β-防御素克隆表达纯化抗菌活性论文
石斑鱼β-防御素的酵母表达及其产物抗菌活性分析
石斑 鱼 － 防御 素 的酵母表 达及 其产 物抗 菌活 性分 析
金 俊琰 周 莉 桂建 芳
（ 中国科 学 院水 生 生 物 研 究 所 ，淡 水 生 态 与 生 物技 术 国家 重 点 实 验 室 ，武 汉 ４ ０ ７ ） ３０２
摘 要：防御 素是 一类 阳离 子抗 菌肽 。 研石斑 鱼 Ｂ防御 素 ．
１ 目的 基 因 ｃ Ａ 序 列 扩 增 ． ２ ＤＮ
目前 防御 素 蛋 白 的表 达 和纯 化存 在 一 定 的难
收稿 日期 ：２ １— ７２ ；修 订 日期 ： ０ １０ —２ ０ ００ —２ ２ １－５ １
根 据石斑 鱼 ｐ防御 素基 因 的成 熟肽 ｃ ＮＡ序列 ， ． Ｄ
基金 项 目：国家 自然科 学 基金项 ｌ（ ０ ３０ ７； ７ ￣ Ｕ ６ １０ ） ９ ３项 目（０ Ｏ Ｂ１６０） 水生 态与生 物技 术 国家重点 实验 室创新 项 Ｈ（８Ｂ ２ １ｃ ２ ３ １ ；淡 ｏ５
１ 材 料 与 方 法
１１ 质粒 与菌株 ．
生 物 质具有 代 替化 学合 成抗 生素 药 物 的巨大 潜力 和 应 用前 景 。目前关 于鱼 类 防御素 的研究 还不 是很 多 ， 仅 在斑 马鱼 、虹鳟 、青 鲻 以及牙 鲆 中有报 道 ［ １。 ９ ２ －】 在 前 期 的研 究 中，我 们 从 ４ 龄 雌 性 石 斑 鱼 的垂 体
成熟 肽序 列， 其 克隆 到毕赤 酵母 表达 载体 ｐ ＣＺｔ 中， 将 Ｐ Ｉｅ Ａ 构建 了石 斑鱼 ｐ防御 素 的真核表 达载 体，电击转 一
化毕 赤酵 母 ＧＳ １ 。Ｗｅｔｒ ｌｔ分析 表 明石斑 鱼 Ｂ防御素 在酵 母菌 中获得 了表 达 。体外抗 菌 实验表 明纯 １５ ｓ ｎ Ｂｏ ｅ ． 化 的重 组 蛋 白具有 抑 制大 肠杆 菌 以及 嗜 水气 单胞 菌 的作 用 ，但 是 对革 兰 氏 阳性菌 ，如金 黄 色葡 萄球 菌 和藤 黄微 球 菌的生 长没 有抑 制作用 。实验结 果表 明 酵母表 达 的石斑 鱼 Ｄ 防御 素 能够特 异地 抑制革 兰 氏்鱼 的 Ｂ 防御 素 。 Ｔｃ ＤＮ ．
人β-防御素进展论文
达，在胃窦中也有较高表达，而在甲状腺、肺、肾、子宫 和中 性 伤真核细胞，如肿瘤细胞和人的中性粒细胞。在体外，防御素
毒、抗肿瘤活性及免疫学活性。本文将对 β- 防御素的研究进 L[13]。HBD 的杀菌活性还与环境因素有关，如 pH、离子强度等，
展进行综述。
特别是在高盐浓度下，其活性大大降低，而 pH 对其影响 相 对
1 β- 防御素的概述
较 小 。实 验 已 证 明 了 高 浓 度 的 氯 化 物 可 以 加 速 某 些 白 细 胞 ( 如
β- 防御素家族包括 6 个成员，HBD-1-6[2]。β- 防御素主要表 量（LD50）为 0.46 μmol/ml，最小 抑 菌浓 度（MIC）为 15 μg/ml，
达于哺乳动物皮肤和粘膜上皮细胞，是机体抵御外界生物侵 而作者单位：对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的 MIC 为 62 μg/ml
袭和参与天然免疫应答的重要成员，具有很强的抗菌、抗病 [12]。体外实验证明大多数防御素的 MIC 范围为 0.5 ~ 10 μmol/
信号肽、原片段和成熟肽 3 个部分。HBD-1 由 36 个氨基酸组 抗真菌及病毒活性。有研究认为 HBD 可通过与病毒颗粒的直
成，约 7.0kb，其第一外显子编码信号肽和原片段，第二外显子 接作用调节 CXCR4 受体，从而阻断病毒的复制使靶细胞免于
编码成熟肽。该基因序列中没有 NF -κB 和 AP -1 的 作 用元 感染 。 [15]
食道、口腔粘膜、气管和胎盘中亦有表达，可被 TNF-a、IL-lβ、 值的哺乳动物细胞都有杀伤作用。但防御素裂解杀灭肿瘤细
葡萄球菌、铜绿霉素等诱导表达[6,7]。与 HBD-1 表达方式不同， 胞的活性要比对非肿瘤细胞的作用大(2-50)倍[16]。防御素的细
鸡β-防御素7的克隆与表达
鸡β-防御素7的克隆与表达作者：张开娟，云骜，杨猛，卢艳，王文华来源：《现代畜牧科技》 2018年第6期摘要：防御素在抗生素取代方面有良好的发展前景，但目前在防御素大规模表达方面仍有难点。
本实验着重探究如何实现防御素的大规模表达。
实验通过设计目的基因引物、PCR扩增目的基因、将鸡β- 防御素7(AvBD7)基因克隆到大肠杆菌BL21表达载体质粒pET32a中、扩增大肠杆菌、对鸡AvBD7基因进行鉴定、分离纯化目的蛋白并进行检测的过程方法，完成重组鸡AvBD7基因的克隆与表达，得到鸡AvBD7基因可以在大肠杆菌BL21中表达的结论，为鸡AvBD7基因的进一步临床应用打下基础。
关键词：β-防御素；原核表达；蛋白质诱导表达；蛋白质检测中图分类号：S8 31.2文献标识码：A文章编号：2095-9737(2018)06-0001-04防御素是一种具有广谱高效的抗微生物活性和非特异性细胞毒作用及调节体内适应性免疫的阳离子活性肽，具有独特的抗菌机理。
早在1965年由Hrish等首次从兔的PMN中提取出1种具有杀菌活性的阳离子蛋白，称为“吞噬素”，之后Zeya和Spitznageleta发现此阳离子活性蛋白富含精氨酸和半胱氨酸，并将其命名为“溶酶体阳离子蛋白”[3]。
20世纪80年代，Ganz等由于其广谱的抗微生物活性首次将其命名为“防御素”，且Evans首次从鸡的异嗜性白细胞中分别纯化得到Ga_ll_2[4]，之后国际统一将防御素命名为AvBD。
β-防御素最先从牛的支气管黏膜上皮细胞中分离得到，鸡中的防御素均为p防御素，p防御素7主要分布于鸡的骨髓。
防御素相对分子质量较小，热稳定性和水溶性均较好，可以在肠道内吸收，且防御素属于多肽成分，在体内容易被蛋白酶降解为氨基酸，动物采食后在体内一般无残留，故在畜牧业中有良好的应用前景。
但防御素在鸡体内含量较低，对其进行提取纯化不仅在技术上有一定的难度，而且若想获得大量的目的蛋白，需要投入大量的人力物力。
简论人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体
简论人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体背景介绍随着抗生素的滥用和细菌耐药性日益严重，新型抗菌剂的研究和开发变得越来越重要。
除了化学合成和天然物质之外，越来越多的研究人员关注人源大肠杆菌β防御素4（HBD-4）这一天然抗菌肽药物。
HBD-4是一种缺乏血糖基化的人源β-defensin分子，本身具有广谱的抗菌能力，可以杀死多种细菌，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和沙门氏菌（Salmonella typhimurium）等。
人体内β-defensin分子的含量与感染和疾病的预防密切相关。
因此，研究HBD-4在大肠杆菌中的融合表达，对提高HBD-4的生产水平，开发HBD-4的多克隆抗体等具有重要意义。
融合表达大肠杆菌是一种常用的蛋白质表达工具，被广泛应用于各种蛋白质表达工作中。
由于HBD-4具有生产难度和纯化成本高的问题，研究人员通常将其合成成HBD-4基因编码区域的常见片段和HBD-4全长蛋白的融合蛋白形式进行表达。
常见片段融合表达HBD-4基因编码区域的常见片段包括信号肽、proseq和成熟肽。
其中，信号肽和proseq通常作为表达过程中融合蛋白的序列，用于促进蛋白质生产和出口到外部环境中。
成熟肽则是具有抗菌活性的HBD-4部分。
信号肽和proseq的序列通常由大肠杆菌蛋白质生产工具提供，经过克隆后与成熟肽的序列进行融合，得到带有HBD-4抗菌活性的融合蛋白。
全长蛋白融合表达除了常见片段融合表达之外，还可以将HBD-4全长蛋白与融合标签进行融合表达。
融合标签通常是一种对蛋白质溶解度的改善，也可以用于纯化和定位融合蛋白。
多克隆抗体HBD-4作为一种生产难度大的抗菌肽，研究其抗菌机制和开发其多克隆抗体是很有必要的。
目前，采用兔子、小鼠等作为实验动物，通过免疫原介导的方法获得HBD-4的多克隆抗体。
这些抗体不仅可以用于HBD-4的检测和鉴定，还可以广泛应用于基础研究和生物技术领域。
鸡β-防御素-2基因的克隆及原核表达载体的构建
２１ Ｇ ｌ２基 因的 Ｒ — Ｃ ． ａ一 Ｔ Ｐ Ｒ扩 增
扩增 产 物 在 ２ ％
操作方法参照 Ｔｉ ｌ ｒ ｏ使用说 明书进行 。 ｚ 的琼 脂 糖 凝 胶 上 电泳 ， 果 见 图 １ 结 。可 见 扩 增 产物 １ ． Ｒ —Ｃ ． ２ Ｔ Ｐ Ｒ扩增 Ｇ ｌ２ 因 反转录合成 ｃ — 在 大约 １５ｐ处有 一 条 清 晰 的条 带 ， 预期 扩 增 目 ４ ａ 基 一 Ｄ ９ｂ 与
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家禽 科 学 ２ ０ ． ０８ ３
鸡 ｌ一 防御 素 一 ３ ２基 因
的克隆及原 核 表达 载体 的构建冰
王海 英 ， 克宗 ， 开松 ， 洁 祁 彭 孙
（ 安徽 农 业 大学动 物科 技 学 院 ， 安徽 合 肥 ２０ ３ ） ３ ０ ６
中图分 类号 ： ７ ３ Ｑ ５ 文献标识 码 ： Ｂ 文章编 号 ：６ ３ １８ （ ０ ８ ３ ０ ０ — ４ １７— ０５ ２０ ）—０ ６０
抗生素在治疗感染中发挥了巨大作用 ， 由于 但 不合理 的使用等导致 了大量耐药菌株的出现 ． 细菌 耐药已成为当今临床治疗中 日 益严重 的问题。 防御 素（ ｅ ｎｉ 的研究为这一问题的解决带来 了希望。 Ｄｆ ｓ ） ｅ ｎ 防御素是一类广泛存在于动植物及昆虫体 内的 、 富
ＧＡＴ Ａ ＧＣＡ Ｉ Ｃ Ｃ Ｔ ｒ ＣＡＡ ｒ ＧＧＣ一 ３ ：
合性原核表达 载体的构建 ，为下一步的蛋 白表达 、
纯化与提取 以及今 后生产 和应用鸡 Ｂ 防御 素一 一 ２
收 稿 日期 ：０ ８ １ ２ ２０— —４
￥ 金 项 目： 基 国家“６ ” 划（０ ６ Ａｌｚ ２ ） ８ ３计 ２ ０ Ａ ０ ３ ０
含半 胱 氨酸 的 阳离子 抗 菌肽 ，有 很 强 的抗 细 菌 、 抗
人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化
人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化钟志霞;阮红;范立梅;彭力;方向明;徐志南【期刊名称】《浙江大学学报（医学版）》【年(卷),期】2006(035)006【摘要】目的:研究具有生物学活性的人防御素2(HBD2)多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术.方法:PCR扩增不合前导序列的HBD2成熟肽的编码框全长的cDNA片段(smHBD2-cDNA),利用BglⅡ和BamH Ⅰ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD2-cDNA的克隆载体,利用Ncol Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶构建融合表达载体pET32-nsmHBD2-cDNA,在大肠杆菌中BL21(DE3)中诱导表达含HBD2的融合蛋白,SDS-PAGE分析产量.可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD2多肽.采用液体培养法,测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性.结果:构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD2-cDNA表达载体,1、2和4倍smHBD2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52%、48%和31%;而8倍HBD2-cDNA几乎不合可溶蛋白,目标蛋白以包含体形式表达,集中在不可溶部分.重组HBD2对E.coli K12 D31有较强的抑制作用,在终浓度约为0.4至0.5μg/ml时,90%细胞的生长被抑制.结论:采用融合表达、多拷贝串联表达方式,可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用,也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性;适当的多拷贝串联基因可以提高HBD2的产量,但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量,且易形成不溶蛋白;在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD2多肽的原核高效表达.【总页数】5页(P585-589)【作者】钟志霞;阮红;范立梅;彭力;方向明;徐志南【作者单位】浙江大学生物工程研究所,浙江,杭州,310027;浙江大学城市学院,浙江,杭州,310027;浙江大学城市学院,浙江,杭州,310027;浙江大学生物工程研究所,浙江,杭州,310027;浙江大学医学院,附属第一医院麻醉科,浙江,杭州,310003;浙江大学生物工程研究所,浙江,杭州,310027【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.重组人野生型P53融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化 [J], 苏先狮;龚国忠;肖新强;黄维亮;邓春明2.人α防御素5在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化研究 [J], 王艾平;粟永萍;程天民;邹仲敏;王军平3.人β防御素3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化与活性分析 [J], 陈姗;何凤田;董燕麟;李蓉芬;高会广;陈敏;彭家和4.合成人干细胞cDNA在大肠杆菌中的高效表达与纯化 [J], 赵志虎;马清钧5.鸡β-防御素在大肠杆菌中的高效表达及复性 [J], 邢海云;高英杰;宁官保;赵建增;乔彦良;李朝阳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
简论人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体
简论人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体背景近年来，细菌对抗生素产生的耐药性给治疗感染性疾病带来了极大的挑战。
因此，利用生物技术研发新型抗菌药物成为了解决这一问题的重要途径之一。
人体内天然存在的抗菌肽具有广谱抗菌活性和低毒性的优点，成为了研究的热点之一。
其中，人β防御素4（hBD4）具有广谱杀菌性、对多种抗生素产生耐药的菌株敏感等优点，成为了抗菌肽研究领域的重要代表之一。
目的本研究旨在利用大肠杆菌作为表达载体，实现hBD4的融合表达，并制备其多克隆抗体。
方法重组质粒搭建在pET28a载体的N端引入6个组氨酸残基的His标签和一个TEV酶切位点，构建重组质粒pET28a-His-TEV-hBD4。
大肠杆菌表达重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中转化pET28a-His-TEV-hBD4重组质粒。
利用IPTG诱导表达，将重组蛋白在SDS-PAGE中检测。
纯化重组蛋白将大肠杆菌采用超声技术破裂后，离心收集上清液，以Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白。
纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳分离并在Western blot中进行检测。
制备hBD4多克隆抗体将纯化后的蛋白注射到小鼠体内，取血清制备hBD4的多克隆抗体。
结果重组蛋白表达在重组质粒pET28a-His-TEV-hBD4导入大肠杆菌BL21（DE3）后，经过IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE检测，证实蛋白的表达成功。
纯化重组蛋白通过Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了蛋白。
用Western blot检测结果显示，蛋白具有较高的纯度。
制备多克隆抗体通过注射、回收小鼠血清，以及经过亲和层析纯化的过程，成功制备出hBD4多克隆抗体。
结论本研究成功地利用大肠杆菌表达和纯化了hBD4重组蛋白，并通过制备多克隆抗体实现了对hBD4蛋白的检测。
这为后续抗菌肽的研究提供了实验基础和技术支持。
猪β-防御素cDNA在枯草芽孢杆菌中的高效表达
猪β-防御素cDNA在枯草芽孢杆菌中的高效表达王娜;李钢;邹辉琴;温静;陈松;张皓然;苟兴华【摘要】[目的]猪β-防御素(β-defensin)是猪自身分泌的一种能够杀菌、调节免疫功能的小分子抗菌肽,是猪生长繁殖不可缺少的蛋白质.[方法]根据NCBI数据库中的猪防御素cDNA序列,人工合成该基因序列,同时引入相关调控序列及适当酶切位点.酶切该人工合成的DNA后,连接到表达载体pHT43中,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,获得的转化子用于筛选重组表达质粒.将获得的重组表达质粒pHT43-SS-BD转化到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800N中,获得基因工程菌株.使用蔗糖诱导基因工程菌表达猪β-防御素,SDS-PAGE鉴定其分子量大小,抑菌试验测定其抑菌活性.[结果]SDS-PAGE电泳结果显示在蔗糖诱导后得到约5 KDa的目的蛋白条带;平板抑菌试验结果表明,蔗糖诱导后的上清液对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌效果,而没加蔗糖的对照组上清液无抑菌效果.[结论]该研究实现猪β-防御素cDNA在枯草芽孢杆菌中的高效表达,为解决抗菌肽来源限制及枯草芽孢杆菌的生产应用奠定了技术基础.%[Objective]Porcine β-defensin (beta-defensin) is secreted by pig,and it is a small molecule antibacterial peptide which can sterilize microbe and regulate immunity,and also it is indispensable in pig's growth and reproduction.[Method] In this study,the orcine β-defensin cDNA sequence based on NCBI database was synthesized,and the regulatory sequences and restriction sites were also added to the synthesized sequence.The cDNA was digested by restriction enzyme and then inserted into expression vector pHT43 for ligation,and the production of ligation was transformed into Escherichia coli DH5α for screening of the positive expression plasmid.The pHT43-SS-BD wasselected by colony PCR and gene sequencing.The recombinant plasimid was transformed into Bacillus subtilis WB800N.When recombinant strain was induced by sucrose,the molecular size of the production of inducing was identified by SDS-PAGE,and the antibacterial activity from the inducing production was determinated by inhibition test.[Result] SDS-PAGE electrophoresis results showed that the interest protein was 5 KDa.Inhibition test indicated that the supernatant from the induced genetic engineering strain had antibacterial effect on both gram positive bacteria and gram negative bacteria.[Conclusion] The study achieved the high expression of porcine β-defense in Bacillus subtilis and paved the way for overcoming source restrictions of antibacterial peptide and for application of B.subtilis.【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2017(030)008【总页数】4页(P1910-1913)【关键词】猪β-防御素;基因表达;活性检测;枯草芽孢杆菌【作者】王娜;李钢;邹辉琴;温静;陈松;张皓然;苟兴华【作者单位】成都大学,四川成都610106;四川华德生物工程有限公司,四川成都610063;四川华德生物工程有限公司,四川成都610063;四川华德生物工程有限公司,四川成都610063;四川华德生物工程有限公司,四川成都610063;四川华德生物工程有限公司,四川成都610063;成都大学,四川成都610106【正文语种】中文【中图分类】S828【研究意义】当今世界人们的经济水平提高，对食物的品质要求也提高，猪肉已经成为人们日常生活必不可少的食物。
β-防御素的研究进展及其应用前景
８ 防御 素 由 ３ ～ ２个 氨 基酸 组成 ， 一 ８４ 信号 系列 和
前 区系列是 ２ ～ ２个 氨基酸 残基 其分 子 巾带有 较 ２３ 多 正 电荷 ． 问结 构 分 为疏 水 区 和带 点 区 ： 链折 空 肽 叠形 成 ３束 一 折叠 片层 结构 ， ６个保守 的半胱 氨 由
一
防御 素 主要 由哺乳 动物 的皮肤 、 膜等 上皮 细胞 黏
产 生 。通 过生 物信 息学 方法 鉴定 ． 在猪 体 内共 编码
了 ｌ 种 一 御 素 ，其 基 因 分 别 被 命 名 为 ：Ｂ 一 ～ １ 防 Ｐ Ｄ １
４、 ＰＢＤ 一１ ４、 ０ ＰＢＤ 一１ ８、 ０ ＰＢＤ 一１ ４、 ＰＢＤ 一１ ３、 ＢＤ — １ ２ Ｐ
酸 残 基 形 成 ３个 二 硫 键 稳 定 结 构 ． 由 Ｃ ｓ — ｙ５ ｙｌ Ｃ ｓ 、
防御素 、 一 Ｊ 防御素 、一 Ｂ 防御素 。其 中在 动物 科 学
领域 巾 。 一 Ｉ 防御素有较 好研究价 值 ， 菌谱较 广 ， Ｂ 抗 且 不 产生 抗 药性 和毒性 ． 因而受 到广 泛 关注 ， 为 近 成
２２ 结 构 与 功 能 的 关 系 ．
口 防御 素 是 １９ 一 ９ １年 Ｄ ａ ｎ ｉ ｍｏｄ等 ｌ首先 在 牛气 ｌ ｌ 管 黏膜 上皮 细胞 中发现 的 ． 又在 牛粒 性 白细 胞 中 后 发现了 ｌ ３种 与其高 度相似 、但 共有 系列 与 ａ 防 御 一 素 不同的 防御 素 ． 故被命 名 为 一 防御素 。 研究 发现 。
在畜 牧 业 中 的应 用 前 景
关 键词 ：一 御 素 ； 口 防 分子 结 构 ； 用 机 制 ； 物学 活 性 作 生
中图分 类 号 ： ８ ６７ Ｓ ｌ． 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章编 号 ：０ ７ ９１ ７ ２ ０ ０ — ０ ３ ０ １０ — ５ 一（０ ９）２ ０ ２ — ３
鸡β-防御素及其真核表达载体构建分析
试 。但 目前 关 于 将 防 御 素 的 真 核 表 达
系 统 在 鸡 体 内应 用 的 研 究 尚未 见报 道 。 关 于 真 核表 达 载 体 的 转 染 途 径 ． 目 前 大 部 分 研 究 者 认 为 ， 包 括 骨 骼 肌 和 心 肌 在 内 的 横 纹 肌 系 统 是 最 有 效 的 摄 取 外 源 基 因表 达 蛋 白抗 原 的组 织 。 肌 肉 组 织 具 有 安 全 、体 积 大 、 免 疫 接 种 容 量 大 的 优 点 ． 因此 多 被 用 来 进 行 Ｄ Ａ 免 疫 注 射 。将 编 码 １ 半 乳 糖 糖 苷 Ｎ ３ 一 酶 的 告 基 因 注 入 小 鼠后 腿 肌 肉 中 ，经 组 织 化 学 染 色 发 现 ．注 射 区 约 有 １ ０ ３ ％肌纤 维染 成 蓝 色 ，纵 向 染 色 深 度 可 ０ 达 ４ ０ ｍ．说 明 肌 纤 维 可 以 摄 取 并 表 ０￣ 达 外 源 基 因 产 物 。 用 编 码 虫 荧 光 素 酶 的 质 粒 Ｄ Ａ 免 疫 小 鼠后 发 现 ．表 达 的 Ｎ 酶 活 性 呈 Ｄ Ａ 剂 量 依 赖 关 系 ，而 且 报 Ｎ 告基因可持续表 达 １ ９个 月 之 久 。进 一 步 采 用 定 量 Ｐ Ｒ 技 术 ， 发 现 大 多 数 的 Ｃ
Ｃ ｎｉ４ ．８ ｏ ｔ ２ １ １和 Ｃ ｎｉ４ ．８ ｇ ｏ ｔ ２１ ２上 。 ｇ
对 连 接 ，构 成 反 相 平 行 的 ３股 Ｂ 片层 一 结 构 。 二 硫 键 可 以 使 小 分 子 防 御 素 紧 密 联 结 以 防 御 蛋 白 酶 水 解 ． 所 以 在 富 含 蛋 白 酶 的 吞 嗜 溶 酶 体 环 境 中 仍 能 保 持 其 特 性 ，这 也 是 防 御 素 区 别 于 其 他 抗 微 生 物 肽 的 主 要 因 素 ，鸡 Ｂ 防 御 素 一
长爪沙鼠β-防御素基因的克隆与鉴定
因此Ｂ防御 素可 能是机 体抗 感染 免疫 的第一道 防线 一
的关 键 冈子【 。 爪 沙 鼠长期 生 活 沙漠及 、干 ５ 、 卜 旱地 带 ，抗 感 染 能 力 较 强 ，本 研 究 探索 实 验动 物
化后 的 爪 沙 鼠是 否还 具有 较 强的抗 感 染能 力 。
膜Ｉ，使病 原微 生物 不 易产生 抗 性 ，因而具 有传 统
及 管理 ： 作 ｌ ：
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实验 动 物 与 比较 ｌ 芡学 Ｌ ｂ ｒ ｏｙ ｎｍａａｄＣ ｍｐｒｔ ｅＭｅｉｉ ａｏａ ｒ ｉ ｌｎ ｏ ａａｉ ｄ ｎ ｔ Ａ ｖ ｃｅ
２５ １
长 爪沙 鼠 ｐ 防御素基 因的克 隆与鉴定 ．
刘月环 一吴 旧生 施 张奎 ， ，
基 因高度 同源 。
［ 词】 关键 长爪 沙 鼠； 一 ｐ 防御素 ； 隆； 列分析 克 序
［ 中图分类 号］ ５３ ［ Ｑ９ — ３ 文献标 识码 ］ Ａ ［ 章编 号］０ ４８ ４ （０ ８０ —２ ５０ 文 １０ —４ ８２ ０ ）４０ １—５
防御素主要 是 由嗜 中性粒细 胞产生 的一类富含
１１１ 实验动 物 成年 长爪 沙 鼠，雌 雄 不限， ０ｇ ．． ５ 左 右 ， 由 浙 江 医 学 科 学 院 省 实 验 动 物 中心 提 供
［Ｃ Ｓ ＸＫ（ ２ ０ ．０ ２ 。 浙）０ ３０ ０ ］
鸭β-防御素-2基因的克隆测序与组织表达分析
Ａｂ ｔａ ｔ ｓ ｒ ｃ ：Ｄ ｕ ｋ— ｖ ｃ Ａ ＢＤ ２ ｇ ｎ ａ ｌ ｎｅ ｒ ｍ ｈｅ ｌｖ ｒ ｏ ｃ ｂ Ｔ— ｅ ｅ ｗ ｓ ｃ ｏ ｄ ｆ ｏ ｔ ｉ ｅ ｆ ｄｕ ｋ ｙ Ｒ ＰＣＲ ． Ｔ ｈ ｅ ｔ ｆ ａ ｐｌ ｅ ｅ ｌ ｎｇ ｈ ｏ ｍ ｉ ｄ ｆ
（ １．Ｃｏｌｅ ｅ ｏｆＢｉ ｏｇｙ，Ｆｏ ｈａ ｃ ｅ ｅ ａ ｄ Ｔ ｅ ｈｎｏ ｏ ｌｅ ｌ ｇ ｏｌ ｓ ｎ Ｓ ｉｎｃ ｎ ｃ ｌ ｇｙ Ｃｏ ｌｇｅ，Ｆｏｓ ａ ５２ ３１，Ｃｈｉ ｈ ｎ ８２ ｎａ；
２ ．Ｃ ｌ ｇ ｆＡｎ ｍａ ｃｅ ｃ ，Ｓ ｕ ｈ Ｃｈ ｎ ｒｃ ｌｕ ａ ｉｅ ｓｔ ，Ｇｕ ｎ ｚ ｏ １ ６ ２，Ｃｈ ｎ ） ｏ ｌ ｅｏ ｉ ｌ ｉｎ ｅ ｏ ｔ ｉ ａＡｇ ｉｕ ｔ ｒ ｌＵｎ ｖ ｒ ｉ ｅ Ｓ ｙ ａ ｇｈ ｕ５ ０ ４ ｉａ
பைடு நூலகம்
Ｋｅ ｒ ｓ Ｂｄ ｆ ｎ ｉ ｙｗｏ ｄ ：— ｅｅ ｓｎ；ｄ ｃ ｕ ｋ；ａ ｔ ｃ ｏ ｉｌ ｅ ｔｄ ｓ ｅ ｅｅ ｐ ｅ ｓｏ ｎ ｉ ｒ ｂ ａ ｐ ｉｅ ；ｇ ｎ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｍｉ ｐ
防御 素是 一类 古 老 的 内源 性抗 菌 多 肽 ， 泛存 广
ｐａ ｃ ｅ ｓ，ｐｒ ｅ ｒｃ ｕｓ ｏ ｓ ｈａ ｕｓ， ｇ ｚ ａ ｄ， ｔ ｇｕ ｎ ｒａ ｏｖ ｎｔ ｉｕｌ ， ｅ ｏｐ ｇ ｉｚ ｒ ｏｎ ｅ， ｓ ａ ｌ ｎｔ ｓ ｉ ｅ， ｏｖ ｒ ｍ ｌ ｉ ｅ ｔｎ ａ ｙ， ｓ ｎ ａ ｕｓ ｌ ｈｏ ｅ ｋｉ ｎｄ ｍ ｃｅ ｓ ｗ ｄ ｎｏ ｄ ｔ ｃ ａ ｅ ｌ ｖ ｌｏ ｅ ｅ ｔ ｂｌ ｅ ｅ ｆｄｕｃ — ｖ ｋ Ａ ＢＤ ２ ．
Ｃ ｉｅ ｅＪ ｕ ｎ ｌ ｆ ｔ ｒ ａ ｙＭｅ ｉ ｎ ｈｎ ｓ ｏ ｒ ａ ｏ ｅｉ ｒ ｄｃ ｅ Ｖｅ ｎ ｉ
人β防御素3进展论文
人β防御素3研究进展【中图分类号】r574 【文献标识码】a 【文章编号】1672-3783（2012）10-0469-01防御素是生物体内产生的一类具有强烈抗菌作用的多肽类物质，因具有独特的抗菌机制和广谱抗菌、抗病毒活性而日益受到人们的关注。
人体主要以α-防御素、β-防御素两种为主，目前已经识别和分离出6种α-防御素和6种β-防御素。
其中β防御素主要来源于皮肤、呼吸道等上皮组织，2000年，harder等1从银屑病皮损组织中发现hbd-3，它可以有效抵御革兰阳性和阴性菌，并采用金黄色葡萄球菌亲和柱进行了分离纯化，从蛋白水平上首次发现了hbd-3。
同时，jia等2 采用基因组搜索比对的方法也发现了hbd-3基因。
人β-防御素3 由于在抗菌谱和盐离子敏感度等方面表现出了与其它几种人β防御素不同的特性和优越性，而被认为具有独特的研究和开发价值。
1. hbd-3的分子生物学特征1.1 蛋白结构 hbd-3是一个包含45个氨基酸残基的阳离子短肽，相对分子质量为5 150，与其他防御素相似，均含有6个保守的半胱氨酸，通过cys1-cys5、cys2-cys4、cys3-cys6方式连接，形成3个分子内二硫键3。
对hbd-3二级结构的研究表明，氨基末端6个残基后面是由第10～14位的氨基酸残基组成的小的α螺旋结构，再后面是3个反向平行的β折叠片结构4。
1.2 基因定位hbd-3基因定位于人的第8号染色体的p22～23区域内，位于hbd-2基因上游13 kb处，具有相同的转录方向。
基因全长204 bp，包括2个外显子和1个内含子。
2. 组织分布及基因表达hbd-3主要由上皮细胞和内皮细胞产生，主要在人的角化细胞和气道上皮细胞内表达。
hbd-3除组成性的基础表达外还可被诱导表达。
hbd-3在正常状态下甚少表达，可被许多物质上调，如il-1β、tnf-α、细菌、真菌、病毒、脂多糖等1，5。
3. hbd-3 的生物学功能3. 1 抗微生物活性hbd-3因具有独特的抗菌机制和广谱抗菌、抗病毒活性而日益受到人们的关注。
猪β-防御素-2的重组表达及体外抑菌和抗病毒试验研究的开题报告
猪β-防御素-2的重组表达及体外抑菌和抗病毒试验研究的
开题报告
研究背景：
猪β-防御素-2 (pBD-2) 是一种天然防御肽，它在家畜的免疫系统中起着抵御病原有害菌感染的重要作用，具有广谱抗菌和抗病毒活性。
研究表明，pBD-2对多种细菌、真菌和病毒均有抑制作用，包括病毒性疾病如禽流感和猪瘟等。
因此，pBD-2被认为
是一种非常有潜力的天然免疫调节剂和抗感染药物。
目的：
本研究旨在通过重组表达技术制备猪β-防御素-2，并研究其体外抑菌和抗病毒活性，为进一步探讨其作用机制和开发新型抗感染药物提供理论依据。
研究内容：
1.利用基因工程技术、分子生物学技术和细胞培养技术等手段，构建pBD-2基因表达载体，并在大肠杆菌Bl21(DE3)中进行高效表达。
2.采用纯化技术提取重组pBD-2蛋白，通过SDS-PAGE和Western blot等方法对其进行鉴定和纯化。
3.利用体外抗菌和抗病毒实验方法，对重组pBD-2的抑菌和抗病毒活性进行评价，比较其与其他抗生素和抗病毒药物的活性差异。
预期成果：
本项研究的预期成果为，成功构建猪β-防御素-2基因表达载体，制备出高效纯化的重组pBD-2蛋白，并通过体外实验验证其广谱的抗菌和抗病毒活性。
这将拓展pBD-2的研究领域，为开发新型抗感染药物提供基础数据和理论依据，也为研究抗菌肽等
天然免疫调节剂在动物保健和治疗方面的应用提供新的思路和方向。
鸡β-防御素7的克隆及表达
鸡β-防御素7的克隆及表达易道生;魏晓东;缪永建;陈燕飞【摘要】A pairs of primers used in polymerase chain reaction (PCR) was designed following the NM_001001194 from GenBank to amplify the beta defensin 7 gene of chicken. The total RNA was isolated from spinal cord cells of chicken,and the first cDNA strand was obtained by approach of reverse transcription PCR. The products of PCR were linked with T plasmid vectors,and then transformed into Escherichia coli(E. Coli) DH5αstrain cells subsequently. Expressional plasmid vector,pET32a-gal7,was reconstructed with restriction endonuclease Hind Ⅲ and BamH I. Recombinant plasmid vector,pET32a-gal7,was induced with Isopropyl-β-D-Thiogalacto Pyranoside (IPTG) in E. Coli DE3 strain cells to produce recombinant Gal7 protein. The results showed that the cloned cDNA sequence of beta defensin 7 gene of chicken was comprised of 132 nucleotide acid residues,and encoded the beta defensin 7 with 44 amino acids and predicted molecular weight 4923.81Da. The identity to NM_001001194 is 99%. The recombinant peptides had strong antibacterial activity against staphylococcus aureus in vitro.%以NCBI已登录的鸡β-防御素7(登录号:NM_001001194)为模板,设计特异性引物,扩增鸡β-防御素7基因,目的基因与pET32a载体相连,构建表达质粒并导入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达和抗菌试验.结果表明,PCR扩增的目的片段,经测序证明与鸡β-防御素7基因NM_001001194序列同源性达99%,经IPTG诱导表达的重组蛋白与预期大小相符.平板抑菌试验结果表明,该重组多肽对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌活性.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2018(045)002【总页数】5页(P130-134)【关键词】β-防御素;克隆;原核表达;基因重组【作者】易道生;魏晓东;缪永建;陈燕飞【作者单位】韶关学院英东生命科学学院,广东韶关 512005;韶关学院英东生命科学学院,广东韶关 512005;韶关学院英东生命科学学院,广东韶关 512005;韶关学院英东生命科学学院,广东韶关 512005【正文语种】中文【中图分类】S813.3;Q786抗菌肽是具有抗菌、抗病毒作用的小分子多肽，防御素是一类重要的抗菌肽，抗菌肽广泛存在于动物、植物和微生物中，哺乳动物防御素包括α-防御素、β-防御素和θ-防御素三亚类［1-2］。
关于鸡β-防御素AvBD-5免疫活性的探究
关于鸡β-防御素AvBD-5免疫活性的探究发布时间：2021-03-01T06:50:41.828Z 来源：《学习与科普》2020年18期作者：姚燕楠翁妙蓉王艳[导读] Lynn等人在前人研究的基础上于2007年发现了十四种鸡防御素的存在，拓展了禽β-防御素的研究，使得鸡β-防御素被重新命名。
海南大学海南海口 570100摘要：作为一种新型的生物活性肽，防御素含有众多的生物学活性，使微生物不容易产生抗性，有着超强的抗微生物作用，有着广泛的应用前景。
研究以鸡β-防御素为例，首先梳理了鸡β-防御素基因结构组成以及抗菌机理，并对鸡β-防御素AvBD-5进行了获取，最后分析了鸡β-防御素AvBD-5免疫活性的效果。
关键词：鸡β-防御素；AvBD-5；免疫活性引言Lynn等人在前人研究的基础上于2007年发现了十四种鸡防御素的存在，拓展了禽β-防御素的研究，使得鸡β-防御素被重新命名。
作为抗微生物多肽的一种，禽β-防御素AvBD-5中有着良好的免疫活性[1]。
由于含有阳离子以及疏水氨基酸残基，鸡β-防御素能够进行免疫调节，具有光谱的抗菌活性。
由于AvBD-5主要存在在禽类的舌头部位，研究从粤黄鸡舌头组织中将鸡β-防御素AvBD-5以及AvBD-5成熟肽基因进行克隆，从而探讨鸡β-防御素AvBD-5作为一种新型免疫佐剂的可能性。
1 鸡β-防御素抑菌基本概况1.1 鸡β-防御素基因机构作为生物体天然免疫的重要成分，防御素是广泛存在植物、动物、昆虫体内的内源性抗菌肽，根据来源和分子结构的不同，分为α、β以及θ-防御素[2]。
有关数据表明，鸡体内的基因能够编码呈十四种β-防御素，被命名为AvBD-1~AvBD-14。
其中，经过编码的十四种鸡β-防御素的基因结构十分紧凑，处于q3.5~q3.7鸡的第三号染色体上，它们的大小仅仅为86kb。
鸡β-防御素基因中总共包含四个外显子，但由于AvBD12处于末端的两个外显子进行了融合，实际上来说只有三个外显子。
蒙古绵羊β-防御素的纯化及其抗菌活性研究
蒙古绵羊β-防御素的纯化及其抗菌活性研究李咏兰;邵艳红;邱广亮;王秀梅;曹贵方【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2008(044)002【摘要】采用高盐低pH缓冲液进行粗提,粗提液经阳离子交换层析-RP HPLC-Sephadex G25凝胶过滤-C18 RP-HPLC纯化,得到纯化多肽.尿素-Tricine-SDS PAGE测定其分子量为3.8 kDa,215 nm具最大吸收.对E coli、S.aureus、B.proteus和B.subtilis有强的抗菌活性.【总页数】3页(P9-11)【作者】李咏兰;邵艳红;邱广亮;王秀梅;曹贵方【作者单位】内蒙古农业大学动物科学与医学学院,内蒙古,呼和浩特,010018;内蒙古师范大学生物工程研究中心,内蒙古,呼和浩特,010022;内蒙古农业大学动物科学与医学学院,内蒙古,呼和浩特,010018;内蒙古师范大学生物工程研究中心,内蒙古,呼和浩特,010022;内蒙古农业大学动物科学与医学学院,内蒙古,呼和浩特,010018;内蒙古农业大学动物科学与医学学院,内蒙古,呼和浩特,010018【正文语种】中文【中图分类】S852.4【相关文献】1.融合防御素基因BH的真核表达产物体外抗菌活性研究 [J], 陈建林;高荣2.猪β-防御素体外抗菌活性和抗氧化活性研究 [J], 薛现凤;韩菲菲;高彦华;刘倚帆;夏溪;汪以真3.重组小鼠β-防御素2的纯化及其对非分型流感嗜血杆菌抗菌活性的测定 [J], 姚锋;张玉泉;张建林;杨益梅;王姗姗;陈程;张俊荣4.重组小鼠β-防御素2的纯化及其对非分型流感嗜血杆菌抗菌活性的测定 [J], 姚锋;张玉泉;张建林;杨益梅;王姗姗;陈程;张俊荣;5.猪β-防御素体外抗菌活性和抗氧化活性研究 [J], 薛现凤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
牛防御素BNBD4成熟肽的真核表达及纯化
Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2019, 9(4), 169-176Published Online October 2019 in Hans. /journal/hjbmhttps:///10.12677/hjbm.2019.94025Eukaryotic Expression and Purificationof Mature Bovine Neutrophil β-Defensins 4Jingjing Kang, Yuchen Wu, Zhengxing Yin, Qin Luo, Jun Huo*Department of Veterinary Medicine, Henan University of Animal Husbandry and Economy (Longzihu Campus), Zhengzhou HenanReceived: Oct. 9th, 2019; accepted: Oct. 22nd, 2019; published: Oct. 29th, 2019AbstractBovine neutrophil β-defensins 4 (BNBD4) is one of the antimicrobial peptides which naturally exists in bovine pulmonary alveolar macrophages. In this study we will clone the CDs sequence of mature BNBD4 gene, and connect it to the eukaryotic expression vector pPIC9K to construct recombinant plasmid mBNBD4-pPIC9K, and purify it by Ni-sepharose after inducing expression. Finally, we can successfully obtain the recombinant protein mBNBD4 by Tricine SDS-PAGE detection and Western Blot identify, therefore to provide the experimental materials for the further study of mature BNBD4.KeywordsDefensins, BNBD4, Mature Peptide, Eukaryotic Expression, Purification牛防御素BNBD4成熟肽的真核表达及纯化康静静，吴玉臣，阴正兴，罗琴，霍军*河南牧业经济学院动物医药学院(龙子湖校区)，河南郑州收稿日期：2019年10月9日；录用日期：2019年10月22日；发布日期：2019年10月29日摘要牛β防御素4 (BNBD4)是一种天然存在于牛肺脏肺泡巨噬细胞内的抗菌肽，本研究拟通过克隆BNBD4成熟肽片段的编码区序列，连接至真核表达载体pPIC9K构建重组质粒mBNBD4-pPIC9K，转化至毕赤酵母*通讯作者。
鸡β-防御素-1重组毕赤酵母的制备与表达
重组酵母菌表达
Muts胞内表达:可培养培养基中)检测培养条件的效率。记住要用转化亲本载 体的GS115作为胞内表达的背景对照。 1 挑取单克隆，接种至含100mlMGY，BMG或BMGY的1L 隔板摇瓶中。在摇床中28-30度，250-300rpm生长至 OD600=2-6(约16-18小时) 2 室温1500-3000g离心5min 收集细胞，去除上清，用1/51/10原培养基体积的MM，BMM或BMMY重悬细胞(约1020ml) 3 置于100ml隔板摇瓶中，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住 瓶口，放入摇床继续培养。
鸡β-防御素-1重组毕赤酵母的 制备与表达
姓名：庄 杰 导师：张兴群
概述
β-防御素是鸡体内的一种重要抗菌肽，除了具 有直接的杀菌、抗病毒作用外，它还参与机体免疫 反应，如今由于抗生素的滥用引发的问题而日益引 起人们广泛关注。 动物防御素具有代替传统抗生素的潜力，主要 表现在：抗菌谱广，免疫原性无或低，对人畜无毒 副作用，无残留，无耐药性，热稳定性和溶解性良 好，对较高离子强度或较大pH变化耐受性较好。因 此，防御素越来越受到研究人员的关注。
1 在医药行业的应用 细菌对传统抗生素的耐药性是当今全球性难题，防御素 因其具有广谱的抗菌活性，独特的抗菌机理，并与典型的 抗生素具有协同作用，能中和内毒素，调节机体免疫应答 和炎症反应，调节组织创伤修复等特点引起了人们的广泛 关注 2 在食品行业的应用 在食品方面，防御素主要用作防腐剂，防止食品腐败变 质。
重组酵母菌表达
换气：毕赤酵母高效表达的重要因素是在甲醇诱导
时充分换气。基本上在诱导时，培养基不要超过摇 瓶体积的10-30%。建议使用隔板摇瓶，用2-3 层干 酪包布或松散合适的盖子盖住摇瓶，不要用很紧的 盖子。(换气在诱导前大量培养时并不那么重要)
小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究
小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究江滟;王保宁;杨晓芳;李婉宜;刘冯欢;蒋忠华;李明远【期刊名称】《西部医学》【年(卷),期】2009(21)7【摘要】目的构建小鼠β防御素3(mouse β defensin 3,mBD3)基因的原核表达载体pET-32a(+)/mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性.方法运用PCR技术从质粒pcDNA3.1(+)/mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a(+)原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和洲序鉴定.将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami(2),用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达.采用SDS-PAGE和Western Blot鉴定融合蛋白.通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用徽量液体稀释法测定融合蛋白鼠β防御素3(fmBD3)的抗菌活性.结果 mBD3的原棱表达载体pET-32a(+)/mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白.fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌无作用.结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗徽生物活性奠定了实验基础.【总页数】4页(P1091-1094)【作者】江滟;王保宁;杨晓芳;李婉宜;刘冯欢;蒋忠华;李明远【作者单位】四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室,四川,成都610041;四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室,四川,成都610041;四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室,四川,成都610041;成都康华生物制品有限公司,四川,成都,610100;四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室,四川,成都610041;四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室,四川,成都610041;四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室,四川,成都610041;四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室,四川,成都610041;四川大学口腔疾病国家重点实验室,四川,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】R3;Q51.7【相关文献】1.构建大肠杆菌表达GST兔防御素NP-1融合蛋白表达载体的研究 [J], 徐文生;许杨;向前2.小鼠beta防御素2原核表达与抗菌作用的初步研究 [J], 魏晓丽;金一帮;朱明;李亮;温浩3.大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因的研究 [J], 赵亚华;徐来祥;张建军;黄蓬亮;许少鹏;宋铭晶4.鸡β-防御素-1基因在大肠杆菌中的融合表达及其初步纯化与抗菌活性测定 [J], 吴静; 史玉颖; 李玉峰; 马秀丽; 黄兵; 宋敏训5.人防御素HNP-1在大肠杆菌中的融合表达及可溶性研究 [J], 徐伟; 林陈水; 杨文花; 孟跃; 卢美珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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β-防御素克隆表达纯化抗菌活性论文
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【摘要】防御素不仅作为抵御微生物入侵的第一道屏障在肠道中发挥重要作用,而且也是一种先天免疫系统的重要组成部分。
防御素是一类平均分子量为3.5～6kDa的具有广谱抗菌活性的短肽,通常由29～54个氨基酸组成,富含半胱氨酸和精氨酸,表现出较强的阳离子特性与热稳定性,是天然宿主识别微生物的基础。
防御素的生物活性多样,具有广泛杀菌活性,对细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种微生物都具有杀伤作用,还具有细胞毒性和免疫细胞有趋化功能.调节机体
的免疫系统。
根据斑马鱼（Danio rerio）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）beta-defensin-like2（defbl2） mRNA （GenBank序列号
NM001081554.1, NM001195168.1）和石斑鱼的beta-defensin gene （GenBank序列号：JN698964.1）,进行序列的多重对比,发现三个序列具有高度同源性,设计特异性引物,以草鱼肠道总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出了160bp草鱼β-防御素的基因,对防御素基因进行克隆并对克隆载体及pET-32a载体双酶切后进行连接,构建了高效原核表达载体pET32-GBD。
将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21
中进行表达,SDS-PAGE电泳和Western Blot分析表明GBD重组蛋白分子量大约为22kDa,并具有抗原性。
通过Ni2+亲和层析方法纯化GBD 重组蛋白,蛋白纯度均在95%以上。
而经肠激酶酶切以后的重组防御素只有5KD,对其抗菌活性和GBD抗菌谱进行了分析,发现其对沙门氏菌、嗜水单胞菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、
鱼害粘球菌都有明显的抑制作用。
证明草鱼肠道β-防御素具有广谱抗菌活性,对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌均有抗菌效果。
【关键词】草鱼；β-防御素；克隆；表达；纯化；抗菌活性；
【篇名】草鱼肠道β-防御素克隆表达及抗菌活性分析
【目录】草鱼肠道β-防御素克隆表达及抗菌活性分析摘要4-5Abstract5第一章前言10-21 1 防御素的分类和结构特征10-14 1.1 动物防御素10-13 1.1.1 α-防御素11 1.1.2 β-防御素11-12 1.1.3 θ-防御素12-13 1.2 昆虫类防御素13 1.3 植物类防御素
13-14 2 防御素的生物学活性14-18 2.1 抗细菌活性14-15 2.2 抗病毒活性15 2.3 免疫学活性
15-17 2.4 细胞毒作用和抗肿瘤作用17 2.5 抗真菌作用17-18 3 防御素的作用机理18 3.1 防御素抗细菌的作用机理18 3.2 防御素抗病毒的作用机理18 4 防御素的应用前景18-21 4.1 防御素在医学中的应用
18-19 4.1.1 防御素治疗肺部疾病18-19 4.1.2 防御素治疗黏膜疾病19 4.2 防御素的临床药用研究
19-20 4.3 防御素在畜牧业中的应用20-21第二章草鱼肠道β-防御素的分子克隆与重组载体的构建21-36 1 实验材料与设备21-23 1.1 实验动物、菌种及质粒21 1.2 主要设备与仪器21-22 1.3 试剂与试剂盒22 1.4 接头与引物22-23 2 实验方法23-32 2.1 动物材料处理
23 2.2 总RNA的提取23-24 2.3 RNA含量和纯度的检测24 2.4 草鱼肠道β-防御素的RT-PCR24-25 2.5 草鱼肠道β-防御素基因PCR扩增25 2.6 DNA核酸电泳检测
25 2.7 PCR产物的提纯25 2.8 CaCl_2法制备感受态细胞25-26 2.9 TA克隆26-27 2.10 PCR检测
27-28 2.11 pMG-T-GBD质粒的提取28-29 2.12 DNA定量29 2.13 pMG-T-GBD和pET32a(+)载体的双酶切
29-30 2.14 酶切产物的回收与纯化30 2.15 GBD与pET32连接反应30-31 2.16 重组质粒pET32-GBD的转化和蓝白斑筛选31 2.17 重组质粒pET32-GBD的PCR鉴定
31 2.18 重组质粒pET32-GBD的提取31 2.19 重组质
粒pET32-GBD的酶切31-32 2.20 重组载体pET32-GBD的测序鉴定32 3 结果与分析32-35 3.1 草鱼肠道β-防御素RT-PCR扩增32-33 3.2 克隆载体pMG-T-GBD的酶切鉴定
33 3.3 重组质粒pET32-GBD的PCR和酶切鉴定33-35 4.讨论35-36第三章草鱼肠道β-防御素的高效表达及抗菌活
性分析36-49 1 实验材料与设备36-37 1.1 实验动物、菌种36 1.2 主要设备与仪器36-37 1.3 试剂与试剂盒37 2 实验方法37-42 2.1 草鱼肠道β-防御素的诱导
表达37-38 2.2 细菌超声破碎38 2.3 草鱼肠道β-防
御素表达蛋白的SDS-PAGE检测38 2.4 草鱼肠道β-防御素重组蛋白的纯化38-39 2.5 草鱼肠道β-防御素重组蛋白的透析
39-40 2.6 草鱼肠道β-防御素多克隆抗体的制备
40 2.7 草鱼肠道β-防御素重组蛋白含量测定
40-41 2.8 草鱼肠道β-防御素重组蛋白的Western-Blot鉴定41 2.9 重组肠激酶酶切鉴定41-42 2.10 抗菌活性测定42 2.11 抗菌谱分析42 3 结果分析
42-47 3.1 草鱼肠道重组β-防御素诱导表达结果分析
42-43 3.2 草鱼肠道β-防御素重组蛋白的Ni~(2+)-NTA柱亲和层析纯化43-44 3.3 草鱼肠道β-防御素重组蛋白的Western-Blot结果44-45 3.4 草鱼肠道β-防御素重组蛋白肠激酶酶切45 3.5 草鱼肠道β-防御素重组蛋白抗菌活性测定45-46 3.6 草鱼肠道β-防御素重组蛋白抗菌谱分析
46-47 4 讨论47-49第四章结论49-50参考文献50-59主要英文缩写59-61致谢61-62作者简介62。