乌头急性中毒死亡者乌头生物碱的体内分布

乌头急性中毒死亡者乌头生物碱的体内分布
刘伟;沈敏;秦志强
【摘要】目的研究乌头急性中毒死亡者体液和组织中乌头生物碱的分布,为鸟头中毒案的法医学鉴定取材和结果评价提供参考.方法用液相色谱一串联质谱法测定中毒死亡者体液和组织中乌头生物碱的含量.结果乌头碱在死者体液和组织中的含量从大到小依次为尿液、胆汁、胃内容物、心血、胰、心、肠、肝、肾、胃、肺、胆囊、脾,脑中未检出. 结论尿液、胆汁和血液是检测体内鸟头生物碱的较佳检材.【期刊名称】《法医学杂志》
【年(卷),期】2009(025)003
【总页数】3页(P176-178)
【关键词】法医毒理学;鸟头生物碱;液相色谱-串联质谱法;体内分布
【作者】刘伟;沈敏;秦志强
【作者单位】复旦大学上海医学院法医学系,上海,200032;司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室,上海,200063;司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室,上海,200063;司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室,上海,200063
【正文语种】中文
【中图分类】DF795.1
乌头作为一种在民间广为使用的中草药，在治疗风寒湿痹、跌打损伤等疾病中有其独特功效。

但由于乌头生品或炮制品含有剧毒药物成分，使用安全范围小，如炮制
不当或服用过量，可导致人体急性中毒甚至死亡，由此产生的各种自杀、他杀及意外案件时有发生[1-2]。

有关生物检材中乌头生物碱的检测和分布研究亦有报道，
大多涉及大鼠、小鼠、兔等[3-5]，而涉及人体内乌头生物碱的资料较少[6]。

本研究运用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，对乌头急性中毒死亡者体内乌头碱（aconitine）、新乌头碱（mesaconite）和次乌头碱（hypaconitine）
成分进行定性和定量分析，通过对急性中毒者体内乌头生物碱的分布研究，为乌头中毒案件法医学鉴定的合理取材和结果评价提供参考。

1.1 材料
1.1.1 仪器
API 4000串联三重四极杆质谱仪（美国AB公司），配Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；TDZ4-WS离心机（赛特湘仪离心机仪器有限公司）；MINISPIN离心机（德国Eppendorf公司）；DKS22型电热恒温水浴锅；XW-80A涡旋混合器。

1.1.2 试剂
分别精密称取对照品乌头碱、新乌头碱和次乌头碱（中国药品生物制品检定所）适量，用体积分数0.05%的盐酸甲醇溶液配制成不同质量浓度的标准溶液。

乙腈、
氯仿、乙酸铵均为HPLC级，甲酸为优级纯，乙醚为分析纯，硼砂缓冲液pH值9.2，超纯水由Milli-Q（Millipore纯水系统）制得。

流动相缓冲液（20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液）：称取1.54 g乙酸铵和50%的甲酸1.84 g置于1 000 mL容量瓶中，加水溶解、定容至刻度，pH值约
为4；流动相：V（乙腈）∶V（20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液）=70∶30。

空白全血（经肝素抗凝）采自未服用过目标物的健康志愿者。

空白肝为猪肝。

1.2 方法
1.2.1 样品预处理
1.2.1.1 体液直接提取法
取体液（血液、尿液或胆汁）0.5 mL，加0.5 mL pH 9.2硼砂缓冲液后，用乙醚
3 mL提取，涡旋混合2 min、1650×g离心3min，将有机层转移至另一试管中，置60℃水浴中挥干，残留物用200 μL流动相溶解，供LC-MS/MS分析。

1.2.1.2 尿液沉淀蛋白提取法
取尿液0.1 mL，直接加入1 mL乙腈，涡旋混合，9030×g离心10min，上清液
供LC-MS/MS分析。

1.2.1.3 组织直接提取法
将生物组织剪碎，称取0.5g，加1.0mL pH 9.2硼砂缓冲液浸泡0.5 h后，用乙醚3 mL提取，涡旋混合2min、1650×g离心3min，将有机层转移至另一试管中，置60℃水浴中挥干，残留物用200 μL流动相溶解，供LC-MS/MS分析。

1.2.1.4 药酒直接稀释
药酒用流动相直接稀释100～1 000倍，供LCMS/MS分析。

1.2.2 LC-MS/MS检测
1.2.2.1 液相色谱条件
色谱柱：Capcell Pak C18250 mm×2.0 mm，MGⅡ5 μm（资生堂公司），前
接Phenomenex保护柱；流动相：V（乙腈）∶V（20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液）=70∶30，流速：0.2mL/min；柱温：室温；进样量：5μL。

1.2.2.2
质谱条件
电喷雾离子源（ESI），正离子扫描；多反应监测（MRM）；离子源电压（IS）：5 500 V；碰撞气（CAD）：41.4 kPa；气帘气（CUR）：69.0 kPa；雾化气（GS1）：137.9 kPa；辅助气2（GS2）：275.8 kPa；离子源温度（TEM）：400℃。

在以上色谱和质谱条件下，通过质谱参数优化，分别得到乌头碱、新乌头碱和次乌
头碱的母离子和其两个子离子组成两对母离子/子离子对。

定性分析以两对母离子/子离子对进行，定量分析则选取其第一对母离子/子离子对。

其母离子、子离子、
去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）和保留时间（tR）见表1。

某日下午15：00许，身患坐骨神经痛和腰椎间盘突出的瞿某（男，56岁）购买
了游医自制的药酒，当晚17：45许瞿某喝了约7mL药酒后，即出现呕吐、腹泻、全身麻木等症状，晚19：00许送至医院抢救，不治而亡。

瞿某自服药至死亡历时约2h。

对瞿某进行尸体解剖，取心血、尿液、胆汁、胃内容物、心、肝、肾、肺、脾、胰、胃、肠、胆囊和脑组织进行毒物分析。

3.1 乌头生物碱的校准曲线和检测限
分别在空白血或空白肝中添加乌头生物碱溶液，配制成含有乌头碱质量浓度为1～50ng/mL（g）和新乌头碱与次乌头碱质量浓度为0.1～25ng/mL（g）的系列血液和肝组织样品，按1.2项方法进行样品处理，LCMS/MS测定。

以乌头生物碱质量浓度［ng/mL（g）］为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。

乌头生物碱在血液和肝中的校准曲线方程、线性范围、相关系数（r）、检测限及提
取回收率见表2。

3.2案例检测结果
运用上述方法在死者瞿某的体液和组织（除脑组织外）中均检出乌头碱、新乌头碱和次乌头碱成分。

表3为各检材中乌头生物碱的定量结果。

从本研究案例的检验结果可见，就乌头碱而言，急性中毒死亡者的尿液中含量最高，其次是胆汁与胃内容物，再是血液，其他组织分布较均匀，脑中乌头碱未检出，因此乌头碱在急性中毒者组织和体液中的分布趋势从大到小依次为尿液、胆汁、胃内容物、心血、胰、心、肠、肝、肾、胃、肺、胆囊和脾。

鉴于尿液中乌头碱质量浓度高且较易收集，在乌头碱急性中毒临床检验中，可将尿液和血液作为检测的首选生物检材，而在乌头碱中毒死亡案例检测中，亦可采用胆汁、心血检材等作为检测
样本。

对乌头生物碱含量较高的生物检材如尿液、胆汁等，可以采用加乙腈直接沉淀蛋白、离心后取上清液进行测定，这样可以简化样品处理步骤，既能满足仪器灵敏度的要求，也能达到有效检出目标物的目的。

乌头主要有毒成分为乌头碱、新乌头碱和次乌头碱等，动物实验表明，乌头碱小鼠灌胃的LD50为1.8mg/kg，新乌头碱小鼠灌胃的LD50为1.89mg/kg，次乌头
碱小鼠灌胃的LD50为5.8mg/kg[7]。

在本研究案例中游医自制的药酒为草乌、
川乌、紫血藤、透骨草、壁虎和牛西6味中草药用普通高粱酒浸泡制得（自述）。

检验结果可见，无论是药酒还是体内生物检材中乌头碱的含量都大大高于新乌头碱和次乌头碱的含量，两者差别几十至上百倍，文献报道大多为药材中新乌头碱和次乌头碱的含量高于乌头碱的含量[8]，这可能由于不同乌头属药材的品种、产地、
来源和炮制方法不同所致。

乌头碱纯品口服致死量为3～5mg，本研究案例中瞿某所服用的药酒中乌头碱的量达4.1mg（以7mL计），已超过最小致死量。

对瞿某的尸体检验发现：死者唇黏膜高度发绀，双耳郭发绀，双手指甲床高度发绀，脑、肺均有淤血和水肿，肝、脾、肾等多器官淤血，胰腺小灶性出血，符合急性中毒的一般病理改变。

此外，尸体检验未检见致命性机械性损伤及机械性窒息的尸体征象。

综上所述，根据尸体检验所见、毒物检验结果并结合案情分析，瞿某的死亡原因系乌头碱中毒。

【相关文献】
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[4]李文东，马辰.高效液相色谱法测定大鼠组织中乌头碱的含量[J].中国实验方剂学杂志，2007，13（7）：56-58.
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[7]夏丽英.现代中药毒理学[M].天津：天津科技翻译出版社，2005：379-381.
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