发酵工业无菌技术
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柠檬酸发酵
c. 染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH
下降，黄曲霉自溶。 d. 青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
❖ 发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐
杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
❖ 消毒与灭菌的区别 ❖ 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
1.染菌的不良后果
❖ 消耗营养 ❖ 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离
困难 ❖ 改变pH ❖ 分解产物 ❖ 噬菌体破坏极大
2. 染菌危害的具体分析
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 ❖ 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，
都应全部废弃。
（2）染菌种类对发酵的影响
❖ 青霉素：怕染细短产气杆菌 ❖ 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 ❖ 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 ❖ 柠檬酸：怕染青霉菌 ❖ 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 ❖ 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
❖ 种子扩大时期染菌：灭菌后弃去 ❖ 发酵前期染菌：应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，
❖ 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
❖ 肉汤培养检查法 ❖ 发酵过程的异常现象判断
DO2水平异常变化 pH异常变化 尾气CO2异常变化
1 2
污染原因分析
❖ 主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤ 操作失误 ⑥ 技术管理不善
重新接种 ❖ 发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理，处理方法
应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 ▪ 抗生素发酵 ▪ 柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细 菌。 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通 风加大，加速产酸。
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
❖ D值越大，细菌的死亡速率越慢，即该菌的耐热性 越强。
❖ 因此D值大小和细菌耐热性的强度成正比。 ❖ 注意：D值不受原始菌数影响 ❖ D值随热处理温度、菌种、细菌活芽孢所处的环境
和其它因素而异。
部分食品中常见腐败菌的 D 值
腐败菌
腐败特征
低 嗜 嗜热脂肪芽孢杆菌
平盖酸败
酸 热 嗜热解糖梭状芽孢杆菌
预防
❖ 种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
❖ 过滤空气带菌的防治 ❖ 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
“死角”
❖ 发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴 拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑 件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀
较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 ❖ 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染
菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生 长和合成代谢产物。
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 ❖ PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，
发酵一无所获。
❖ 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染 菌。
C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
有关细菌耐热性的特性
每毫升芽孢数
10000
（1）热力致死速率曲线或活菌
残存数曲线
1000
100
D
10 0
1D 2 D 3D 4D 5D
加热时间（分）
图1 热力致死速率曲线
微生物及其芽孢的热处理死 亡数是按指数递减或按对数 循环下降的。
若以纵坐标为物料单位值内 细胞数或芽孢数的对数值， 以横坐标为热处理时间，可 得到一 直 线 ——热 力致死 速 率曲线或活菌残存数曲线。
❖ 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
预防
❖ 培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
产酸产气
性 菌 致黑梭状芽孢杆菌
致黑硫臭
食 嗜 肉毒杆菌 A、B 品 温 生芽孢梭状芽孢杆菌(P.A3697)
❖ 丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自 溶，发酵液粘度增加，过滤困难。 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀。
❖ 杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采 用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化。
1. 染菌的检查与判断
❖ 显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
（2）D值
❖ 图1表明，直线横过一个对数循环时所需要的时间（分钟） 就是D值（Decimal reduction time）。也就是直线斜率 的倒数。直线斜率实际反映了细菌的死亡速率。
❖ D值的ຫໍສະໝຸດ Baidu义就是在一定的处理环境中和在一定的热力致 死温度条件下某细菌数群中每杀死90%原有残存活菌数 时所需要的时间。
❖ 操作不当造成染菌 ❖ 噬菌体染菌及其防治
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
❖ 物料、培养基、中间补料要灭菌； ❖ 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； ❖ 好气发酵通入的空气要除菌； ❖ 种子无污染；接种无菌操作过关； ❖ 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
发酵工业无菌技术
一、概念：灭菌、消毒、除菌、防腐
❖ 灭菌（sterilization）：用化学或物理方法杀死物料或设备 中所有有生命物质的过程。 消毒（disinfection）：用物理或化学方法杀死空气、地表 以及容器和器具表面的微生物。 除菌（degermation）: 用过滤方法除去空气或液体中的微 生物及其孢子。 防腐（antisepsis）: 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的 生长和繁殖 。
c. 染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH
下降，黄曲霉自溶。 d. 青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
❖ 发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐
杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
❖ 消毒与灭菌的区别 ❖ 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
1.染菌的不良后果
❖ 消耗营养 ❖ 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离
困难 ❖ 改变pH ❖ 分解产物 ❖ 噬菌体破坏极大
2. 染菌危害的具体分析
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 ❖ 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，
都应全部废弃。
（2）染菌种类对发酵的影响
❖ 青霉素：怕染细短产气杆菌 ❖ 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 ❖ 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 ❖ 柠檬酸：怕染青霉菌 ❖ 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 ❖ 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
❖ 种子扩大时期染菌：灭菌后弃去 ❖ 发酵前期染菌：应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，
❖ 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
❖ 肉汤培养检查法 ❖ 发酵过程的异常现象判断
DO2水平异常变化 pH异常变化 尾气CO2异常变化
1 2
污染原因分析
❖ 主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤ 操作失误 ⑥ 技术管理不善
重新接种 ❖ 发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理，处理方法
应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 ▪ 抗生素发酵 ▪ 柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细 菌。 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通 风加大，加速产酸。
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
❖ D值越大，细菌的死亡速率越慢，即该菌的耐热性 越强。
❖ 因此D值大小和细菌耐热性的强度成正比。 ❖ 注意：D值不受原始菌数影响 ❖ D值随热处理温度、菌种、细菌活芽孢所处的环境
和其它因素而异。
部分食品中常见腐败菌的 D 值
腐败菌
腐败特征
低 嗜 嗜热脂肪芽孢杆菌
平盖酸败
酸 热 嗜热解糖梭状芽孢杆菌
预防
❖ 种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
❖ 过滤空气带菌的防治 ❖ 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
“死角”
❖ 发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴 拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑 件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀
较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 ❖ 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染
菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生 长和合成代谢产物。
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 ❖ PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，
发酵一无所获。
❖ 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染 菌。
C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
有关细菌耐热性的特性
每毫升芽孢数
10000
（1）热力致死速率曲线或活菌
残存数曲线
1000
100
D
10 0
1D 2 D 3D 4D 5D
加热时间（分）
图1 热力致死速率曲线
微生物及其芽孢的热处理死 亡数是按指数递减或按对数 循环下降的。
若以纵坐标为物料单位值内 细胞数或芽孢数的对数值， 以横坐标为热处理时间，可 得到一 直 线 ——热 力致死 速 率曲线或活菌残存数曲线。
❖ 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
预防
❖ 培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
产酸产气
性 菌 致黑梭状芽孢杆菌
致黑硫臭
食 嗜 肉毒杆菌 A、B 品 温 生芽孢梭状芽孢杆菌(P.A3697)
❖ 丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自 溶，发酵液粘度增加，过滤困难。 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀。
❖ 杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采 用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化。
1. 染菌的检查与判断
❖ 显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
（2）D值
❖ 图1表明，直线横过一个对数循环时所需要的时间（分钟） 就是D值（Decimal reduction time）。也就是直线斜率 的倒数。直线斜率实际反映了细菌的死亡速率。
❖ D值的ຫໍສະໝຸດ Baidu义就是在一定的处理环境中和在一定的热力致 死温度条件下某细菌数群中每杀死90%原有残存活菌数 时所需要的时间。
❖ 操作不当造成染菌 ❖ 噬菌体染菌及其防治
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
❖ 物料、培养基、中间补料要灭菌； ❖ 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； ❖ 好气发酵通入的空气要除菌； ❖ 种子无污染；接种无菌操作过关； ❖ 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
发酵工业无菌技术
一、概念：灭菌、消毒、除菌、防腐
❖ 灭菌（sterilization）：用化学或物理方法杀死物料或设备 中所有有生命物质的过程。 消毒（disinfection）：用物理或化学方法杀死空气、地表 以及容器和器具表面的微生物。 除菌（degermation）: 用过滤方法除去空气或液体中的微 生物及其孢子。 防腐（antisepsis）: 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的 生长和繁殖 。