人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911421173.X
(22)申请日 2019.12.31
(71)申请人 上海林望生物科技有限公司
地址 201400 上海市奉贤区金齐路868号
4976室
(72)发明人 燕小宁　张娜　王钊林　郝子娟　
李志强　
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人 陆惠中　田欢
(51)Int.Cl.
C12N 5/077(2010.01)
C12Q 1/02(2006.01)
(54)发明名称
人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法
(57)摘要
本发明属于细胞分化领域，尤其涉及一种人
多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法。

所述方
法包括以下步骤：1)将人多能干细胞置于培养容
器中，使用脂肪分化培养基诱导所述人多能干细
胞使其分化为脂肪细胞；所述脂肪分化培养基中
添加有吲哚美辛、胰岛素和L -抗坏血酸；2)以增
值性的方式培养步骤1)中得到的脂肪细胞。

该方
法简单，得到的脂肪细胞可用于科研、临床或者
工业用途。

权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 111172101 A 2020.05.19
C N 111172101
A
1.一种人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将人多能干细胞置于培养容器中，使用脂肪分化培养基诱导所述人多能干细胞使其分化为脂肪细胞；所述脂肪分化培养基中添加有吲哚美辛、胰岛素和L -抗坏血酸；
2)以增值性的方式培养步骤1)中得到的脂肪细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪分化培养基中添加有0.1-0.15mmol/L的吲哚美辛。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪分化培养基中添加有3-4mg/L的胰岛素。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中诱导时间为12-16天。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述人多能干细胞置于Matrigel胶铺设的载体上培养。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)包括：
21)消化步骤1)得到的脂肪细胞，使用维持培养基来培养脂肪细胞，得到第一代脂肪细胞；所述维持培养基为添加有血清、苯环丙胺和bFGF的基础培养基；
22)将步骤21)得到的第一代脂肪细胞使用所述维持培养基进行培养后再次传代，得到第二代脂肪细胞；
23)待第二代脂肪细胞长满后，使用基础培养基进行培养及传代。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤21)中，所述苯环丙胺的浓度为2-3μM。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤21)中，所述bFGF的浓度为2-4ng/mL。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法得到的脂肪细胞。

10.根据权利要求9所述的脂肪细胞在药物筛选中的应用。

权　利　要　求　书1/1页CN 111172101 A
人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法
技术领域
[0001]本发明属于细胞分化领域，尤其涉及一种人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法。

背景技术
[0002]干细胞是能够在各组织中获取的分化之前步骤的未分化细胞的统称。

干细胞具有在未分化状态下，规定期间内能够持续地制造出与自身相同的细胞的性质，以及在适当的条件下，能够分化为组成生物组织的多种细胞的性质。

[0003]根据分化能力和生成时期，干细胞大致可以分为胚胎干细胞(embryonic stem cell)和成体干细胞(adult stem cell)。

并且，根据干细胞的分化能力，还可以分为多能性(pluripotency)、多潜能性(multipotency)及单能性(unipotency)干细胞。

[0004]脂肪细胞分为白色脂肪细胞和褐色脂肪细胞，在正常情况下，脂肪细胞数目到了青春期后就不再增加。

目前，将人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞鲜有报道。

发明内容
[0005]本发明的发明人努力寻找高效率地诱导从间充质干细胞制备出脂肪细胞的方法，发现使用特定的脂肪分化培养基可以完成该目的，从而完成了本发明。

[0006]因此，本发明的目的之一在于，首次公开了将人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法，得到的脂肪细胞可应用于科研研究或者工业用途。

[0007]具体的，本发明的技术方案如下：
[0008]本发明第一个方面公开了一种人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
[0009]1)将人多能干细胞置于培养容器中，使用脂肪分化培养基诱导所述人多能干细胞使其分化为脂肪细胞；所述脂肪分化培养基中添加有吲哚美辛、胰岛素和L-抗坏血酸；[0010]2)以增值性的方式培养步骤1)中得到的脂肪细胞。

[0011]优选的，所述脂肪分化培养基中添加有0.1-0.15mmol/L的吲哚美辛。

[0012]优选的，所述脂肪分化培养基中添加有3-4mg/L的胰岛素。

[0013]优选的，步骤1)中诱导时间为12-16天。

[0014]优选的，步骤1)中，所述人多能干细胞置于Matrigel胶铺设的载体上培养。

[0015]优选的，所述步骤2)包括：
[0016]21)消化步骤1)得到的脂肪细胞，使用维持培养基来培养脂肪细胞，得到第一代脂肪细胞；所述维持培养基为添加有血清、苯环丙胺和bFGF的基础培养基；
[0017]22)将步骤21)得到的第一代脂肪细胞使用所述维持培养基进行培养后再次传代，得到第二代脂肪细胞；
[0018]23)待第二代脂肪细胞长满后，使用基础培养基进行培养及传代。

[0019]更优选的，步骤21)中，所述苯环丙胺的浓度为2-3μM。

[0020]更优选的，步骤21)中，所述bFGF的浓度为2-4ng/mL。

[0021]本发明第二个方面公开了上述的方法得到的脂肪细胞。

[0022]本发明第三个方面公开了上述的脂肪细胞在药物筛选中的应用。

优选的，所述药物为治疗肥胖症的药物或者治疗糖尿病的药物。

[0023]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

[0024]本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
[0025]本发明提供了一种将人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法，该方法简单，得到的脂肪细胞可用于科研、临床或者工业用途。

附图说明
[0026]图1为本发明实施例中制备得到的脂肪细胞的油红O染色的示意图。

具体实施方式
[0027]下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

[0028]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

[0029]实施例1
[0030]本实施例公开了一种将人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法，本实施例中使用的人多能干细胞为A-iPSc，其购买于深圳三启生物有限公司，并使用AiPSc的30代-40代细胞进行诱导；A-iPSc是利用人羊水细胞，使用逆转录病毒进行转染，转入OCT-4，SOX-2，KLF-4，c-MYC这四个干性基因所得，称为A-iPSc。

[0031]该人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法包括以下步骤：1)将人多能干细胞置于培养容器中，使用脂肪分化培养基诱导所述人多能干细胞使其分化为脂肪细胞；所述脂肪分化培养基中添加有吲哚美辛、胰岛素和L-抗坏血酸；2)以增值性的方式培养步骤1)中得到的脂肪细胞。

[0032]具体的技术方案如下：
[0033]步骤1)：将人多能干细胞置于铺有Matrigel胶的T75细胞培养瓶中，使用脂肪分化培养基诱导所述人多能干细胞使其分化为脂肪细胞；所述脂肪分化培养基中添加有吲哚美辛、胰岛素和L-抗坏血酸的；
[0034]具体的，所述脂肪分化培养基成分为：10％胎牛血清、DMEM/F12培养基、0.12mmol/ L的吲哚美辛和3.5mg/L的胰岛素。

[0035]步骤1)中诱导时间为12-16天。

每隔3天换一次新鲜的培养基，直至梭形细胞变圆，48小时后可见少数细胞质内有折射性较强的脂粒出现，而随着培养时间延长，小脂粒聚集逐渐变大，并形成脂肪滴，脂肪细胞的数量逐渐增多，油红O染剂处理的人多能干细胞中有大小不等的圆形红色脂肪滴。

[0036]将细胞消化下来做细胞鉴定，证实所得细胞为脂肪细胞，将其进行油红O染色，在显微镜下清晰可见胞浆脂肪滴被染成红色，染色结果如图1所示。

[0037]所述步骤2)包括：
[0038]21)消化步骤1)得到的脂肪细胞，使用维持培养基来培养脂肪细胞，得到第一代脂肪细胞；所述维持培养基为添加有10％胎牛血清、苯环丙胺和bFGF的基础培养基；[0039]22)将步骤21)得到的第一代脂肪细胞使用所述维持培养基进行培养后再次传代，得到第二代脂肪细胞；
[0040]23)待第二代脂肪细胞长满后，使用基础培养基进行培养及传代。

[0041]步骤21)中，所述苯环丙胺的浓度为2.5μM。

所述bFGF的浓度为3ng/mL。

步骤2)中所述基础培养基为DMEM/F12基础培养基。

[0042]实施例2
[0043]本实施例公开了一种细胞治疗用组合物，该组合物包括实施例1方法制备得到的脂肪细胞。

[0044]实施例3
[0045]本实施例公开了一种将人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法，与实施例1公开的方法唯一区别在于：所述脂肪分化培养基成分为：10％胎牛血清、DMEM/F12培养基、0.1mmol/L的吲哚美辛和3mg/L的胰岛素。

[0046]实施例4
[0047]本实施例公开了一种将人多能干细胞诱导分化为脂肪细胞的方法，与实施例1公开的方法唯一区别在于：所述脂肪分化培养基成分为：10％胎牛血清、DMEM/F12培养基、0.15mmol/L的吲哚美辛和4mg/L的胰岛素。

[0048]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

图1。