从大豆糖蜜发酵液中提取、纯化低聚糖

由表 2 中正交试验设计结果分析可知， 空白 试验显著性大于 0.05，平行不显著。 4 个因素的 3 个水平有显著差异，且 A、B、C、D 4 个因素对蛋白 质去除率均有极显著影响。 由 F 值可以看出，影响 蛋白质去除率的因素次序为 C＞B＞D>A， 即转速>
pH 值>搅拌时间>不同的酸液。 其中每个因素中 4 个水平对蛋白质去除 率 的 影 响 次 序 为 A1＞A3＞A2， B2＞B1＞B3，C2＞C1＞C3，D2＞D3＞D1，确 定 的 最 佳 提 取 工 艺组合为 A1B2C2D2， 即酸沉淀法去除蛋白质的最 优条件是：用 4% HCL 调节 pH 值为 3，离心转速
表 3 不同树脂脱色率及总糖保留率
Table 3 Decoloration rate and total sugar retention
rate of different resin
树脂型号
极性
脱色率/% 总糖保留率/%
AB-8
弱极性
93.90
93.53
D201
非极性
90.11
79.92
D315
非极性
从大豆糖蜜等原料中直接提取大豆低聚糖， 往往因原料中蔗糖含量高，难分离，造成最终低聚 糖产品蔗糖含量高，功能性成分含量较低；而微生 物发酵后的大豆糖蜜，蔗糖被微生物大量消耗，功 能性成分含 量 高[9]。 本 文 以 大 豆 糖 蜜 发 酵 液 为 原 料，研究除蛋白、脱色和脱盐等纯化工艺，旨在获 取功能性成分含量及纯度均较高的大豆低聚糖产 品，为大豆低聚糖生产与应用奠定基础。
由图 6 可知， 随着大豆糖蜜发酵液 pH 值的 增大，AB-8 树脂的脱色率和总糖保留率均减小， 且多糖保留率减小较显著。 当 pH 3.0 时脱色率及 总糖保留率较佳，分别为 92.83%和 96.65%，这与 龙 祯 等 人 的 研 究 结 果[12]有 所 差 别 ，可 能 是 使 用 原 料及纯化工艺不同所致。 2.2.3 AB-8 树脂静态吸附动力学过程 取 AB-8 树脂 5 g，加入 40 mL pH 3 的大豆糖蜜超滤液，测 定不同吸附时间（0.5、1、2、3、4、5、6 h）对脱色率和 总糖保留率的影响。
图 8 表明，流速越低，脱色效果越好，这是因 为流速低有利于色素成分被充分地吸附。 在流速 1.5 BV/h，流出液处理量 4.5BV 时，AB-8 树脂脱色 率保持在 90％以上。 预达到这一脱色效果， 流速 3.5 BV/h 和 4.5 BV/h 的处理量均小于流速 1.5 BV/
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中国食品学报
关键词 大豆糖蜜； 发酵液； 低聚糖； 纯化 文章编号 1009-7848（2011）05-0024-08
大豆低聚糖是大豆中可溶性寡糖的总称，主 要由水苏糖、棉籽糖、蔗糖等组成[1]。 大豆低聚糖是 美 国 食 品 药 品 管 理 局 （FDA） 唯 一 认 可 并 应 用 于 食 品中的功能性低聚糖[2]，其 具 有 低 热 量 ，难 以 消 化 等特点，被广泛应用在功能性食品开发等方面 。 [3-5] 在国外（特别是日本）已开发出大豆低聚糖系列产 品，并形成了工业化生产 规 模[6]，而 在 国 内 由 于 生 产成本高，产品得率低，纯度差，蔗糖含量高，功能 性低于其低聚糖产品等， 从而限制了大豆低聚糖 在 一 些 特 殊 食 品 中 的 应 用 ，价 格 也 上 不 去 [7-8]。
1.3.2 酸法除蛋白工艺流程
糖蜜发酵液
取上清
加热搅拌
调节 pH
收稿日期： 2010-08-29 基金项目： 国家“863”计划项目（2007AA100404） 作者简介： 王昌涛，男，1974 年出生，博士，副教授
测定蛋白含量 取不清液 离心分离
静置
1.3.3 试验指标的测定 总糖的测定： 苯酚-硫
第 11 卷 第 5 期 2011 年8月
中国食品学报
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
Vol． 11 No． 5 Aug． 2 0 1 1
从大豆糖蜜发酵液中提取、纯化低聚糖
王昌涛 1 黄 鹏 1，2 崔希庆 2 （1 北京工商大学植物资源研究开发北京市重点实验室 北京 100048
糖蜜发酵液，自制（酒精酵母菌发酵 ）；树脂 AB-8、D201、D315、201 ×7、001 ×7、D301， 购 于 上 海 华羚树脂有限公司；其它试剂均为分析纯级。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 糖蜜发酵液 ，自制（酒精酵母菌发酵 ）；树脂
AB-8、D201、D315、201×7、001×7、D301，购 于 上 海 华羚树脂有限公司；其它试剂均为分析纯级。 1.2 仪器与设备
第 11 卷 第 5 期
从大豆糖蜜发酵液中提取、纯化低聚糖
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酸法[10]；固形物的测 定 ： 直 接 干 燥 法[11]；蛋 白 质 含 量的测定： 微量凯氏定氮法[10]； 低聚糖测定： 高 效 液 相 色 谱 法 （ 色 谱 柱 为 HyPersil-NH2 柱 ，4.6 mm×250 mm）； 流动相：V （乙腈）∶V （水）=75∶25； 流 速 ：1 mL/min；柱 温 ：30 ℃；检 测 器 ：蒸 发 光 检 测 器； 检测参数： 载气流速 2.1 L/min， 漂移管温度 85 ℃。 1.3.4 试验指标的计算 蛋白沉淀率=
T6 新世纪紫外-可见分光光度计， 北京普析 通用仪器有限责任公司；安捷伦 1100 高效液相色 谱仪， 美国 Agilent 公司；RJ-TDL-SA 大型低速大 容量离心机，无锡市瑞江分析仪器有限公司。 1.3 方法 1.3.1 大豆糖蜜发酵液分离纯化工艺流程
糖蜜发酵液
酸法除蛋白
大孔树脂脱色
纯品大豆低聚糖 冷冻干燥 离子交换树脂脱盐
2011 年第 5 期
h 时的处理量。 综上所述，脱色时最佳控制流速为 1.5 BV/h，该流速下处理量为 4.5 BV。 2.2.5 动态吸附过程中总糖浓度的变化 每隔一 定量流出液体积，接取 1 mL 流出液，测定其总糖 浓度，即时监测原液中总糖浓度的变化情况。
图 9 可 以 看 出 ，在 2.5 BV 内 ，总 糖 浓 度 显 著 增高， 其主要原因是脱色开始前树脂间隙内残留 了一部分水，这部分水对糖液起稀释的作用，同时 AB-8 树脂对糖也有部分的吸附作用。 当处理体积
Table 2 Analysis of protein precipitation rate
来源
F值
Pr>F
显著性
模型
554.74
<0.0001
**
空白
4.35
0.0704
△
A
217.92
<0.0001
**
B
972.78
<0.0001
**
C
995.45
<0.0001
**
D
308.03
<0.0001
**
第 11 卷 第 5 期
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6 000 r/min，搅拌时间 10 min。 在此条件下做试验， 结果蛋白质去除率达 55.50%，此结果大于任何一 组正交试验值，此时总糖保留率为 99.7%。 2.2 大孔树脂除色素 2.2.1 树 脂 的 筛 选 3 种 树 脂 ，各 取 5 g，分 别 加 入 40 mL 大豆糖蜜超滤液， 搅拌 4 h 后测定脱色 率和总糖保留率。 各种树脂对大豆糖蜜超滤液的 脱色率及总糖保留率见表 3。
表 1 正交试验方案与结果
Table 1 Program and results of orthogonal test
不同的酸液
pH 值
转速 r/min
搅 拌 时 间 /min
（A）
（B）
（C）
（D）
4% HCl
2
4 000
5
4% HCl
3
6 000
10
4% HCl
5
8 000
15
8% HCl
2
6 000
为 2.5 BV 时 ， 流 出 液 总 糖 质 量 浓 度 达 到 最 大 值 34.21 mg/mL， 远大于原液的总糖质量浓度 28.63 mg/mL。 这是由于动态吸附过程中 AB-8 树脂吸收 的糖分定向堆积所致。 随着处理体积的增大，糖质 量浓度逐渐下降， 4.5BV 后， 流出液总糖质量浓 度基本保持不变， 而此时总流出回收液的总糖保 留率为 98.30%。结合此处理量时的脱色效果（90% 以上）， 选择动态吸附过程的流出液处理体积为 4.5BV。
26蛋白正交试验结果 参考上述单 因素试验结果， 选取对除蛋白影响显著的 4 个因 素（pH 值、pH 值调节酸液、离心转速、搅拌时间），
采用正交设计研究酸沉淀法除蛋白质的最优条 件，实验结果见表 1，分析结果见表 2。
实验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9
44.44
96.52
从表 3 可知，AB-8 树脂对大豆糖蜜超滤液的 脱色率最高，其次为 D201、D315，说明树脂的极性 是影响脱色效果的主要因素。 AB-8 树脂的脱色率 最高， 说明发酵液中的有色物质主要为弱极性物 质，与树脂的极性相符。 由于 AB-8 树脂具有较大 的比表面积和合适的孔容， 所以其对色素的吸附 能力最强。 D201 树脂也有不错的脱色效果，但其 总糖保留率较低。 综合考虑脱色率和总糖保留率 等因素，选择 AB-8 为发酵液的脱色树脂。 2.2.2 pH 值 对 AB-8 树 脂 的 脱 色 率 和 总 糖 保 留 率 的 影 响 取 AB-8 树 脂 5 g， 加 入 40 mL 不 同 pH（3、4、5、6）的大豆糖蜜超滤液，搅拌 4 h 后测定 脱色率和总糖保留率。
由图 7 可知，AB-8 树脂对大豆糖蜜发酵液的
脱色速度较快，40 min 后脱色率在 90%以上，之后 脱色率随着时间的延长增加较缓慢， 至 1 h 时基 本达到吸附平衡点。 总糖的损失率随时间的延长 缓慢下降， 4 h 前总糖的保留率在 90%以上，之后 总糖的下降速度增大。 综合脱色率和总糖保留率 两个因素，最终确定静态吸附时间为 2 h，此时脱 色率为 93.96%，总糖保留率为 96.87%。 2.2.4 不同流速和流出液体积对 AB-8 树脂脱色 率的影响 考察不同流速 〔1.5、3.5、4.5 倍树脂床 体 积 （BV）/h〕和 各 流 速 下 不 同 流 出 液 体 积 〔0.25、 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、9、12、15、18 倍 树脂床体积（BV）〕的 AB-8 树脂脱色率。
15
8% HCl
3
8 000
5
8% HCl
5
4 000
10
8% H2SO4
2
8% H2SO4
3
8% H2SO4
5
8 000
10
4 000
15
6 000
5
蛋 白 质 去 除 率 /%
41.48 55.43 37.41 48.25 38.20 36.60 40.53 44.26 38.77
表 2 蛋白质沉淀率分析
2 东北农业大学生命学院 哈尔滨 150030）
摘要 为获得纯度较高的大豆低聚糖，研究大豆糖蜜发酵液去蛋白、脱色和脱盐等工艺。 用 4% HCL 调节发酵 液 pH 值为 3，搅拌时间 10 min，离心转速 6 000 r/min，蛋白去除率 55.50%。 采用 AB-8 大孔树脂，在 pH 3，液体 流速 1.5 BV/h， 处理量 4.5 倍树脂床体积（BV）时，发酵液脱色效果最好，脱色率 90%以上。 当 001×7 和 D301 型 离子交换树脂联用时脱盐效果较好。 纯化获得的大豆低聚糖为白色透亮粉末， 味微甜， 总糖占固含物的 94.00%，功能性成分占固形物的 86.52%。
（1- 处理前蛋白含量-处理后蛋白含量 ）×100% 沉淀前蛋白含量
总糖保留率= 处理前总糖含量-处理后总糖含量 ×100% 处理前总糖含量
脱色率=
（1- 处理前样品吸光度-处理后样品吸光度 ）×100% 处理前样品吸光度
2 结果与分析
2.1 酸沉法除蛋白 2.1.1 酸 沉 法 除 蛋 白 单 因 素 试 验 结 果 由 图 1～ 图 5 可以看出， 用 4% HCl 调节发酵液 pH 值，有 利于蛋白的沉淀；当 pH 3.0 时蛋白沉淀率最高，说 明大豆发酵液中的蛋白等电点为 3.0。 离心转速对 蛋白沉淀率影响较大，这可能是由于转速过低，一 些蛋白分子无法沉淀，而转速过高，破坏了蛋白分 子，蛋白的沉淀率下降，故选择 6 000 r/min 离心。 延长搅拌时间， 可以使部分蛋白在酸性条件下充 分变性、沉淀，但超过一定时间后变性趋于完全。 综合考虑效率和成本因素，选择搅拌时间 10 min。 加热温度对蛋白沉淀率影响不大，选择 25 ℃。