毒理学——精选推荐

杂环胺8-MeIQx 的毒性研究
前言：食物烹饪及加工除了可使食物具有可食性外。

还会产生一些危害食用者健康的遗传性毒物，如亚硝胺，多环芳烃 ( P AHs )、杂环胺 ( HCAs )等。

1977年 Sugimurra 从食物中分离 出了 HCAs ，并检测出 HCAs 的致突变相当于迄今用 Ame s 实验检测到的摄有象变活力的毒物的水平。

远远大于PAHs 所产生的致突变性现已证实，HCA 进入人体后。

主要是在P450细胞色素氧化酶的作用下，发生N-氧化和 O-己酰化反应生成DNA 加合物，产生致突变和致癌作用。

食物中主要存在氨基咪唑吖类杂环胺和咔啉娄杂环胺两大类。

氨基咪唑吖类杂环胺含有 2-氨基眯唑基团．可以熔合成一个喹啉，一个喹喔啉或一个吡啶环。

杂环胺的生成与食物的性质和烹饪的方式有关．温度是一千重要影响因素。

杂环胺的致癌性及其作用机制:对多种器官具有致癌性；间接致癌物，致癌机理：N －羟基化活化后的HCAs 带正电荷与DNA 形成加合物。

关键词：杂环胺 8-MeIQx 毒性
杂环胺的物理化学性质
杂环胺分为两大组：
氨基咪唑氮芳烃类：喹啉类（IQ)、喹喔啉类（IQX)、吡啶类（PhIP); 氨基咔啉类：α-咔啉（A αC ）；δ-咔啉；γ-咔啉；
8-MeIQx 分子量213.2 元素组成 51111N H C UVmax 264 pKa < 2, 6.3
1、急性实验
1.1 目的与要求
1、学习急性毒性试验的方法，掌握LD50的测定方法。

2、观察杂环胺8-MeIQx 的毒性反应。

1.2 实验原理
急性毒性试验是指受试动物在一次大剂量给药后所产生的毒性反应和死亡情况。

药物毒性的大小，常用动物的致死量来表示，因为动物生与死的生理指标较其他指标明显、客观、容易掌握。

致死量的测定也较准确。

在测定致死量的同时，还应仔细观察动物是否出现耸毛、倦卧、耳壳苍白或充血、突眼、步履蹒跚、肌肉瘫痪、呼吸困难、昏迷、惊厥、大小便失禁等不良反应。

致死量的测定常以半数致死量为标准。

半数致死量是指能够引起试验动物一半死亡的剂量，半药物致死量对数值，用符号LD50表示。

由于LD50的测定较简便、可靠，而且稳定，现已成为标志动物急性中毒程度的重要常数。

LD50测定的方法有多种，如Bliss法、改进寇氏法、简化机率单位法、累积插值法、机率单位-加权直线加归法等等。

以上方法虽各有特点，但都有共同的要求：（1）动物：选用体重120～150克（同次试验体重相差不得超过10克）健康大鼠作实验动物。

性别相同或雌雄各半。

（2）给药途径：要求采用两种给药途径，其中必须有一种与临床所采用的相同。

溶于水的药物沿须测定静脉注射的LD50。

值得提出的是，临床上虽然不用腹腔注射，但动物实验因腹腔注射给药方便，吸收迅速，颇为常用。

若供试药物在腹腔内不引起强烈刺激或局部变化（如纤维性病变等），那么啮齿类动物腹腔注射的LD50，参数很接近于静脉给药的LD50。

口服制剂无法通过注射给药途径时，可只用胃肠给药。

（3）试验周期和观察指标：给药后至少观察7天。

观察期间应逐日记录动物的毒性反应情况和死亡动物的分布。

（4）正式试验前，均须先用少量动物进行预试试验，大致测出受试药物引起0%和100%死亡率的致死量范围，然后安排正式试验。

正式试验组数不得少于三个剂量组，一般选用4～5个剂量组，每组动物数为10～20只。

（5）报告LD50时需注明实验动物的种属及品系、性别、体重范围、给药途径及每个剂量组动物数等，还需注明受试药物的配制方法、给药剂量、各组剂量间的比值（一般以0.65～0.85为宜）、给药容积、观察时间及计算方法。

还须标出LD50的95%可信限。

1.3 实验材料和试剂
动物：大鼠
药品：杂环胺8-MeIQx 水煎液
器材：注射器、灌胃针头、鼠笼
1.4 操作方法
1.4.1 预试实验
预试实验目的是为了找出引起动物0%（Dn）和100%（Dm）死亡的剂量，以便安排正式实验。

预试实验一般采用少量动物（6～9只大鼠）进行，将动物随机分为3组，组间剂量比值一般以1：0.5或1：0.7为宜。

灌服或腹腔注射量以0.2ml/10g体重为度。

预试实验应进行到找出Dn和Dm后方可安排正式实验。

1.4.2 正式实验
在预试实验测得Dn和Dm的剂量范围内设4～6个剂量组，最多10组。

最理想的结果是使LD50的上下各有2～3组。

组数愈少，准确性愈差。

各剂量组的动物要求相等，至少10只动物（分组时应注意分层随机均匀化的原则）。

本实验要求最大反应率为100%，最小反应率为0%，或至少反应率接近100%或0%。

组间剂量比值（1：K），常用1：0.8或1：0.75。

如实验中出现相邻剂量有重复的100%和0%反应率时，应将靠边的组弃去不计，使大剂量组只有一个100%的反应率，小剂量组也只有一个0%的反应率。

分组完毕和各组剂量算出后，分组灌服或注射不同剂量的受试药物。

为能得到理想的结果，实验最好从中间剂量开始，以便从最初几个剂量组动物接受药物后的反应来判断两端剂量是否合适，便于调整剂量和组数。

为了提高实验的精确度和节省药物，受试药物可按“低比稀释法”配置。

即使每只动物的用药体积相等（0.2ml/1kg），而溶质不等。

给药后逐日观察并记录中毒反应、死亡率和死亡情况。

1.5 实验结果记录与计算
组别剂量
g/kg(d)Logd(X)死亡数死亡率
（P）
P2P-P2
1 2
3
4
公式1: LD50 =1
lg (Xm-i(ΣP-05))
公式2：Sx50=i*
公式3：LD50的95%可信限=lg-1（X50±1.96S X50）
LD50的平均可信限= LD50±（LD50高限- LD50低限）/2
Xm：最大剂量组剂量的对数值
i：相邻两组剂量（d）对数值之差，或相邻两组高剂量与低剂量之比的对数。

P：各组动物的死亡率，用小数表示。

ΣP：为各组动物死亡率的总和。

n：每组动物数。

Sx50：logLD50的标准误差。

2、慢性毒性——致癌试验
2.1 概念和试验目的
2.1.1 慢性毒性概念
慢性毒性是指以低剂量外来化合物长期给予实验动物接触，观察其对实验动物所产生的毒性效应。

2.1.2 试验目的
慢性毒性试验是确定外来化合物的毒性下限，即长期接触该化合物可以引起机体危害的阈剂量和无作用剂量。

为进行该化合物的危险性评价与制定人接触该化合物的安全限量标准提供毒理学依据，如最高容许浓度和每日容许摄入量等。

2.2 实验材料和方法
2.2.1受试物
杂环胺(纯度为99。

9％)。

将其混匀于饲料作为染毒试剂。

2.2.2 动物的选择
动物种类对受试化学物的代谢方式应尽可能与人类相近。

进行毒理学评价时，优先考虑哺乳类的杂食动物。

如大鼠是杂食动物，食性和代谢过程与人类较为接近，对许多化学物质的毒作用比较敏感，加上具有体形小，自然寿命不太长，价格便宜，易于饲养等特点，故在毒理学试验中，除特殊情况外，一般多采用大鼠。

对种属相同但品系不同的动物，同一种化学物质有时可以引发程度不同甚至性质完全不同的反应。

因此，为了减少同种动物不同品系造成的差异，最好采用纯系动物(指来自同一祖先，经同窝近亲交配繁殖至少20 代以上的动物)或内部杂交动物(指来源于同一部门同一品系经多代繁殖所得的动物)和第一代杂交动物(指两种纯品系动物杂交后所得的第一代杂交动物)进行实验。

这些动物具有稳定的遗传特性，动物生理常数、营养需要和应激反应都比较稳定，所以对外来化合物的反应较为一致，个体差异小，重复性好。

本次试验采用无特定病原体SPF级健康刚断乳的Wistar大鼠200只（最好都在4周龄之前），体重(60±5)g；雌雄各半，实验室温度22—25℃，湿度65％一80％。

2.2.3实验方法
参照GBl5670--1995《国家农药登记毒理学试验方法》进行实验。

2.2.4实验动物的饲养管理
实验动物的喂养条件与喂养环境可以影响外源化学物的毒性效应，为此应该给实验动物提供营养合理的饲料以及清洁、充足的饮水，动物应保持清洁以及适宜的温度和湿度，此温度22—25℃，湿度65％一80％。

笼具应保证实验动物能自由活动，不拥挤，不得使用消毒剂和杀虫剂等药物，动物饲料罐中的饲料每周至少要更换2次。

2.2.5染毒途径
把杂环胺混入饲料中或溶于饮水中，由大鼠自由摄入，或用管饲法连续(7天／周)给予动物。

每日染毒，连续给予。

试验期间，每日定时定量染毒，称量当日给食量和次日节余量，结算每日摄入量，自由饮水。

饲养配料时，应保证杂环胺在饲料中混匀，并应有在饲料中稳定性的资料和相应措施。

掺入浓度要定期监测，观察其均匀性和稳定性，掺入的浓度一般不超过5％。

2.2.6剂量组及分组
致癌试验一般设三个试验组。

美国NCI 推荐以最大耐受剂量(MTD)为高剂量。

最大耐受剂量是由90 天毒性试验来确定的，此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10％，并且不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤。

ICH(1995)提出，高剂量选择可以根据：
①毒性终点，即最大耐受剂量(MTD)；②药代动力学终点，啮齿动物血浆AUC(时量曲线下面积)为人的25 倍；③选择吸收饱和剂量；④药效学终点，不应产生生理学和内稳态紊乱；⑤最大可行剂量，受试物在饲料中最高含量为5％。

限制剂量为1500mg／(kg 体重·d)。

染毒组剂量的选择可参考三组数据。

一是以亚慢性阈剂量为出发点，即以亚慢性阈剂量或其1/5 ~1/2剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以这一阈剂量的
1/50~1/10为慢性毒性试验的预计阈剂量组，并以其1/100为预计的慢性无作用剂量组；一是以急性毒性的LD50剂量为出发点，即以LD50的1/10剂量为慢性试验的最高剂量。

以LD50的1/100为预计慢性阈剂量，以LD50 的1/1000为预计的无作用剂量组。

各染毒剂量组之间的剂量间距应当大些，有利于求出剂量-反应关系，也有助于排除实验动物个体敏感性差异。

组间剂量差一般以5~10倍为宜，最低不小于两倍。

对照组除不给受试物外，其他条件均与试验组相同。

同时应设阴性(溶剂或赋形剂)对照组。

每组至少有雌雄各50只动物，希望在出现第一个肿瘤时，每组还有不少于25只动物。

试验动物数与试验组动物肿瘤发生率、对照动物肿瘤自发率及要求的统计学显著性水平有关。

表9-4 是当试验结果有显著性(P<0.05)时肿瘤发生率和所需每
组最低动物数之间的关系，可供试验设计及结果评定时参考。

从此表可见，各组动物数为100 只时(雌雄各50 只)，当肿瘤自发率为1％，则试验组肿瘤发生率超过自发率15％在统计学上才有显著性。

肿瘤自发率越高，则要求试验组肿瘤发生率超过自发肿瘤率越高。

由此可见，选择肿瘤自发率低的实验动物品系是很重要的。

为制定外来化合物卫生标准而进行慢性毒性试验时，一般设3个染毒剂量组和1个对照组，必要时另设一个溶剂对照组，即无作用剂量组、阈剂量组、发生比较轻微毒性效应的剂量组(此为最高剂量组)。

以求出明确的剂量－反应关系。

2.2.7 试验期限
(1) 一般情况下，大鼠为24 个月。

(2) 当最低剂量组或对照组存活的动物只有25％时，也可以结束试验，对于有明显性别差异的试验，则试验结束的时间对不同的性别应有所不同，在某种情况下因明显的毒性作用，只造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验。

如因管理不善所造成的动物死亡大于10%及在试验期为24个月时，各组存活率均小于50%也应终止进行。

一个合格的阴性对照试验应符合下列标准：①因自溶、同类自食，或因管理问题所造成的动物损失在任何一组都不能高于10％。

②大鼠在24 个月时各组存活的动物不能少于50％。

2.3试验结果观察
2.3.1 一般观察
每天观察受试动物一次，主要观察其外表、活动、摄食情况等。

在实验最初三个月每周称体重一次，以后每两周称体重一次。

经饲料或饮水给以受试物时，应记录食物消耗量或饮水量，以计算受试物的摄人量。

观察时要注意有无肿瘤出现、肿瘤出现时间及死亡时间。

每天还应有数次有目的的观察，如剖检死亡动物或存入冰箱，将有病或垂死的动物分开或处死。

老年动物多病易死，应加强巡视，防止动物死亡后未及时剖验，发生尸体组织自溶。

详细记录动物的症状包括神经系统和眼睛的改变，可疑肿瘤在内的所有毒性作用出现和变化的时间，以及死亡情况。

在试验的前13周内，每周称量体重一次，以后每4周称量一次。

在试验的前13周内，每周检查一次动物的食物摄取情况，以后如动物健康状况或体重无异常改变，则每3个月检查一次。

2.3.2 病理检查
①大体检查：所有动物自然死亡或处死后必须及时进行病理检查，包括肉眼和组织切片检查。

组织切片检查应包括已出现肿瘤或可疑肿瘤的器官和肉眼检查有明显病变的器官，观察到的可疑病变和肿瘤部位均应留样，进一步做组织学检查。

还要测定重要脏的绝对重量和脏体比值，至少包括肝、肾、肾上腺、脾、睾丸、子宫、脑、心等脏器，通过病理检查确定肿瘤的性质和靶器官。

②组织病理检查
所有肉眼可见的肿瘤和其他病变都应进行病理检查。

此外还要注意下列方面：
（1）对所有保存的器官和组织进行镜下检查，详细描述发现的所有病变。

①包括实验过程中死亡或处死的动物。

②所有最高剂量组和对照组动物。

(2) 在较低剂量组，由受试物引起或可能由受试物引起异常的器官或组织也应进行检查。

2.3.3 血液学检查
血液学检查（血红蛋白含量，血球压积，红血球计数，白血球计数，血小板，或其他血凝试验）应在3个月，6个月，以后每隔6个月及实验结束时进行，各组每个性别要检查20只大鼠。

每次采集的血标本应来自相同的大鼠。

最高剂量组和对照组大鼠应在同样的时间间隔内进行白血球分类计数，中等剂量组大鼠只是在必要时才做。

在试验期间，如果大体观察表明动物健康恶化，应对有关动物进行血球分类计数检查。

高剂量和对照组动物要进行血球分类计数。

如两组间有很大差异时，应对较低剂量组的动物进行血球分类计数。

2.3.4 尿分析
收集各组每性别10只大鼠尿样进行分析，最好是在做血液检查的同时并取自同一大鼠。

应测下列指标，可单个进行，也可每组相同性别的尿标本混在一起测定。

分析指标：外观；每个动物的尿量和比重；蛋白，糖，酮体，潜血（半定量）；沉淀物镜检（半定量）。

2.3.5 临床化学
每6个月及实验结束时，收集各组每性别的10只大鼠的血液标本进行临床化
学检查，尽可能在各个时间间隔内采取相同的大鼠血标本。

分离血浆，进行下列指标测定：
总蛋白浓度；白蛋白浓度；肝功能试验（如硷性磷酸酶，谷丙转氨酶，谷草转氨酶， 谷氨酰转肽酶，鸟氨酸脱羧酶）；糖代谢，如糖耐量；肾功能，如血尿素氮。

2.3.6 病理检查
肉眼和病理检查常常是慢性/致癌性结合试验的基础。

2.3.7 肉眼剖检
所有的动物包括那些在实验过程中死亡或因处于垂死状态而被处死的，应进行肉眼检查。

在所有动物被处死前，应收集血样品进行血球分类计数。

保存所有肉眼可见的肿瘤或可疑为肿瘤的。

所有的器官或组织都应保留以进行镜下检查。

一般包括下列器官和组织：脑（髓/脑桥，小脑皮质，大脑皮质），垂体，甲状腺（包括甲状旁腺），胸腺，肺（包括气管），心脏，唾液腺，肝，脾，肾，肾上腺，食管，胃，十二指肠，空肠，回肠，盲肠，结肠，直肠，膀胱，淋巴结，胰腺，性腺，生殖附属器官，乳腺，皮肤，肌肉，外周神经，脊髓（颈，胸，腰），胸骨或股骨（包括关节）和眼。

肺和膀胱用固定剂填充能更好地保存组织。

2.4 数据处理和结果评价
2.4.1 肿瘤发生率
肿瘤的发生率是整个实验终了时患瘤动物总数在有效动物总数中所占的百分率。

有效动物总数指最早出现肿瘤时的存活动物总数。

实验终了时患瘤动物总数
肿瘤发生率= ————————————×100
有效动物总数
2.4.2 诱癌试验阳性的判断标准
采用结合国世界卫生组织提出的四条判断诱癌试验阳性的标准：
（1）肿瘤只发生在试验组动物中，对照组无肿瘤；
（2）试验组与对照组动物均发生肿瘤，但试验组中发生率高；
（3）试验组动物中多发性肿瘤明显，对照组中无多发性或只少数动物有多发性
肿瘤；
（4）试验组与对照组动物肿瘤的发生率无显著性差异，但试验组中肿瘤发生的时间较早。

上述四条中，试验组与对照组之间的数据经统计学处理后任何一条有显著性差异即可认为检品的诱癌试验阳性。

2.4.3 诱癌试验阴性结果的确立
假如动物实验的规模为两种种属、两种性别，至少3个剂量水平，其中一个接近最大耐受剂量，每组动物数至少50只，实验组肿瘤发生率与对照组无差异，才算阴性结果。

3、总结
通过以上试验急性实验和慢性实验，我们可以计算出杂环胺杂环胺8-MeIQx 的毒性。

慢性毒性试验所得的最大无作用剂量等于或小于人群的可能摄入量的五十倍者，表示毒性较强，应给予放弃；在50~100倍之间者，需相关专家共同评议是否用于食品；大于或等于100倍者，则考虑允许使用于食品，并制定卫生标准。

参考文献
［1］严卫星，丁晓雯主编.食品毒理学.北京：中国农业大学出版社.2008
［2］中华人民共和国卫生部. 食品安全性毒理学评价程序和方法［S］. 北京:卫生
部,2003,45～58.
［3］陈炳卿主编.食品污染与健康.北京：化学工业出版社. 2002。