山楂多糖提取物上调miR-146a-5p抑制Wntβ-catenin信号通路影响胃癌细胞增殖和凋亡

山楂多糖提取物上调miR -146a -5p
抑制Wnt/β-catenin 信号通路影响胃癌细胞增殖和凋亡
李孝平，李伟，高芳芳，黄朝刚，何天佑，孙智珺
作者单位：武汉市第三医院普外科，湖北
武汉430060
通信作者：孙智珺，男，副主任医师，研究方向为胃肠，Email ：***************
摘要：目的
探讨山楂多糖提取物对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及机制。

方法
用浓度分别为200、400、800μg/mL 的山楂
多糖提取物处理AGS 细胞，作为不同浓度山楂多糖提取物组；正常培养的细胞作为对照（NC ）组；用800μg/mL 的甘露醇处理作等渗对照，记为800μg/mL 甘露醇组。

将miR -NC 、miR -146a -5p 转染至AGS 细胞中记为miR -NC 组、miR -146a -5p 组；将anti -miR -NC 、anti -miR -146a -5p 转染至AGS 细胞中再用浓度为800μg/mL 的山楂多糖提取物处理，记为anti -miR -NC+山楂多糖提取物组、anti -miR -146a -5p+山楂多糖提取物组。

四甲基偶氮唑盐比色法（MTT ）检测细胞增殖率；流式细胞术检测细胞凋亡；实时荧光定量PCR （RT -qPCR ）检测miR -146a -5p 表达水平。

结果
与对照组（100.10±10.02）%相比，200、400、800μg/mL 山楂多糖提
取物组胃癌细胞AGS 的增殖率（85.12±8.51）%、（68.22±6.82）%和（42.11±4.21）%降低（F =31.314，P <0.05）。

不同浓度山楂多糖提取物处理的胃癌细胞AGS 中细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，miR -146a -5p 表达水平升高（P <0.05）。

高表达miR -146a -5p ，细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高（P <0.05）。

低表达miR -146a -5p 部分逆转了山楂多糖提取物对胃癌细胞AGS 增殖和凋亡的影响。

山楂多糖提取物处理的胃癌细胞AGS 中β-catenin 表达水平降低，低表达miR -146a -5p 逆转了山楂多糖提取物对β-
catenin 表达的抑制作用。

结论山楂多糖提取物可抑制胃癌细胞AGS 增殖，促进细胞凋亡，其机制可能与miR -146a -5p 和
Wnt/β-catenin 信号通路有关。

关键词：山楂属；植物提取物；miR -146a -5p ；Wnt/β-catenin 信号通路；胃癌；增殖；凋亡
Up -regulation of miR -146a -5p by Hawthorn polysaccharide extract inhibits Wnt/β-catenin
signaling pathway to affect proliferation and apoptosis of gastric cancer cells
LI Xiaoping,LI Wei,GAO Fangfang,HUANG Chaogang,HE Tianyou,SUN Zhijun
Author Affiliation:Department of General Surgery,Wuhan Third Hospital,Wuhan,Hubei 430060,China
Abstract:
Objective
To investigate the effect and mechanism of polysaccharide extract of Cornus officinalis on proliferation and
apoptosis of gastric cancer cells.Methods
AGS cells were treated with hawthorn polysaccharide extracts at concentrations of 200,
400,and 800μg/mL,respectively,as different concentrations of hawthorn polysaccharide extract group;normal cultured cells were
used as control (NC)group,treated with 800μg/mL mannitol as an isotonic control,recorded as 800μg/mL mannitol group.miR -NC
and miR -146a -5p were transfected into AGS cells and recorded as miR -NC group and miR -146a -5p group;anti -miR -NC and anti -miR -146a -5p were transfected into AGS cells and treated with hawthorn polysaccharide extract at a concentration of 800μg/mL,and record‑
ed as an anti -miR -NC+hawthorn polysaccharide extract group and an anti -miR -146a -5p+hawthorn polysaccharide extract group.Cell proliferation rate was detected by MTT assay;apoptosis was detected by flow cytometry;real -time quantitative PCR (RT -qPCR)was used to detect the expression of miR -146a -5p.Results
The cell proliferation rate of gastric cancer cells AGS treated with different con‑
centrations of hawthorn polysaccharide extract was decreased [(100.10±10.02)%vs.(85.12±8.51)%,(68.22±6.82)%,(42.11±4.21)%,P <0.05],the apoptosis rate was increased,and the expression of miR -146a -5p was increased (P <0.05).High expression of miR -146a -5p,cell proliferation rate was decreased,apoptosis rate was increased (P <0.05).Low expression of miR -146a -5p partially reversed the
effect of hawthorn polysaccharide extract on proliferation and apoptosis of gastric cancer cell AGS.The expression of β-catenin in gas‑tric cancer cells AGS treated with polysaccharide extract of hawthorn was decreased,the low expression of miR -146a -5p reversed the inhibitory effect of hawthorn polysaccharide extract on β-catenin expression.Conclusions Hawthorn polysaccharide extract can inhib‑
it the proliferation of gastric cancer cells AGS and promote cell apoptosis.The mechanism may be related to miR -146a -5p and Wnt/β-catenin signaling pathway.Key words:Crataegus;
Plant extracts;
miR -146a -5p;
Wnt/β-catenin signaling pathway;
Gastric cancer;
Proliferation;
Apoptosis
引用本文：李孝平，李伟，高芳芳，等.山楂多糖提取物上调miR -146a -5p 抑制Wnt/β-catenin 信号通路影响胃癌细胞增殖和凋亡［J ］.安徽医药，2021，25（2）：326-330.DOI ：10.3969/j.issn.1009-
6469.2021.02.028.
◇临床医学◇
胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁我国人民的生命健康，近年来研究发现中医药对胃癌的防治具有良好疗效［1］。

中药多糖可通过药理因素调节人体免疫功能，且具有抗肿瘤作用，能够为医学临床肿瘤治疗提供有效帮助［2］。

研究报道猕猴桃根多糖、红花多糖可抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，诱导其凋亡［3-4］。

山楂多糖是山楂中有效生物活性物质，具有抗疲劳、增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤以及调血脂等药理作用［5］。

有研究发现山楂多糖提取物可诱导人结肠癌细胞凋亡［6］。

而山楂多糖提取物对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制尚未可知。

miRNA能够调节细胞增殖、分化和凋亡等多种生物过程，参与调控多种癌症发生，也与胃癌进程相关［7］。

研究发现过表达miR-146a-5p在非小细胞肺癌中起抑癌作用［8］。

人参皂苷Rh2通过上调
miR-146a-5p抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡［9］。

高腹膜转移潜能的胃癌细胞中miR-146a-5p下调表达［10］。

然而miR-146a-5p对胃癌细胞增殖和凋亡的影响尚未清楚。

本研究自2018年3月至2019年3月研究山楂多糖提取物对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制及与miR-146a-5p的相关性。

1材料与方法
1.1材料胃癌细胞AGS购自中国科学院上海细胞库；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒、Annexin V-FITC/ PI试剂盒购自日本同仁研究所；蛋白提取试剂盒购自美国Epigentek公司；Trizol试剂、荧光定量试剂盒购自美国Progema公司。

1.2方法
1.2.1山楂多糖提取物的制备山楂购自本地大型超市，将山楂洗净后切片、烘干，按料液比1∶20的比例加入蒸馏水后打浆，90℃热水浴提取6h，加入0.1%的果胶酶45℃提取3h，于80℃下灭酶10 min，离心收集上清液并浓缩，将浓缩液用95%的乙醇醇沉，离心收集沉淀，将沉淀复溶于水中，再次醇沉，离心收集沉淀，置于烘箱中烘干至恒重，得山楂多糖提取物。

将所得提取物经苯酚-硫酸法检测其为多糖提取物；将该粗多糖提取物加入胰蛋白酶于65℃孵育2h，离心后去除沉淀，得到脱蛋白的多糖溶液；将其转移到层析袋中进行反复透析48h，然后离心、浓缩、醇沉，得到半纯品；再将半纯品多糖用Sephadex G-100凝胶柱层析，得纯多糖提取物。

然后检测多糖含量。

制作标准曲线：称取4mg葡萄糖溶于100mL纯水中，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL补水至1.0 mL，然后加入5%苯酚1.0mL和浓硫酸0.5mL，摇
匀，静置20min后检测490nm处吸光度值，以水为空白对照做同样显色处理。

横坐标为吸光度值，纵坐标为糖含量。

取1.0mL的多糖溶液按上述步骤操作，测吸光度值，以标准曲线作测多糖含量。

用高效液相凝胶色谱法检测多糖纯度。

1.2.2细胞培养与分组胃癌细胞AGS用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，取对数生长期
AGS细胞，分别为200、400、800μg/mL的山楂多糖提取物处理，作为不同浓度山楂多糖提取物组；正常培养的细胞作为对照（NC）组；用800μg/mL的甘露醇处理作等渗对照，记为800μg/mL甘露醇组。

将miR-146a-5p过表达载体及阴性对照转染至AGS 细胞中，作为miR-NC组、miR-146a-5p组；将miR-146a-5p抑制剂及阴性对照转染至AGS细胞后用浓度为800μg/mL的山楂多糖提取物处理，作为anti-miR-NC+山楂多糖提取物组、anti-miR-146a-5p+山楂多糖提取物组。

转染均按照Lipofectamine TM2000试剂盒进行操作。

1.2.3MTT检测细胞增殖率细胞培养48h，按试剂盒说明操作，用酶标仪检测490nm处吸光度（OD）值。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡收集培养48h 的细胞，按试剂盒说明操作，上流式细胞仪检测。

1.2.5蛋白质印迹法（Western Blot）检测蛋白cy‑clinD1、cleaved-caspase-3、β-catenin表达提取细胞总蛋白，定量后取50μg进行SDS-PAGE，转至PVDF膜，封闭后加入一抗4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2h，暗室中曝光显影，定影，测定各组蛋白条带的灰度值，计算蛋白表达水平。

1.2.6实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-146a-5p表达水平提取细胞总RNA，合成cDNA，进行PCR扩增，循环条件为95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延长30s，共40个循环；相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1.3统计学方法实验数据经SPSS20.0分析，计量资料用x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果
2.1不同浓度山楂多糖提取物对胃癌细胞AGS增殖的影响对照组胃癌细胞AGS的增殖率为（100.10±10.02）%，200、400、800μg/mL山楂多糖提取物组分别为（85.12±8.51）%、（68.22±6.82）%和（42.11±4.21）%，与对照组相比，200、400、800μg/mL 山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS的增殖率降低（F=31.314，P<0.05）。

2.2不同浓度山楂多糖提取物对胃癌细胞AGS 凋
亡的影响与对照组相比，800μg/mL 甘露醇组
AGS 细胞的凋亡率、cleaved -caspase -3的表达水平无显著变化；而不同浓度山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS 凋亡率升高，cleaved -caspase -3表达水平升高
（P <0.05）（图1，表1）。

2.3山楂多糖提取物对miR -146a -5p 表达的影响
与对照组相比，山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS 中miR -146a -5p 表达水平升高［（1.00±0.10）比（2.89±
0.29），t =10.672，P <0.05］。

高表达
miR -146a -5p 对胃癌细胞AGS 增殖和
凋亡的影响
与miR -NC 组相比，miR -146a -5p 组胃
癌细胞AGS 中miR -146a -5p 表达水平升高，cyclinD1表达水平降低，AGS 细胞的增殖率降低，AGS 细胞中cleaved -caspase -3表达水平升高，AGS 细胞的凋亡率
升高（P <0.05）（图2，表2）。

2.5低表达miR -146a -5p 可以部分逆转山楂多糖
提取物对胃癌细胞AGS 增殖和凋亡的影响
与an‑
ti -miR -NC+山楂多糖提取物组相比，anti -miR -146a -5p+山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS 中miR -146a -5p 表达水平降低，cyclinD1表达水平升高，AGS 细胞的增殖率升高，AGS 细胞中cleaved -caspase -3表达水
表1
不同浓度山楂多糖提取物胃癌细胞AGS 凋亡的
影响（n =3）/x ±s
组别对照组
200μg/mL 山楂多糖提取物组400μg/mL 山楂多糖提取物组800μg/mL 山楂多糖提取物组800μg/mL 甘露醇组F 值P 值
凋亡率/%4.35±0.44
9.37±0.94①16.33±1.63①25.15±2.52①4.29±0.43115.8690.000
cleaved -cas‑pase -3
0.28±0.030.55±0.06①0.88±0.09①1.10±0.11①0.25±0.0381.3110.000
注：①与对照组比较，P <0.05。

1
2
3
4
5
注：1―β-actin ；2―cleaved -caspase -3；3―cyclinD1；4―miR -NC ；5―miR -146a -5p 。

图2
高表达miR -146a -5p 对cyclinD1、cleaved -caspase -3蛋白表达的
影响
表2
高表达miR -146a -5p 对胃癌细胞AGS 增殖和凋亡的影响（n =3）/x ±s
组别miR -NC miR -146a -5p t 值P 值
miR-146a-5p 1.00±0.113.11±0.3111.1100.000
cyclinD1
1.15±0.120.48±0.058.9270.000cleaved-caspase-3
0.32±0.030.96±0.1010.6180.000
细胞增殖率/%100.27±10.0357.08±5.716.4820.000
凋亡率/%4.41±0.44
17.02±1.7012.4380.0001
6
7
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10
11
12
2
3
4
5
1
2345
注：1―对照组；2―200μg/mL 山楂多糖提取物；3―400μg/mL 山楂多糖提取物；4―800μg/mL 山楂多糖提取物；5―800μg/mL 甘露醇；6―β-actin ；7―cleaved -caspase -3。

图1
不同浓度山楂多糖提取物对胃癌细胞AGS 凋亡的影响：A 为细胞凋亡流式图；B 为cleaved -caspase -3蛋白表达印迹图
平降低，AGS 细胞的凋亡率降低（P <0.05）。

见图3，表3。

2.6
Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白的表达
与
对照组相比，山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS 中β-catenin 表达水平降低（P <0.05）；与anti -miR -NC+山楂多糖提取物组相比，anti -miR -146a -5p+山楂多糖提取物组胃癌细胞AGS 中β-catenin 表达水平升高（P <0.05）。

见图4，表4。

3讨论
研究发现中医药在癌前病变、术前新辅助化
疗、术后化疗、延长患者生存期等方面对治疗胃癌有较好疗效［11］。

山楂是一种纯天然的药食同源的
植物果实，其提取物具有抗氧化和延长寿命作用［12］。

山楂黄酮提取物也能够有效地抑制癌细胞的生长［13］。

研究显示山楂原花青素提取物可抑制肝癌SMMC -7721细胞增殖，促进细胞凋亡［14］。

山楂多糖提取物可诱导人结肠癌细胞凋亡［6］。

本研究显示，不同浓度山楂多糖提取物处理的胃癌细胞AGS 中细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，cleaved -cas‑pase -3表达水平升高。

说明山楂多糖提取物可抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡。

研究表明miRNA 也参与调控癌症的进展，miR -
146a -5p 在转移性前列腺癌组织中低表达，miR -146a -5p 过表达可诱导非雄激素依赖性前列腺癌细胞的凋亡［15］。

miR -146a -5p 过表达抑制非小细胞肺癌细胞的肿瘤发生和血管生成［16］。

本研究显示，高
表达miR -146a -5p 后胃癌细胞AGS 的增殖率降低，凋亡率升高，说明高表达miR -146a -5p 可抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡。

表明miR -146a -5p 在胃癌中起抑癌作用。

还有研究发现隐丹参酮通过调控miR -146a -5p/表皮生长因子受体（epidermal
growth factor receptor ，EGFR ）轴抑制非小细胞肺癌［17］。

本研究显示，山楂多糖提取物处理后，miR -146a -5p 表达水平升高，而低表达miR -146a -5p 部分逆转了山楂多糖提取物对胃癌细胞AGS 增殖和凋亡的影响。

说明山楂多糖提取物可能通过上调
miR -146a -5p 抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡。

Wnt/β-catenin 信号通路参与调控癌症达发生发
展等过程，且与胃癌的进展有关［18］。

研究报道沉默β-catenin 可促进胃癌MGC -803细胞凋亡，抑制其侵袭［19］。

汉黄芩素可通过抑制Wnt/β-catenin 信号通
路抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡［20］。

本实验结果显示，山楂多糖提取物处理的胃癌细胞AGS 中β-catenin 表达水平降低，说明山楂多糖提取物可抑制Wnt/β-catenin 信号通路激活。

而低表达miR -146a -5p 逆转了山楂多糖提取物对β-catenin 表达的抑制作用。

说明山楂多糖提取物可能通过调控miR -146a -5p 进而调控β-catenin 的表达而影响胃癌细胞增殖和凋亡。

综上所述，山楂多糖提取物可能通过上调miR-
146a-5p 进而抑制Wnt/β-catenin 信号通路激活而抑制胃癌细胞AGS 增殖，促进细胞凋亡。

将可为中药多糖治疗胃癌提供了新思路。

23
45
1
6
7
891011
5注：1―β-actin ；2―β-catenin ；3―对照组；4―山楂多糖提取物；5―anti -miR -NC+山楂多糖提取物；6―anti -miR -146a -5p+山楂多糖提取物。

图4
β-catenin 蛋白的表达
表4
Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白的表达（n =3）/x ±s
组别对照组
山楂多糖提取物
anti -miR -NC+山楂多糖提取物anti -miR -146a -5p+山楂多糖提取物
F 值P 值
β-catenin
0.82±0.080.36±0.04①
0.40±0.050.70±0.07②
39.5840.000注：①与对照组比较，P <0.05。

②与anti -miR -NC+山楂多糖提取物比较，P <0.05。

表3
低表达miR -146a -5p 可以部分逆转山楂多糖提取物胃癌细胞AGS 增殖和凋亡的影响（n =3）/x ±s
组别
anti -miR -NC+山楂多糖提取物anti -miR -146a -5p+山楂多糖提取物t 值
P 值
miR-146a-5p 1.00±0.100.35±0.0410.4530.000
cyclinD1
0.33±0.030.96±0.1010.4520.000cleaved-caspase-3
1.12±0.120.45±0.058.9270.000
细胞增殖率/%40.76±4.0883.22±8.327.9360.000
凋亡率/%24.03±2.418.36±0.8410.6340.000
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5
注：1―β-actin ；2―cleaved -caspase -3；3―cyclinD1；4―anti -miR -NC+山楂多糖提取物；5―anti -miR -146a -5p+山楂多糖提取物。

图3
低表达miR -146a -5p 对cyclinD1、cleaved -caspase -3蛋白表达的影响
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（收稿日期：2019-11-20，修回日期：2019-12-18）
引用本文：靳立振，赵永华，于巧青.微小RNA-212调控TOB2蛋白表达对转化因子-β1干预A549细胞诱导肺纤维化及上皮-间质转化的影响［J］.安徽医药，2021，25（2）：330-335.DOI：10.3969/j.issn.1009-
6469.2021.02.029.
◇临床医学◇
微小RNA-212调控TOB2蛋白表达对转化因子-β1干预A549细胞诱导肺纤维化及上皮-间质转化的影响
靳立振，赵永华，于巧青
作者单位：廊坊市人民医院重症医学科，河北廊坊065000
摘要：目的探讨微小RNA-212（miR-212）对转化因子-β1（TGFβ1）干预A549细胞诱导肺纤维化及上皮-间质转化（EMT）的影响及可能的相关机制。

方法体外培养A549细胞，实验分组：PBS组（常规培养）、TGFβ1组（含有5ng/mL TGFβ1培养液培养）、TGFβ1+anti-miR-con组（转染anti-miR-con后使用含有5ng/mL TGFβ1培养液培养）、TGFβ1+anti-miR-212组（转染anti-miR-212后使用含有5ng/mL TGFβ1培养液培养）、TGFβ1+anti-miR-212+si-con组（共转染anti-miR-212与si-con后使用含有5 ng/mL TGFβ1培养液培养）、TGFβ1+anti-miR-212+si-TOB2组（共转染anti-miR-212与si-TOB2后使用含有5ng/mL TGFβ1培养液培养）。

实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）与蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞中miR-212与TOB2的表达水平；甲基噻唑基四唑（MTT）检测干扰miR-212的表达对TGFβ1诱导A549细胞增殖的抑制作用，以及下调TOB2的表达对TGFβ1诱导A549细胞增殖的促进作用；双荧光素酶报告基因检测验证miR-212与TOB2的靶向关系；Western blot检测干扰miR-212的表达或下调TOB2的表达对细胞周期蛋白1（CyclinD1）、波形蛋白（Vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原a1（COL1a1）、上皮钙黏附素（E-cadherin）表达的影响。

结果与PBS组比较，TGFβ1组细胞增殖率显著升高［（100.23±5.64）%比（218.34±16.38）%，P<0.05］，miR-212［（1.00±0.14）比（6.07±0.86）］、CyclinD1［（0.54±0.06）比（0.89±0.07）］、Vimentin［（0.26±0.04）比（1.09±0.13）］、α-SMA［（0.43±0.05）比（0.86±0.07）］、COL1a1［（0.57±0.06）比（1.17±0.13）］的表达水平显著升高（P<。