、双侧三阴交、子宫穴,参照华兴邦等[7]制定的《实验动物穴位图谱》取穴,“关元”在脐下约25 mm处,“三阴交”在后肢内踝尖上10 mm左右侧各1穴，“子宫”在腹部前正中线，脐下约35 mm处(中极)，旁开25 mm左右侧各1穴，使用0.30 mm×15 mm毫针针刺，针刺深度分别约 2 mm、5 mm，接HANS-200电针(北京华运安特科技有限责任公司)治疗，连续波，频率2 Hz，强度1 mA，通电20 min，1次/天，治疗5天。

5天治疗结束后，各组于下午6:00与雄鼠按2：1比例合笼,次日早8:00查阴道涂片,以发现精虫者记为妊娠第1天(D1),于妊娠D4、D5下午4：00称重,腹腔注入3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉,腹部用75%酒精消毒后打开腹腔。

摘取双侧子宫表面的脂肪组织,观察子宫大体解剖情况，左侧子宫固定于多聚甲醛中,作HE染色,用HIMAS-200高清晰彩色医学图文分析系统(武汉千屏技术有限公司)进行定量分析，光镜下观察子宫内膜形态及微血管密度，电镜下观察饱饮突。

右侧子宫刮取子宫内膜于-80℃保存，采用SP免疫组化及Western blotting蛋白分析技术，测定大鼠子宫内膜组织ER、PR蛋白表达。

1.3 主要试剂与仪器
脱氢表雄酮(湖北芳通药业, 批号：20120518)；中药颗粒剂(三九制药公司, 批号：
1405271S)； ER兔抗大鼠多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号：
A0208)；PR兔抗大鼠多克隆抗体(美国Santa Cruze公司，批号：SC-11339)；Actin单克隆抗体(美国Santa Cruze公司，批号：SC-146)；HRP标记山羊抗兔IgG(武汉飞羿科技有限公司，批号：KG13378)；HRP标记兔抗山羊IgG(武汉飞
羿科技有限公司，LA142254)。

1.4 指标检测
免疫组化检测ER、PR的蛋白表达，用显微照像系统拍照作记录，采用HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统进行图象分析，200倍镜下检测各片的平均积分光密度值。

在日立S-3000N型扫描电子显微镜上观察子宫内膜上皮胞饮突。

1.5 统计方法
各组计量资料用均数±标准差±s)表示，输入计算机利用统计软件SPSS19.0分析。

显著水平设为0.05，P<0.05为有统计学意义。

2.1 各组妊娠D4、D5子宫内膜成熟度比较
各组子宫内膜成熟度情况比较：正常组与CC+M+A组之间无明显差异(P>0.05),
子宫内膜成熟度均较高,但与CC+A、CC+M组比较明显升高，有统计意义
(P<0.05)，而与CC+PVG、模型组、CC组比较有显著差异(P<0.01)；CC+M、CC+A两组之间无明显差异(P>0.05)，两组与CC+PVG、CC、模型组比较，有统计学意义(P<0.05)；CC+PVG、CC、模型组3组比较，3组间子宫内膜成熟度无
明显差异(P<0.05)；在发育不同步上，模型组明显较其它几组比例高，与正常组、CC+M+A组比较，有显著差异(P<0.01)，与CC+M、CC+A组比较，有统计学
意义(P<0.05)。

见表1。

2.2 妊娠D4、D5子宫内膜组织的胞饮突变化
胞饮突是子宫内膜上皮细胞膜顶端形成的大而平滑的突起，在电镜下观察胞饮突，胞饮突发育按Nikas等[8]制定的标准分为发育期、成熟期、衰退期3个发育阶段。

各组子宫胞饮突情况比较：正常组与CC+M+A组之间无明显差异(P>0.05),子宫内膜胞饮突发育完全较高,但与CC+A、CC+M组比较明显升高，有统计意义(P<0.05)，而与CC+PVG、模型组、CC组比较有显著差异(P<0.01)；CC+M、CC+A两组之间无明显差异(P>0.05)，两组与CC+PVG、CC、模型组比较，有统计学意义(P<0.05)；CC+PVG、CC、模型组3组比较，3组间无明显差异，无统计学意义(P>0.05)；在发育中期胞饮突上，模型组明显较其它几组比例高，与正常组、CC+M+A组比较，有显著差异(P<0.01)，与CC+M、CC+A组比较，有统计学意义(P<0.05)。

见表2。

2.3 大鼠妊娠D4、D5子宫内膜组织ER、PR免疫组化情况比较
见表3及图1、图2，将SP染色切片置于显微镜下观察，阳性部位为棕黄色，根据光学显微镜观察着色深浅，将结果分为:阴性(-)、弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性(+++)。

阴性(-)：细胞核和胞浆内无棕色颗粒出现；弱阳性(+)：细胞核和胞浆内有较浅的棕色颗粒；阳性(++)：细胞核和胞浆内棕色颗粒清晰；强阳性(+++)：细胞核和胞浆内有明显的棕色颗粒出现。

对于免疫组化标本在相同的环境条件下，对免疫组化组织切片进行计算机图像分析，检测各因子表达的平均光密度，以此来表示各因子表达的阳性率。

ER、PR表达主要在细胞核，ER、PR在正常组、CC+M+A组上都有阳性表达。

ER在正常组中表达量(光密度值):0.80±0.13，CC+M+A组表达量(光密度值):0.76±0.11，二者间无明显差异；两组与CC+A组表达量(0.46±0.14)、
CC+M组表达量(0.36±0.21)、CC+PVG组表达量(0.44±0.21)比较有统计学意义(P<0.05)，3组间无明显差异(P>0.05)；正常组、CC+M+A组与CC组表达量(0.27±0.22)、模型组表达量(0.26±0.31)比较有统计学意义(P<0.01)。

PR在内膜上的表达多呈弱阳性，阳性颗粒表达位于腺细胞浆内和核内、间质细胞膜上和核内，呈棕黄色细胞颗粒。

PR在正常组中表达量(光密度值):0.60±0.23，
CC+M+A组表达量(光密度值):0.66±0.21，二者间无明显差异；两组与CC+A组表达量(0.36±0.24)、CC+M组表达量(0.36±0.31)、CC+PVG组表达量
(0.34±0.23)比较有统计学意义(P<0.05)，3组间无明显差异(P>0.05)；正常组、CC+M+A组与CC组表达量(0.24±0.12)、模型组表达量(0.26±0.20)比较有统计学意义(P<0.01)。

目前认为子宫内膜胚胎容受性反应母体子宫内膜对胚胎的接受能力,与着床过程密切相关。

在正常的排卵月经周期中,子宫内膜仅在极短的时期内允许胚胎着床,这一时期提示子宫内膜容受性达到最高状态,称之为“种植窗期”，在人类,这一时期通常在正常月经周期第20～24天,即LH高峰后的第6～10天,仅持续24～48 h。

有研究表明该种植窗期，也即围着床期在小鼠是妊娠D3、D4天，而在大鼠其周期为在妊娠D4、D5天，此期子宫内膜在形态、生化方面会产生一系列规律性变化,如有丝分裂减少、腺体分泌增加、间质水肿及细胞因子含量改变等，均为胚胎着床作准备,此期子宫内膜表现出对胚泡最大的容受性[9-10]。

胞饮突是出现在子宫内膜上皮细胞膜顶端上大而平滑的突起，大量研究证实,胞饮突是子宫内膜容受性的超微结构标志物，这种结构只在自然周期第21天左右出现,且仅持续24～48 h后消失，与子宫内膜容受性有显著的时空特异性，对子宫内膜容受性有非常重要的作用。

完全发育胞饮突形成是子宫内膜容受性良好的形态学标志,研究认为子宫内膜胞饮突的发育与其组织形态发育存在同步性。

因此，对于子宫内膜发育不良所导致多次移植失败的患者,进行胞饮突的发育情况检查具有重要临床价值[11-12]。

雌、孕激素以及雌、孕激素受体是形成良好内膜容受性的重要因素,其中任一因素表达失常将导致着床失败[13-14]。

雌激素启动子宫内膜增殖反应，通过与雌激素受体结合作用于子宫内膜，而孕激素使增殖的子宫内膜及时转化为分泌型子宫内膜, 使子宫内膜由非黏附状态进入黏附状态,呈可容受状态,促进蜕膜形成和发育,为胚泡成功着床提供良好的内膜环境。

本实验旨在观察妊娠D4、D5天围着床期大鼠子宫内膜容受性，在此期间，正常
子宫内膜容受性表现为ER蛋白的高表达，PR略有下调，胞饮突数量多，子宫内
膜发育良好，而PCOS模型组由于内分泌的紊乱，其子宫内膜容受性出现发育不
同步、饱饮突数量减少的同时，各蛋白表达也出现低表达，CC促排卵后加剧了这种不同步和低表达。

中医理论认为，PCOS发生主要是肾-天癸-冲任-胞宫之间相
互调节失约，肝、脾、肾功能失调，导致痰湿瘀结胞宫，其中“肾虚血瘀”是发病的主要环节[15]。

治疗以“补肾活血”为法，补肾重在温补肾阳。

中药补肾活血方组方：当归、白芍、熟地、丹参、山茱萸、黄芪、盐杜仲、桑寄生、续断、菟丝子、紫河车、制香附。

四物汤去川芎作为基础方，加补肾阴药山茱萸；补肾阳药盐杜仲、菟丝子、桑寄生、续断、紫河车“血肉有情之品”；补气活血药丹参、黄芪、制香附。

此方补肾阳“于阴中求阳，阳得阴助而生化无穷”，同时配合补气活血药，整个方药旨在为着床期提高黄体水平，补肾阳活血，一补一泻，补中有疏。

肾主生殖，能调控肾-天癸-冲任-胞宫生殖轴，肾气强弱直接影响和调控胞宫；补气活血能改
善肝、脾、肾功能失调导致的痰、湿、瘀蕴结胞宫，改善肾虚血瘀。

电针选取“关元”“子宫”穴，关元穴是任脉要穴和小肠之募穴，且位居丹田，为元阴、元阳之气闭藏之处，能补益一身先天之本，有培元固本、益肾填精、调理冲任之功。

子宫穴和关元穴的传入纤维与支配泌尿、生殖器官的传入纤维重叠，妇科疾病首选子宫、关元穴[16]。

因此针刺子宫、关元穴，能直达病所，改善子宫血流灌注，通过神经纤维内分泌调节改善内分泌紊乱状态。

针刺选取三阴交，为肝脾肾三经的交会穴,
肝藏血、脾统血、肾藏精，精血同源互化，补肾活血,调整肝、脾、肾三脏及冲、任、督、带等经脉气血失常[17]。

从实验结果表明，CC+M、CC+A、CC+M+A组明显较模型组、CC组、
CC+PVG组子宫内膜容受性改善明显，是通过提高子宫内膜组织雌激素受体、孕
激素受体表达而起作用。

为此，各组采用补佳乐、补肾活血中药、电针、针药结合
来改善CC促排卵后子宫内膜容受性。

本实验观察到CC+M+A组较之于CC+M、CC+A、CC+PVG组比较，针药联合治疗效果更理想。

这一有效作用可能是针药
结合通过上调子宫内膜组织ER、PR蛋白水平来实现的。

△通讯作者：吴松(1980-)，男，副教授，副主任医师，主要从事针灸效应的基础
及临床研究。

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