血清抗烟曲霉二肽基肽酶V肽段IgG类抗体ELISA法的建立及初步应用

血清抗烟曲霉二肽基肽酶V肽段IgG类抗体ELISA法的建立
及初步应用
韩丹丹;李芳秋;史利宁;张国勇;李伟;胡毓安
【摘要】目的建立检测人血清中抗烟曲霉二肽基肽酶V(dipeptidyl peptidases V,DPPV)肽段IgG类抗体(抗DPPV)的ELISA法,评估其对侵袭性曲霉病(IA)的早期诊断价值.方法用重组烟曲霉DPPV肽段作为包被抗原,建立检测血清中抗DPPV
的ELISA法,检测105例IA患者、200例非IA患者及200例健康人血清中抗DPPV水平,确定cut off值,考查方法的精密度和特异性.部分IA患者抗DPPV结果与抗烟曲霉硫氧还蛋白还原酶(TR)抗体(抗TR)检测和曲霉半乳甘露聚糖(GM)检测
结果对比,评价其临床应用价值.结果以建立的ELISA法检测吸光度(A)值为6.688、0.709的2份抗DPPV抗体阳性血清,批内变异系数(CV)为4.1％和8.0％,批间CV
为7.1％和10.7％.重组抗原对血清中相应抗体的阻断率＞90％.以A值0.542为
cut off值,对IA诊断的敏感性为66.7％,特异性为90.7％.非中性粒细胞缺乏的IA
患者抗DPPV阳性率(75.3％,55/73)高于中性粒细胞缺乏的IA患者
(46.9％,15/32),差异有统计学意义(x2=8.11,P＜0.05);92例IA患者血清抗DPPV、抗TR和GM测定总阳性率分别为63.0％、60.9％和73.9％,差异无统计学意义(P ＞0.05);中性粒细胞缺乏的IA患者GM阳性率(89.7％)显著高于抗DPPV、抗TR
的阳性率(41.4％和34.5％)X2分别为14.96、18.75,P均＜0.01.抗DPPV与抗TR 联合检测阳性率达到82.6％,抗DPPV、抗TR和GM试验三者联合检测的阳性率
可提高到96.7％.结论检测抗DPPV抗体的ELISA法精密度和特异性较好,对侵袭
性曲霉感染具有潜在的辅助诊断价值,联合多个指标检测可提高诊断的敏感性.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2014(032)004
【总页数】4页(P241-244)
【关键词】侵袭性曲霉病;烟曲霉;二肽基肽酶;抗体;间接酶联免疫吸附试验
【作者】韩丹丹;李芳秋;史利宁;张国勇;李伟;胡毓安
【作者单位】南京军区南京总医院临床中心实验科,南京210002;南京军区南京总医院临床中心实验科,南京210002;南京军区南京总医院临床中心实验科,南京210002;南京军区南京总医院临床中心实验科,南京210002;南京军区南京总医院临床中心实验科,南京210002;南京军区南京总医院临床中心实验科,南京210002【正文语种】中文
【中图分类】R446.5
近年来侵袭性曲霉菌病(invasive aspergillosis，IA)的发病率和死亡率逐年上升，其中侵袭性肺曲霉病若治疗不当，病死率几乎达100%[1]。

早期诊断、及时启动抗真菌治疗可大大提高IA患者的生存率。

IA的临床表现多不典型，建立有效的实验室诊断方法至关重要。

二肽基肽酶Ⅴ(dipeptidyl peptidases Ⅴ，DPPⅤ)属于丝氨酸蛋白酶类S9家族，是一种分泌蛋白，侵袭性曲霉感染时释放入血，刺激机体产生抗体，是曲霉优势抗原之一。

生物信息学分析显示，曲霉DPPⅤ与人源蛋白质无同源性，与其他真菌蛋白质的同源性也较低。

DPPⅤ免疫反应性强，是一个理想的曲霉标志性抗原[2]。

在前期研究中，我们已成功克隆表达抗原性较强的烟曲霉DPPⅤ重组肽段(DPPⅤ19-447p)[3]。

本研究拟以该肽段为包被抗原，建立抗DPPⅤ抗体的间接ELISA法，进行临床验证，并与本实验室前期建立的抗烟曲霉硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase，TR)抗体(抗TR)检测[4]结果以及曲
霉细胞壁半乳甘露聚糖(galactomannan, GM)试验测定结果进行对比，评价不同
血清学指标联合检测的意义。

1.1 研究对象选择2008年3月至2013年3月经病理组织学检查和(或)合格胸水、痰标本培养曲霉阳性的确诊或拟诊IA患者105例。

其中非中性粒细胞缺乏患者
73例，男55例，女18例，年龄(56.9±15.2)岁；原发病包括慢性阻塞性肺病等
慢性肺病19例，重症肺炎2例，慢性肾病4例，SLE 5例，糖尿病8例，肺结核7例，肺癌4例，溺水3例、皮肌炎2例，肝硬化2例，白血病2例，肺曲霉瘤、食管癌、肾癌、 HIV感染、重症胰腺炎、脑梗死、骨折、发热及烧伤各1例，无
原发疾病6例；中性粒细胞缺乏症患者32例，男21例，女11例，年龄
(54.3±15.4)岁，包括急、慢性白血病14例，淋巴瘤9例，再生障碍性贫血和骨
髓增生异常综合征各3例，系统性淀粉样变、阵发性血红蛋白尿、系统性血管炎
各1例。

中性粒细胞缺乏症患者中性粒细胞计数<0.5×109/L。

IA诊断标准参照中华医学会重症医学分会制定的侵袭性真菌感染诊断与治疗指南[5]。

同期念珠菌血
症100例和细菌血症100例患者作为非IA患者对照组。

同期体检健康者200例
作为健康人对照组，男157例，女43例，年龄(44.2±17.4)岁。

所有研究对象均
采集静脉血分离血清，-70 ℃保存。

1.2 主要试剂及仪器烟曲霉DPPⅤ重组蛋白[9]为本室制备及纯化；辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗人IgG(南京川博公司)；底物液和反应终止液(科华公司)；微孔反应板(美国Corning公司)；Model 680型酶联仪及GM检测试剂盒Platelia Aspergillus EIA(美国Bio-Rad公司)。

1.3 ELISA法的建立用重组DPPⅤ肽段包被微孔板，HRP标记的羊抗人抗体作为
检测抗体，6例确诊IA患者混合血清和6例健康人混合血清分别作为阳性和阴性
对照，用方阵滴定法选择最佳反应条件。

具体检测流程如下：重组DPPⅤ蛋白用0.05 mol/L CBS(pH 9.6)稀释至1.0 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃包被过夜。

用含
0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS-T洗板后，用50 g/L脱脂奶粉液(PBS-T配制)37 ℃温育封闭1 h；洗板后每孔加入1∶500稀释的待测血清样本100 μL，
37 ℃温育45 min；洗板后加入HRP标记羊抗人IgG 100 μL，37 ℃温育45 min；洗板后加入酶底物液100 μL，37 ℃温育10 min；加入50 μL终止液(1 mol/L
H2SO4)终止反应。

在酶联仪上读取测定波长450 nm、参比波长630 nm时吸光度(A)值。

1.4 ROC曲线分析与cut off值的确定用SPSS 17.0统计软件绘制ROC曲线并计算ROC曲线下面积(AUCROC)。

在兼顾特异性的情况下，取约登(Youden)指数最大时对应的A值作为cut off值[6]。

1.5 血清抗TR抗体测定参照文献[4]。

1.6 血清GM测定 105例IA患者中，92例常规测定血清GM。

操作方法按GM
检测试剂盒说明书进行，检测值大于0.5判为阳性。

1.7 统计学分析用SPSS 17.0统计软件进行。

计数资料以例数和百分率表示，偏
态分布的计量资料用M(P25，P75)表示；两组间比较用Mann-Whitney U检验，组间率的比较用χ2检验。

以P<0.05为有统计学意义。

2.1 DPPⅤ包被浓度与HRP标记羊抗人IgG工作浓度分别取确诊6例IA患者血
清和6例健康人的混合血清作为阳性和阴性标本，用方阵滴定法对抗原包被浓度
和HRP标记羊抗人IgG的最适浓度进行优化，以阳性标本A/阴性阴性A比值最
大时反应条件为最佳。

最适抗原包被浓度为1.0 μg/mL，HRP标记羊抗人IgG抗体工作浓度为1∶6 000。

2.2 ELISA主要性能指标
2.2.1 精密度检测2份抗DPPⅤ抗体阳性血清(1∶500稀释，A450 nm分别为
1.688、0.709)。

平行测定20次，计算批内变异系数(CV)；每日检测2次，连续10 d，计算批间CV，以确定该方法的重复性。

2份血清批内检测A值分别为
1.48±0.06、0.81±0.07，批内CV分别为4.1%和8.6%。

批间检测A值分别为
1.67±0.12、0.92±0.10，批间CV分别为7.2%和10.9%。

2.2.2 阻断试验选择ELISA结果阳性的IA患者血清(1∶500稀释，A450
nm>1.0)，分别加入终浓度分别为8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL和0 μg/mL
的DPPⅤ重组蛋白，置37 ℃温育45 min后，检测混合液中抗DPPⅤ抗体的A 值。

结果随DPPⅤ抗原浓度增加，测得抗DPPⅤ抗体A450 nm明显下降，分别
为0.066、0.064、0.073和0.937，阻断率为92.2%～93.2%，提示检测结果具
有特异性。

2.2.3 cut off值确定依据105例确诊IA患者血清和400例对照组血清抗DPPⅤ
检测结果，绘制ROC曲线。

见图1。

以A450 nm=0.542为cut off值，此时，
抗DPPⅤ抗体诊断IA的敏感性为66.7%，特异性为90.7%。

2.3 抗DPPⅤ抗体测定结果 105例确诊IA患者抗DPPⅤ抗体的A450 nm结果[M(P25，P75)]为0.699
(0.458，0.972)，非IA对照组和健康人对照组分别为0.199(0.124，0.281)和
0.194(0.036，0.410)，见图2。

IA组血清抗DPPⅤ抗体阳性率为66.7%(70/105)，非IA患者对照组为14.5%(29/200)，健康人对照组为4.0%(8/200)，IA组与非
IA及健康人对照组均有统计学差异(χ2分别为85.47和142.06，P均<0.05)。

在
IA患者中，73例非中性粒细胞缺乏患者抗DPPⅤ A450 n m结果为0.873(0.51，1.102)，阳性率为75.3%(55/73)，32例中性粒细胞缺乏患者抗DPPⅤ A450 nm 结果为0.505(0.176，0.675)，阳性率为46.9%(15/32)，阳性率差异有统计学意
义(χ2=8.113，P<0.05)。

2.4 抗DPPⅤ、抗TR、GM测定结果比较对92例有临床GM试验结果的IA患
者血清进行抗DPPⅤ和抗TR测定结果的比较，结果显示，3项指标阳性率差异无统计学意义(P=0.135)。

其中，63例非中性粒细胞缺乏症IA患者抗DPPⅤ、抗
TR抗体阳性率高于GM阳性率，但3个指标阳性率差异亦无统计学意义。

中性粒细胞缺乏症 IA患者GM试验阳性率显著高于抗DPPⅤ、抗TR的阳性率(χ2分别
为14.96、18.75，P均<0.01)。

联合检测抗DPPⅤ和GM，阳性率提高到93%以上；联合检测3个指标，阳性率则可提高到96%以上。

见表1。

一直以来，国内外对IA的诊断均较困难。

培养法阳性率低，且需时较长。

作为金
标准的病理学检验需经创伤性操作获得样本，不适用于患有严重基础疾病的患者。

GM试验敏感性不稳定、特异性较低，对于中性粒细胞减少的IA有较高的诊断价值，而对非中性粒细胞减少的患者诊断价值不佳[7-8]。

研究证明，IA患者会产生
针对曲霉抗原的特异性抗体[9]，抗体测定对非中性粒细胞减少的亚急性IA患者是最好的无创诊断方法[10]。

Sarfati等[11]制备了8种基因重组烟曲霉蛋白，发现
IA患者体内抗各种抗原的抗体水平各异，核糖核酸酶、过氧化氢酶和DPPⅤ基因
重组烟曲霉蛋白，有作为抗原测定相应抗体诊断IA的潜力。

Nguyen等[12]研究
显示，同样是曲霉感染，患者的免疫状态、感染类型和病程不同，其循环中的曲霉抗原及其抗体水平也有差异。

本课题组前期研究中，通过对烟曲霉侵袭相分泌蛋白的蛋白质组学研究发现，DPPⅤ和TR等17种蛋白质有作为抗原测定相应抗体诊
断IA的潜力[13]。

本研究建立检测重组烟曲霉DPPⅤ肽段抗体的ELISA法，并评价其在IA诊断中的意义。

结果显示，抗DPPⅤ抗体在105例确诊或拟诊IA患者中的阳性率为
66.7%，而在400例对照者中的阳性率仅为9.3%(37/400)，表明该抗体检测对IA 有辅助诊断价值，其他病原体感染对抗体测定的干扰很小。

本研究结果表明，抗DPPⅤ抗体并非烟曲霉特异。

确诊IA患者中5例黑曲霉感染，4例抗DPPⅤ阳性；2例黄曲霉感染，抗DPPⅤ抗体均阳性，提示抗DPPⅤ抗体亦可辅助诊断其他曲
霉引起的IA。

为了评价抗DPPⅤ对曲霉感染的诊断价值，本研究比较了92例IA患者血清抗
DPPⅤ、抗TR和GM检测结果。

3种指标总阳性率分别为64.0%、60.9%和73.9%，GM阳性率高于两种抗体，但差异无统计学意义。

在中性粒细胞缺乏的IA患者，GM阳性率达到89.7%，显著高于单独测定单一抗DPPⅤ、抗TR抗体的阳性率，似乎提示GM检测对该组患者有更高的诊断价值。

但对非中性粒细胞缺乏的IA患者GM试验则缺乏优势。

当将抗DPPⅤ、抗TR和GM 3种指标联合测定时，发现抗DPPⅤ与抗TR联合检测阳性率可达到82.6%，若再联合GM 试验，阳性率提高至96.7%，显著提高了诊断的敏感性，但是特异性方面尚待进一步研究。

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