伤寒沙门菌fljB∶∶lacZ变异株的制备

伤寒沙门菌fljB∶∶lacZ变异株的制备【摘要】目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fljB的表达调节机制，建立该fljB 基因的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）插入变异株。

方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。

设计加接KpnⅠ和SalⅠ的特异性引物，用PCR扩增获得fljB基因的上、下游同源性DNA片段，并与用KpnⅠ和SalⅠ酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMB151，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。

结果：经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实，fljB基因中的763 bp被3 550 bp的lacZ片段替代。

结论：成功构建伤寒沙门菌flj∶∶lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。

【关键词】伤寒沙门菌； fljB基因；β-半乳糖苷酶基因；基因融合
［Abstract］Objective: To study the mechanisms of expressional regulation of fljB∶z66, the fljB∶∶lacZ mutant strain of Salmonella enterica serovar Typhi was constructed. Methods：The mutant strain was prepared by the method of homologous recombination mediated by suicide plasmid. The special primers with KpnⅠ and SalⅠ sites respectively were designed, the upper- and down-stream homologous fragments of the fljB gene were amplified by PCR, a lacZ cassette from the pSV-
β-galactosidase vector was linked with the upper- and doun-stream homologous fragments respectively. The resulting product was inserted via SmaⅠ sites into the suicide plasmid serovar Typhi were transformed with recombinant plasmid by electroporation transformation, selected in the sucrose plate containing X-Gal. Homologous recombinants were screened by PCR. Results： A 3 550 bp insertion in fljB gene was confirmed instead of 763 bp deletion by PCR and sequencing analysis. Conclusion：The mutant with fljB∶∶lacZ have been successfully constructed and it was a foundation to study the expression and regulation mechanism of fljB gene in S. Typhi.
［Key words］ Salmonella enterica serovar Typhi; fljB; lacZ; gene fusion
伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi)是一种具有鞭毛、革兰阴性人类致病菌。

鞭毛是沙门菌运动的基础，在其侵袭过程中具有极重要的作用。

沙门菌鞭毛素基因的表达受鞭毛调节因子FlhDC和FliA促进，并受环境影响，可由RcsB、PhoP、OmpR等多种中央调节因子参与调节［1-5］。

长期以来人们一直认为伤寒沙门菌是单相菌株，1981年Guinee首次在从印度尼西亚分离获得的伤寒沙门菌中发现一种新的鞭毛抗原，命名为z66抗原［6］。

2004年黄新祥等首次成功克隆了伤寒沙门菌z66抗原的编码基因［7］。

最近研究表明，z66抗原的编码基因属于伤寒沙门菌的二相鞭毛素fljB基因，且位于
一罕见的线性质粒中［8］。

z66鞭毛抗原的表达调节机制，伤寒沙门菌fljB基因在各种环境下的表达，中央调节因子和鞭毛调节因子对fljB基因表达的影响，这些都迫切需要进一步的研究加以阐明。

将报告基因插入目的基因以便于观察和分析目的基因的表达水平是研究基因表达调控机制的一种有效手段。

为进一步研究z66鞭毛抗原表达调节机制，本研究拟于fljB基因中插入β-半乳糖苷酶报告基因（lacZ），构建相应的插入变异株(fljB∶∶lacZ)。

本研究将采用自杀质粒介导的同源重组法，将lacZ报告基因定向插入fljB基因编码区，通过z66基因启动子和SD序列驱动报告基因的表达，为进一步研究fljB基因表达调控机制奠定基础。

1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌DH5α由本室保存；伤寒沙门菌GIFU10007，大肠埃希菌E.coli SPY372λpir，自杀质粒pGMB151由日本岐阜大学医学院微生物学教研室惠赠；pSV质粒(pSV-β-galactoeidase vector)购自Promega 公司；pMD18-T质粒购自TaKaRa（大连）公司。

1.1.2 主要试剂限制性内切酶 Sma I，Sal I，Kpn I，T4DNA连接酶、碱性磷酸酶、ExTaq均为TaKaRa（大连）公司产品；质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司；胶回收试剂盒为Promega公司产品。

1.1.3 主要仪器核酸紫外检测仪（Biophotometer， Eppendorf 公司）；PCR仪(ABI2700)；凝胶成像系统（Gene Genius Bioimaging。