第三部分 有机介质中的酶反应

超临界流体的有关性质
（3）提高溶剂选择性的基本原则是：
第一：操作温度和超临界流体的临界温度接近； 第二：超临界流体的化学选择和待分离溶质的化 学性质接近。
工业类别
超临界流体萃取的应用实例
应用实例 （1） 原料药的浓缩，精制和脱溶剂（抗生素等）（2） 酵母，菌体 生成物的萃取（r-亚麻酸，酒精等）（3） 酶，维生素等的精制， 回收（4） 从动植物中萃取有效药物成分（生物碱，维生素E，芳 相油等）（5） 脂质混合物的分离精制（甘油酯，脂肪酸，卵磷酯） （1） 植物油的萃取（大豆，棕榈，花生，咖啡）（2） 动物油的萃取 （鱼油，肝油）（3） 食品的脱脂（马铃薯片，无脂淀粉，油炸食 品）（4） 从茶，咖啡中脱除咖啡因，啤酒花的萃取（5） 香料的 萃取（6） 植物色素的萃取（7） 油脂的脱色脱臭
通过选择合适的载体可使体系中的水进 行有利分配。
C.通过载体与酶之间形成的多点结合作
用，可稳定酶的催化活性构象。
例：α-胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶共价结合后，在乙醇 中的稳定性明显提高，并且对有机溶剂的抗性随酶与载体 间共价键数量的增加而增强。
D.酶动力学影响一个酶同时催化 的两个反应的相对速度。
(2). 溶剂必须对于该主反应是惰 性的制剂。
例：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲 核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是 酯，就会生成以溶剂为基础的酯，如果 溶剂是醇，也会得到类似结果。
(3)必须考虑的其他因素
溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、 废物处理和成本等（溶剂因底物而宜） 溶剂参数lgP：即一种溶剂在辛醇/水两相 间分配系数的常用对数值，它能直接反 映溶剂的疏水性。
2． 有机溶剂影响酶催化的方 式
（1） 有机溶剂能通过直接与酶相互作 用引起抑制或失活
A 增大酶反应的活化能来降低酶反应速度 B 降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活性下降。 C 酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影响失活。
2． 有机溶剂影响酶催化的方 式
（2） 有机溶剂与扩散的底物或产物相 互作用而影响酶活 3） 有机溶剂直接与酶附近的必需水相 互作用。
医药工业
食品工业
化妆品 香料工业
（1） 天然香料的萃取，合成香料的分离，精制，（2） 烟草脱烟碱 （3） 化妆品原料的萃取，精制（界面活性剂，单甘酯等）
2． 仿水溶剂和印迹技术
（1） 仿水溶剂体系 （2） 分子印迹技术
（1） 仿水溶剂体系
原理: 可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等 极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水， 从而影响酶的活性和立体选择性。
概念临胶束浓度
临胶束浓度：是胶束形成时所需表面活性剂的最 低浓度，用CMC来表示。 CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变（如 表面张力、渗透压等）来确定。
概念
正常微团：极性头部向外，与水结合；疏水尾部 向内，形成一个非极性的核心。 反向微团：疏水尾部向外，与非极性的有机溶剂 接触；极性头部向内，形成一个极性核。
二．酶的选择
（３） 固定化酶： 把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅 藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对 抗有机介质变性的能力、反应速度、热 稳定性等都可提高。
二．酶的选择
（３） 固定化酶：
有机相中固定化后载体对酶的 影响
A.载体能通过分配效应剧烈地改变酶微环境中底 物和产物的局部浓度。
B.载体影响酶分子上的结合水
具备条件 研究进展 应用现状
保证必需水含量 合适的酶及酶形式 合适的溶剂及反应体系 最佳pH值 超临界流体中的酶反应 仿水溶剂和印迹技术
第一节结束
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第二节 有机介质中酶促反应的 条件
一．必需水 二．酶的选择 三．溶剂及反应体系的选择 四．pH选择和离子强度的影响
一．必需水
概念： 紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活 性所必需的最少量水。
超临界流体的有关性质 （1）超临界流体的P-V-T性质
流体名称 乙℃）
32.3
96.9
150.0
296.7
9.9
132.4
31.1
157.6
374.3
临界压力 （Mpa）
4.26
3.8
3.38
5.12
11.28
7.38
7.88
22.11
一．必需水
2 ．干燥的酶水合过程：
（1） 与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g （水/酶） （2） 与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g) （3） 凝聚到表面相互作用较弱的部位 （0.25~0.38g/g） （4） 酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。
3． 影响酶反应体系中需水含的 因素
极性添加剂对体系的影响
a. 对反应体系内水的分配影响 b. 与蛋白质的直接作用 c. 对产物分配的影响
应用举例：
通过适当地添加少量的DMF（二甲基酰 胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化 反应产物的得率从51%提高到91%，且 反应活性也有所提高。
（2） 分子印迹技术
e.g. 1
当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-AcTyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，再将抑制剂除 去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑 制剂的水溶液中冻干出来的酶高100倍，但这样处 理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。
反胶束体系中的含水量
C．基本原理：“水壳”模型
反胶束系统中的水通常可分为结合水和自由水。 结合水是指位于反胶束内部形成水池的那部分水； 自由水即为存在于水相中的那部分水。
“水壳”模型
水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况， 其间接证据较多。 1.从弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少 存在一个单分子的水层。 2.α-糜蛋白酶在反胶束中的荧光特性与在主体水中 的特性很相象。 3.反胶束中酶显示的动力学特性接近于在主体水中 的特性。
B.反胶束体系的制备
将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其 浓度超过临界胶束浓度（CMC），便会在有机溶 剂内形成聚集体，这种聚集体则为反胶束。
反胶束体系的制备
影响因素
反胶束的尺寸和形状随表面活性剂-溶剂 系统的变化而变化，同时也受温度、压 力、离子强度的影响。
反胶束的大小取决于反胶束的含水量Wo。Wo的定义为反 胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即有机溶剂 中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比。
分子印迹技术原理：
竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形 成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除 去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得 到保持。 酶蛋白分子在有机相中具有对配体的“记忆”功 能。
第一节结束
优点
有利于疏水性底物的反应 可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应 能催化在水中不能进行的反应 可改变反应平衡移动方向 可控制底物专一性 可防止由水引起的副反应 可扩大反应pH值的适应性 酶易于实现固定化 酶和产物易于回收 可避免微生物污染
第三部分 有机介质中的酶 反应
第一节 有机介质中的酶促反应概述 第二节 有机介质中酶促反应的条件 第三节 有机介质对酶性质的影响 第四节 有机介质中酶促反应应用举 例
第一节 有机介质中的酶促反 应概述
一． 有机相酶反应的优点： 二． 有机相酶反应具备条件 三． 有机相酶反应的研究进展 四． 有机相酶反应的应用现状
Biochemical Engineering Journal, 2002,11(2-3):95-100. J. Microbiology and Biotechnology, 2004 , 14(1):62-67.
双相体系与水相体系中产物纯度的比较
双相体系中，由于乙酸丁酯对产物苯乙酸的萃取， 双相体系中，由于乙酸丁酯对产物苯乙酸的萃取，促进 了酶反应的平衡，使得L 型底物的转化率为99.95％，而 了酶反应的平衡，使得L-型底物的转化率为99.95％，而 99.95％， 这样得到的D-叔亮氨酸的纯度也提高到99.5％。 这样得到的D 叔亮氨酸的纯度也提高到99.5％。 99.5
D．影响的主要因素
水相pH值的影响 离子强度的影响主要是由离子对表面电 荷的屏蔽作用所决定 表面活性剂浓度的影响 离子种类对萃取的影响
构建双水相体系实现在线产物分离
Top phase Product
Substrates
Biocatalyst
Product
Side product Bottom phase
二． 有机相酶反应具备条件
1． 保证必需水含量。 2． 选择合适的酶及酶形式。 3． 选择合适的溶剂及反应体系。 4． 选择最佳pH值。
三． 有机相酶反应的研究进展
1． 超临界流体中的酶反应 2． 仿水溶剂和印迹技术
1． 超临界流体中的酶反应
超临界流体的概念: 指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流 体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力；然而其 扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍。
a．不同酶需水量不同 b. 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同
溶剂疏水性越强，需水量越少
胰脂肪酶活性与含水量的关系
4．表征必需水作用的参数---热力 学水活度
即在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压 与相同条件下纯水的蒸气压之比。该参数直接反 应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用 溶剂无关。
一． 有机相酶反应的优点：
1． 有利于疏水性底物的反应。 2． 可提高酶的热稳定性. 3． 能催化在水中不能进行的反应 4． 可改变反应平衡移动方向 5． 可控制底物专一性
一． 有机相酶反应的优点：
6． 可防止由水引起的副反应。 7． 可扩大反应pH值的适应性。 8． 酶易于实现固定化。 9． 酶和产物易于回收。 10． 可避免微生物污染。
3．选择有机溶剂必须考虑因 素
(1). 有机溶剂与反应的匹配性（即相容性）（包括 反应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留 在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应 发生。)
相容性
例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水 不互溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不 溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂 （如吡啶或二甲基甲酰胺）
二 酶的选择
1 酶种类的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化 酶、过氧化氢酶，过氧化物酶等。 除与酶有关，还与酶-底物、产物-溶剂间关系有关。
2．酶形式的选择
（1）酶粉： 例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精 中转酯反应，发现催化活性随反应体系 中酶量的减少而显著增加。
二．酶的选择
（２） 化学修饰酶： 例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性， 它对温度、PH、蛋白酶水解的稳定性均 高于天然SOD。
例 在低水活度下把胰凝乳蛋白酶固定在聚 酰胺载体上，水解反应被抑制却有利于醇解 反应。
三． 溶剂及反应体系的选择
水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、 甘油、丙酮、乙晴等 水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、 四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等
1． 酶促反应有机介质体系
（1） 单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂） （２） 两相体系（水/水不溶性有机溶剂） （３） 低水有机溶剂体系（有机溶剂体系） （４） 反胶束体系☆
A.反胶束体系概念 反胶束体系：
是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米 尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的热力学稳 定的系统。
概念表面活性剂
表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基 团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分 子。 在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性 剂： AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺 酸钠。
四反应平衡方向合成产物有机溶剂使用浓度合成收率枯草杆菌蛋白核糖核酸酶甘油9050无色杆菌蛋白人胰岛素dmf和乙醇3080羧肽酶牛胰核糖核酸甘油9050凝血酶人生长激素甘油8020嗜热杆菌蛋白天冬甜味素乙酸乙酯胰凝乳蛋白酶脑啡肽乙醇或dmf第三节结束稳定性活性专一性反应平衡方向热稳定性提高储存稳定性提高第三节结束点击返回第四节有机介质中酶催化的应催化反应应用蛋白酶肽合成合成多肽糖类酰基化羟基化酶氧化甾体转化过氧化物酶聚合酚类胺类化合物的聚胆固醇氧化酶氧化胆固醇测定醇脱氢酶酯化有机硅醇的酯化有机介质中酶催化的应用催化反应应用脂肪酶肽合成青霉素g前体肽合成酯合成醇与有机酸合成酯类转酯各类酯类生产聚合二酯的选择性聚合甘醇的酰基化有机介质中酶催化的应用手性药物的拆分手性高分子聚合物的制备酚树脂的合成导电有机聚合物的合成发光有机聚合物的合成有机介质中酶催化的应用食品添加剂的生产多肽的合成甾体转化生物能源一
4.88
临界密度 (g/cm3)
0.220
0.228
0.232
0.227
0.23 6
0.460
0.525
0.326
0.203
超临界流体的有关性质
（2）所谓超临界CO2是指纯净的CO2被加热或压
缩到高于其临界点（临界温度31.1℃，临界压力 7.28Mpa)时的状态。该流体具有无毒、无臭、不 燃等优点。
Aquous Two Phase System--ATPS System--ATPS
双水相体系将头孢立新得率提 高3倍
70 60 Cephalexin yield (%) 50 40 30 20 10 0 0 60 120 180 240 Time (min) 300 360 aqueous phase ATPS