发酵工业无菌技术
第六章灭菌
8、空气排除情况：蒸汽灭菌过程中, 温度的 控制是通过控制罐内的蒸汽压力来实现。压 力表所显示的压力应与罐内蒸汽压力相对应, 即压力表的压力所对应的温度应是罐内的实 际温度。但是如果罐内空气排除不完全, 压 力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽压力, 还包括了空气分压, 因此, 此时罐内的实际温 度就低于压力表显示压力所对应的温度, 以 致造成灭菌温度不够而灭菌不彻底。
工业上, 培养基、发酵设备一般都采用 蒸汽灭菌, 而对空气则采用过滤的方法除菌， 实验室采用硫、甲醛熏蒸等方法灭菌。
第二节 灭菌的基本原理
一、灭菌的概念：一用、物：理或化学方法杀灭或
除掉物料或设备中所有的有生命的有机体 的技术或工艺过程。 二、几种常用灭菌方法的基本原理 1、化学灭菌：
化学物质与细胞中成分发生化学反应， 如蛋白变性，酶失活，破坏细胞膜透性等。 如75％乙醇使蛋白变性，HgCl溶液。
分被破坏的温度和时间。
二、培养基灭菌的类型
１、分批灭菌及其特点 １）概念：将配制好的培养基输入发酵罐内，直
接用蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后，维 持一定时间，再冷却至发酵要求的温度。
２）优点：不需要其他设备，操作简单是生产 上常用的灭菌方法。
３）缺点：加热和冷却时间长，营养成分有一 定的损失；设备利用率低。
细菌过滤器（孔径0.25-0.45um)
4、干热灭菌：
细胞内各种与温 度有关的氧化反 应迅速增加,使微 生物的致死率增 高，工业上用 1600C保持1～2小 时，达到灭菌目 的。玻璃仪器等。
5、湿热灭菌
直接用蒸汽灭菌，蒸汽使蛋白质发 生不可逆的凝固变性，使微生物在短时 间内死亡。广泛用于工业生产上。
4、微生物数量多, 彻底灭菌比较困难。
工业微生物与发酵技术研究与应用
工业微生物与发酵技术研究与应用在现代工业中，微生物与发酵技术成为了一个重要的研究领域。
微生物是一类非常小的生物体，虽然他们的身体微小，但是在制药、食品、能源、生态系统、环境保护、化工等领域中都有着重要的应用价值。
本文将从工业微生物与发酵技术的基本概念入手，阐述其发展历程，探究其研究与应用情况，最后进行总结。
一、工业微生物与发酵技术的基本概念工业微生物与发酵技术是以微生物为代谢载体，利用合成与酶法等技术来提取或合成具有生物活性的化合物的一种应用技术。
微生物被广泛应用于药品、食品、化学、制酒、制酸、生态环境、能源等领域。
发酵工艺通常是指利用微生物在恰当的环境条件下生长和代谢，产生所需的产物的过程。
二、工业微生物与发酵技术的发展历程工业微生物在实践中应用的时间已有数百年。
在16世纪的上半叶，发酵技术已得到广泛应用。
例如，利用酵母菌制造面包、啤酒、葡萄酒等发酵食品，并利用无菌发酵制取乳酸和醋酸等化学品。
在20世纪初，工业微生物与发酵技术得到了飞速发展。
通过微生物对于植物和动物的代谢途径的深入研究，人们发现了许多细菌和真菌的对偶性生理。
人们发现了以毒素和酶为代表的微生物次级代谢物，从而得到了大量的维生素、抗生素、激素和氨基酸等物质。
同时，人们发现在微生物发酵过程中，会有新的代谢产物的出现，例如广泛使用的抗生素青霉素，就是在微生物发酵过程中发现的。
在21世纪，随着生物学、分子生物学、基因组学等技术的快速发展，工业微生物与发酵技术的研究进一步深入。
通过使用现代的基因工程手段，人们可以改造微生物中某些关键酶的结构和功能，以产生特定的化合物，例如环境污染物的生物降解剂和大量的水解酶、纤维素酶、蛋白酶和酸性果汁等。
同时，与传统方法相比，使用包括生物反应器、多级反应器、多级提取装置、膜生物反应器和固定化微生物技术等现代化的发酵工艺，提高了微生物产物的产量和纯度，从而大大提高了生产效能。
三、工业微生物与发酵技术的研究与应用情况在药物领域，工业微生物已成为制造抗生素、激素等药品的重要代谢工具，大大降低了生产成本。
发酵工程 4 发酵工业无菌技术
不 同 产 品
放线菌由于生长的最适pH为7左右，因 此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右， 因此染酵母菌为多。 青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直 接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被 青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发 酵前期、中期或后期，染有能产生青霉 素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。
不 同 产 品
4
思考题
发酵工业的无菌技术
1、发酵工业中污染杂菌的危害及其预防措施
2、灭菌、消毒、除菌与防腐 3、灭菌的常用方法及其机理 4、湿热灭菌的理论计算 5、空气灭菌的常用方法
6、简述好氧发酵无菌空气制备的工艺流程与
要求。
什么是染菌？
发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长
繁殖。
一、发酵工业的无菌处理
由于化学试剂也会与培养基中的一些成分作用，而 且加入培养基后不易去除，它不能用于培养基的灭
菌，但染菌后的培养基可用化学药剂处理。
2．辐射灭菌：
（4）发酵后期染菌
发酵后期发酵液内已积累大量的产物，
特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀
灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响
不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可 以提前放罐。
4、杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
1）发酵染菌对过滤的影响
染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，
所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导
链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不 象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成 不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生 产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑 制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
对疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层 培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品， 在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死 菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此， 发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。
发酵工业无菌操作规程
发酵工业无菌操作规程1. 引言无菌操作在发酵工业中具有重要的意义，可以有效地避免微生物污染对发酵过程产生的不利影响。
本文档旨在为发酵工业从业人员提供一套标准的无菌操作规程，以确保生产过程的卫生和产品的质量。
2. 无菌操作的基本原则无菌操作的基本原则是防止微生物污染进入发酵系统，并保持操作环境的无菌状态。
以下是无菌操作的基本原则：•清洁：保持操作区域的清洁和整洁，包括操作台面、工具和设备等。
•消毒：对操作区域和操作工具进行定期消毒，以杀灭潜在的微生物污染源。
•空气过滤：通过高效过滤器对进入操作区域的空气进行过滤，以去除悬浮的微生物和微粒。
•无菌装备：使用经过高温高压灭菌或化学灭菌的无菌装备，避免装备本身成为微生物污染源。
•无菌技术：采用无菌技术，如消毒喷雾、火焰灼烧等，对操作区域和操作工具进行无菌处理。
3. 无菌操作步骤无菌操作主要包括以下步骤：3.1 准备工作•按照标准操作程序穿戴好个人防护装备，包括洗手消毒、佩戴帽子、口罩、手套和无菌工作服等。
•将所需的培养基、试剂和管道连接件等准备好，并进行必要的消毒处理。
•检查并确认工作区域的清洁度和无菌状态。
3.2 操作前准备•使用经过高温高压灭菌或化学灭菌的手术器械，将所需操作工具准备好。
•检查操作区域的灯光和通风设施是否正常，确保操作环境满足无菌操作的要求。
•使用消毒剂对操作台面进行消毒处理。
3.3 执行无菌操作•将培养基倒入无菌操作台面上的培养基瓶中，注意不要接触到瓶口。
•使用消毒剂擦拭培养基瓶的外表面，并将瓶口用火焰进行灼烧处理。
•采取适当的无菌技术，如消毒喷雾或火焰灼烧，对需要操作的区域进行无菌处理。
•进行无菌操作时，注意避免与空气直接接触，以防止微生物的进入。
•操作过程中如有需要，及时更换操作工具和设备，并对新的工具和设备进行无菌处理。
•操作结束后，及时清理和消毒操作区域，确保无菌操作台面的整洁。
3.4 结束工作•将已使用的无菌操作工具和废弃物进行正确的处理，避免造成二次污染。
发酵工程第四章无菌空气的制备
一． 空气过滤除菌的原理
二． 空气过滤除菌的介质
三． 介质过滤的效率 四． 影响过滤除菌效果的因素
五． 提高过滤除菌效率的措施
李 先 磊
化学化工系
三、介质过滤效率
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
滤层所滤去的微粒数与原有微粒数之比称为过滤效率， 用表示 ，是衡量过滤设备过滤能力的指标。
dN / dL = －KN0
dN / dL — 单位滤层所除去的微粒数（个/cm）；
李 先 磊
L — 滤床厚度 （cm）；
K — 过滤常数或除菌常数 （cm－1）
化学化工系
上式整理并积分，可得：
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
ln
Ns N0
= － KL
L=
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1 K
ln
N0 Ns
化学化工系
4、重力沉降作用
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
再小的微粒也有重力；
当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就会 沉降。
对于小颗粒而言，只有在气流速度很慢时才起作用。
李 先 磊
一般它是与拦截作用相配合的，即在纤维的边界滞留区 内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留的捕获效率。
李 先 磊
化学化工系
空气的过滤除菌原理和过滤介质
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
一． 空气过滤除菌的原理
二． 空气过滤除菌的介质
三． 介质过滤的效率 四． 影响过滤除菌效果的因素
五． 提高过滤除菌效率的措施
发酵工业的无菌技术
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业
1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌
灭菌及无菌空气的制备
温度 （℃）
120 115 110 100
孢子数 （个/mL) pH6.1
10000
8
10000
25
10000
70
10000
740
灭菌时间（min）
pH5.3
pH5.0
pH4.7
7
5
3
25
12
13
65
35
30
720
180
150
pH4.5
3 13 24 150
影响灭菌效果的因素
升温
4、冷却保压：把培养基降低到接种的温度
分批灭菌过程包括：升温、保温和冷 却等三个阶段。各阶段对灭菌的贡献： 20%、75%、5%。应当避免长时间的 升温加热阶段，因为加热时间过长， 不仅破坏营养物质，而且也有可能引 起培养液中某些有害物质的生成，从 而影响培养过程的顺利进行。
0
80 120 160
分批灭菌的时间计算
若不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看成在保 温阶段被杀死，可粗略计算灭菌所需时间。
例：发酵罐内装40m3培养基，在温度121℃下进行实罐灭菌。原 污染程度为每毫升2×105感染耐热细菌芽孢， 121℃时灭菌速率常数 为-1，求灭菌失败概率为时所需要的灭菌时间。
解：N0=40 ×106 × 2×105（个） Nt（个）
连续灭菌时间的计算：
连续灭菌的时间的计算，含菌数应改为每毫升培养基的含菌数。
例：发酵罐内装40m3培养基，在温度131℃下进行连续灭菌。 原污染程度为每毫升2×105感染耐热细菌芽孢， 131℃时灭菌速 率常数为15min-1，求所需要的灭菌时间。
解：c0= 2×105（个/ml） ct=1 /40 ×106 ×103 =2.5 ×10-11 （个/ml） k=15min-1
发酵工程 第4章 无菌空气的制备
空气流速大时，惯性冲击就起主导作用。
3、拦截滞留作用
气流速度降到临界速度以下，微粒不能因惯性 碰撞而滞留于纤维上，捕集效率下降。
乙烯醇、聚四氟乙烯等为介质
一、过滤除菌的原理
常见的悬浮于空气中的微生物直径在0.5-2微米 之间，深层过滤所用的过滤介质-棉花的纤维直 径约为20微米，棉花纤维所形成网格的孔隙为 20-50微米。
微粒随气流通过滤层时，滤层纤维所形成的网 格阻碍气流前进，使气流出现无数次改变运动 速度和运动方向，绕过纤维前进，这些改变引 起微粒以对滤层纤维产生布朗扩散、惯性冲击、 拦截、重力沉降、静电吸引等作用大多带有不同 的电荷，没有带电荷的微粒在进入高压静电场时都 会被电离变成带电微粒。
但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小， 当产生的引力等于或小于气流对微粒的拖带力或 微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附 而沉降所以静电除菌对很小的微粒效率很低。
一般只能作为初步除菌。
本节小结
空气除菌即除去或杀灭空气中的微生物。
灭菌方法： 1、介质过滤除菌法 2、加热灭菌 3、静电除菌 4、辐射灭菌等
第2节 空气的过滤除菌原理和过滤介质
过滤除菌是发酵工业中广泛使用的空气除菌法。
按除菌的机制不同分为： 绝对过滤和深层介质过滤
绝对过滤：
采用很细小的纤维介质制成，介质空隙小于0.5μm， 多限于实验室使用。
第一篇 工业微生物和发酵工业原料
Why？
第四章 无菌空气的制备How？
第一节 空气中的微生物和除菌方法
第二节 空气的过滤除菌原理和过滤介质
第三节 空气过滤除菌的工艺技术
第1节 空气中的微生物和除菌方法
发酵工业生产菌株大多数为好氧菌。 工业生产上均采用空气作为氧气来源。 然而，空气中有各种各样的微生物，为保
第四章 发酵工业的无菌技术 2
第四章发酵工业的无菌技术内容提要•常用技术概念•发酵工业污染的防治策略•发酵工业的无菌技术•发酵培养基及设备管道的灭菌•空气除菌目前，绝大多数的工业发酵都采用纯种培养，即发酵全过程只有生产菌，不允许有“杂菌”污染。
为了保障纯种发酵的顺利进行，在进行生产菌接种之前，必须对整个发酵系统进行灭菌，对发酵环境进行消毒，防治杂菌和噬菌体的感染。
在实际生产中，为了防止杂菌污染，而采用的消毒和灭菌技术，统称为发酵工业的无菌技术。
一般采用“污染概率”作为评价标准。
发酵工业中允许的染菌概率为10-3，即灭菌1000批次的发酵中只允许有1次染菌。
一、常用技术概念几个容易混淆的概念说明：1、灭菌：指用物理或化学的方法杀死物料或设备中所有生命物质的过程。
2、消毒：指用物理或化学的方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。
3、除菌：指用过滤的方法去除空气或液体中的微生物及其孢子。
4、防腐：指指用物理或化学的方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。
灭菌和消毒的区别和主要用途。
二、发酵工业污染的防治策略（一）、污染的危害1、污染杂菌，造成培养基的异常消耗，生产菌的生产能力下降；2、杂菌合成的代谢产物改变发酵环境，造成产物收率降低或质量下降；3、杂菌代谢产物使发酵系统的PH变化，造成生产菌自溶；4、杂菌分解产物，使发酵失败；5、噬菌体污染，造成生产菌细胞破裂，发酵失败。
目前，国内抗生素发酵，如青霉素发酵染菌率为2%；链霉素、红霉素和四环霉素发酵染菌率为5%；谷氨酸发酵噬菌体感染率为1%-2%。
（二）、发酵生产的产品不同，染菌的种类和性质不同、染菌发生的时间、染菌的途径和程度各不同。
1、不同种类的杂菌对发酵的影响（1）、细菌发酵：发酵周期短。
主要防止噬菌体感染。
例如：谷氨酸发酵菌种：棒状杆菌营养缺陷型细菌发酵（2）、霉菌发酵：发酵周期较细菌发酵长，产物类型各不相同。
主要防止细菌感染。
例如：青霉素发酵——水解产物。
（3）、酵母菌发酵：发酵周期最长。
发酵工业无菌技术
噬菌斑
• 发酵过程的异常现象观察法：
溶解氧水平 传感器取样分析 pH 尾气中CO2
其他：发酵液粘度、泡沫、颜色
污染原因分析
• 耐热芽孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底 • 球菌、无芽孢等不耐热杂菌，可能是种子带菌、空气
除菌不彻底
• 浅绿色菌落杂菌，可能是冷却盘管渗漏 • 霉菌，一般是无菌室灭菌不彻底或无菌操作问题 • 酵母菌，主要是糖液灭菌不彻底，放置时间久
• 细菌发酵，发酵周期短，主要是防止噬菌体污染 • 霉菌发酵，发酵周期长，产物易降解。 • 酵母菌发酵，需特别防止：（1）生长较快的细 菌（2）野生酵母菌 • 疫苗发酵，通常采用基因工程菌。
杂菌污染的防治
• 显微镜检查法：
简单染色或革兰氏染色，是最常用的检查
杂菌的方法，但需要时间。
• 平板划线培养检查法：
灭菌。连续灭菌可在短时间内加热到保温的
温度，并且能很快地冷却，因此可在比间歇
灭菌更高的温度下进行灭菌，有利于减少营
养物质的损失。
• • • •
配料罐将培养基预热60-70℃。 连消塔（加热塔）使培养基迅速（20 s)升温（126-132℃）。 维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min. 冷却管：将培养基迅速冷却到40-50 ℃，输送到灭菌后的发 酵罐内
常用浓度
0.1-0.25% 2-5% 70-75% 1-5% 3-5% 1-2% （10-15mL/m3） 0.1-0.25%
常用方法
环境消毒可直接 用于粉体 器物浸泡30 min
2 醇类： 乙醇 3 酚类： 石碳酸 来苏尔 4 甲醛
5 铵盐 新洁而灭
空气消毒
皮肤、器械、环境消毒
加热熏蒸4h
发酵工业的无菌技术
污染的危害
1
污染的防治
2
二、发酵工业污染的防治策略
01
02
03
04
05
1.染菌的不良后果
A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
染菌危害的具体分析 染菌对不同菌种发酵的影响
填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高效前置过滤器
两级冷却、加热除菌流程图(南方潮湿地区) 1-粗过滤器；2-空压机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7-丝网分离器； 8-加热器；9-过滤器
冷热空气直接混合式空气除菌流程图 (中等湿含量地区) 1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4-冷却器；5-丝网分离器；6-过滤器
升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式 ㏑(N/N0) =-kt 来粗略估算灭菌所需时间。
01
灭菌时间的估算
02
2.灭菌时间的估算
例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。 解：N0=40×106×2×105=8×1012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) ㏑(Nt/N0)=-kt t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)] =20.34(min) 由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
发酵工业的无菌技术
4. 重力沉降 5. 静电吸引
① 当气流速度较大时，惯性撞击起主要作用， 除菌效率随气流速度增加而上升 ② 当气流速度较小时，布朗扩散起主要作用， 除菌效率随气流速度增加而降低 ③ 当气流速度中等时，拦截起主要作用 ④ 当气流速度过大时，已被捕集的微粒又被湍 动的气流夹带返回气流中，除菌效率下降
（c）薄板换热器连续灭菌流程
（3）固体培养基灭菌 固体培养基也和液体培养基一样，要先 蒸煮灭菌，但固体培养基呈粒状、片状或粉 状，流动性差不易翻动，吸水加热容易成团， 冷却困难。针对这些特点设计的转鼓式灭菌 机常用于酒厂、酱油厂。该设备能承受一定 压力，装料后旋紧进出口盖，就如同密封容 器。转鼓以0.5～1r/min徐徐转动，培养基得 到翻动，蒸汽沿轴心通入加热培养基，达到 一定温度后进行保温灭菌。灭菌完毕用真空 泵沿空心轴抽真空，转鼓内压力降低，培养 基冷却。
二、空气过滤除菌的介质
1. 纤维状或颗粒状介质
①棉花 ②玻璃纤维 ③活性炭 这类过滤介质对0.3μm以下的颗粒过滤效率 仅为99%，难以满足工业发酵的无菌要求，需多 次过滤。 缺点：体积大，占用空间大，操作困难，装 填介质费时费力且松紧度不易掌握，空气压力降 大，介质灭菌和吹干耗用大量的蒸汽和空气。
3. 两级冷却、分离、加热的除菌流程 空气吸气口 粗过滤器 空压机 贮罐 冷却器 旋风分离器 冷却器 丝网分离器 加热器 总过滤器
三、提高过滤效率的措施 1. 减少进口空气的含菌数量 ① 正确选择进风口 ② 提高进口空气的采风位置，即高空采风 ③ 对压缩前的空气采用粗过滤处理 2. 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌 效率高的过滤介质 3. 针对不同地区设计合理的空气处理流程 4. 降低进入过滤器的空气相对湿度，保证过 滤介质在干燥状态下工作
药品生产技术《工业发酵灭菌-工业发酵灭菌教学案例》
工业发酵灭菌教学案例
1、典型的空气除菌流程
1〕将空气冷却至露点以上的流程
适用范围：气候枯燥地区
❖露点温度是指空气在水汽含量和气压都不改变的条件下，冷却到饱和时的温度。
形象地说，就是空气中的水蒸气变为露珠时候的温度叫露点温度。
❖露点温度本是个温度值，可为什么用它来表示湿度呢？
❖这是因为，当空气中水汽已到达饱和时，气温与露点温度相同；
当水汽未到达饱和时，气温一定高于露点温度。
所以露点与气温的差值可以表示空气中的水汽距离饱和的程度。
在100%的相对
湿度时，周围环境的温度就是露点温度。
❖露点温度越小于周围环境的温度，结露的可能性就越小，也就意味着空气越枯燥。
特点：两次冷却、两次分油水、适当加热。
空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却至20215℃，经分水后加热到30～35℃，因为温度升高，相对湿度下降。
第一冷却器：旋风别离器
第二冷却器：丝网别离器
3冷热空气直接混合式空气除菌流程
发酵车间的空气过滤器
空气净化的流程
❖吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤
❖进入空气压缩机〔120~150°C〕
❖冷却〔20~25°C〕，除去油、水，再加热至30 ~35°C。
❖最后通过总过滤器和分过滤器，获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。
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（2）染菌种类对发酵的影响
❖ 青霉素：怕染细短产气杆菌 ❖ 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 ❖ 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 ❖ 柠檬酸：怕染青霉菌 ❖ 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 ❖ 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
❖ 种子扩大时期染菌：灭菌后弃去 ❖ 发酵前期染菌：应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，
发酵工业无菌技术
一、概念：灭菌、消毒、除菌、防腐
❖ 灭菌（sterilization）：用化学或物理方法杀死物料或设备 中所有有生命物质的过程。 消毒（disinfection）：用物理或化学方法杀死空气、地表 以及容器和器具表面的微生物。 除菌（degermation）: 用过滤方法除去空气或液体中的微 生物及其孢子。 防腐（antisepsis）: 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的 生长和繁殖 。
❖ 丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自 溶，发酵液粘度增加，过滤困难。 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀。
❖ 杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采 用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化。
1. 染菌的检查与判断
❖ 显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
产酸产气
性 菌 致黑梭状芽孢杆菌
致黑硫臭
食 嗜 肉毒杆菌 A、B 品 温 生芽孢梭状芽孢杆菌(P.A3697)
较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 ❖ 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染
菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生 长和合成代谢产物。
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 ❖ PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，
发酵一无所获。
❖ 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染 菌。
C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
❖ 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
预防
❖ 培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
预防
❖ 种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
❖ 过滤空气带菌的防治 ❖ 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
“死角”
❖ 发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴 拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑 件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀
❖ 操作不当造成染菌 ❖ 噬菌体染菌及其防治
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
❖ 物料、培养基、中间补料要灭菌； ❖ 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； ❖ 好气发酵通入的空气要除菌； ❖ 种子无污染；接种无菌操作过关； ❖ 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
❖ 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
❖ 肉汤培养检查法 ❖ 发酵过程的异常现象判断
DO2水平异常变化 pH异常变化 尾气CO2异常变化
1 2
污染原因分析
❖ 主要原因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤ 操作失误 ⑥ 技术管理不善
柠檬酸发酵
c. 染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH
下降，黄曲霉自溶。 d. 青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
❖ 发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐
杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
（2）D值
❖ 图1表明，直线横过一个对数循环时所需要的时间（分钟） 就是D值（Decimal reduction time）。也就是直线斜率 的倒数。直线斜率实际反映了细菌的死亡速率。
❖ D值的定义就是在一定的处理环境中和在一定的热力致 死温度条件下某细菌数群中每杀死90%原有残存活菌数 时所需要的时间。
有关细菌耐热性的特性
每毫升芽孢数
10000
（1）热力致死速率曲线或活菌
残存数曲线
1000
100ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
D
10 0
1D 2 D 3D 4D 5D
加热时间（分）
图1 热力致死速率曲线
微生物及其芽孢的热处理死 亡数是按指数递减或按对数 循环下降的。
若以纵坐标为物料单位值内 细胞数或芽孢数的对数值， 以横坐标为热处理时间，可 得到一 直 线 ——热 力致死 速 率曲线或活菌残存数曲线。
重新接种 ❖ 发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理，处理方法
应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 ▪ 抗生素发酵 ▪ 柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细 菌。 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通 风加大，加速产酸。
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
❖ D值越大，细菌的死亡速率越慢，即该菌的耐热性 越强。
❖ 因此D值大小和细菌耐热性的强度成正比。 ❖ 注意：D值不受原始菌数影响 ❖ D值随热处理温度、菌种、细菌活芽孢所处的环境
和其它因素而异。
部分食品中常见腐败菌的 D 值
腐败菌
腐败特征
低 嗜 嗜热脂肪芽孢杆菌
平盖酸败
酸 热 嗜热解糖梭状芽孢杆菌
❖ 消毒与灭菌的区别 ❖ 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
1.染菌的不良后果
❖ 消耗营养 ❖ 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离
困难 ❖ 改变pH ❖ 分解产物 ❖ 噬菌体破坏极大
2. 染菌危害的具体分析
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 ❖ 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，