蒙古栎 SSR 分析技术规程

蒙古栎SSR分析技术规程
1范围
本文件规定了蒙古栎SRR分析技术的定义和术语、仪器设备、溶液配制、引物和分析程序。

本文件适用于辽宁地区蒙古栎的SSR分析。

2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。

其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。

不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T28660马铃薯种薯真实性和纯度鉴定SSR分子标记
LY/T2426枣品种鉴定技术规程SSR分子标记法
LY/T2756白蜡品种分子鉴定方法—SRAP分子标记法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。

3.1
简单重复序列
又称微卫星DNA，是一类由1～6个核苷酸为重复单位的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列。

3.2
聚合酶链式反应
在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特意扩增待定DNA序列的方法。

3.3
引物
一条互补结合在模板DNA链上的短的单链，提供3’-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。

3.4
引物扩增多态性
一对引物在两个或两个以上不同材料基因组DNA之间扩增，得到数目不同或长度不同的DNA片段。

4仪器设备及试剂
仪器设备及试剂见附录B。

5引物
引物相关信息见附录C。

6溶液配制
溶液配制方法见附录D。

7分析程序
7.1分析材料
采集蒙古栎新鲜幼嫩叶片为材料提取基因组DNA。

选取适量样品装入冻存管，液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱保存备用。

7.2DNA的提取
a)采用CTAB法提取蒙古栎基因组DNA。

将干净研钵、研杵、小匙、无水乙醇预先放入冰箱中-20℃预冷，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，再用滤纸吸干水分。

b)取5~10g叶片在液氮中迅速研磨成粉状，迅速转至灭过菌的1.5mL离心管中，加入500μL 预热过（60℃）的CTAB提取液、5μL0.2%β-巯基乙醇和5μL RNase A(10mg/mL)，充分混匀后放入65℃水浴30min。

其间每隔10min轻轻摇动混匀2次~3次。

c)取出离心管加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀10min，再于台式冷冻离心机上10000g离心10min。

d)将上清液转入另一新的1.5mL离心管中，重复c)步骤1~2次。

e)移取上清液至另一已加入2倍体积预冷（0℃以下）无水乙醇的1.5mL离心管中，轻轻颠倒混匀，使DNA沉淀成絮状，-20℃放置30min以上。

f)用钩状玻璃棒轻轻挑出絮状沉淀并置于新的1.5mL离心管中。

如果样品未出现云雾状沉淀或看不清沉淀，10000g离心10min，再收集沉淀。

g)加入1mL~1.5mL70%无水乙醇浸泡洗涤沉淀，轻摇几分钟，10000g离心10min，收集沉淀，重复1次。

然后将离心管水平放置在清洁场所晾干或在超净工作台上吹干。

h)风干后加入100μL灭菌的TE缓冲液溶解沉淀。

7.3DNA浓度的检测和定量
用TE缓冲液配制lμg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL的λ-DNA分子量标准溶液，各取3μLλ-DNA分子量标准溶液和3μL步骤7.2中提取的未知浓度DNA溶液，在1%琼脂糖凝胶上电泳15min~20min，稳压90V，电泳缓冲液为1×TBE，325nm紫外灯下观察，照相，检测提取DNA的质量。

按照GB/T28660要求的方法，计算提取DNA溶液的浓度。

7.4PCR反应
7.4.1PCR反应体系
在4℃条件下进行操作。

15μL反应总体系中，含有10×PCR缓冲液1.5mmol/L，Mg2+1.5mmol/L，dNTPs0.3mmol/L，正向、反向引物各0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶0.75U，模板DNA50ng/μL。

7.4.2PCR反应程序
扩增程序首先94℃预变性5min；随后的35个循环为：94℃变性30s，复性30s(不同SSR引物所需的退火温度见附录C)，72℃延伸30s；最后72℃延伸8min，4℃保存。

7.4.3PCR产物的处理
PCR扩增反应结束后，在15μL的反应体系中加入5μL的上样缓冲液，充分混匀后，备用。

7.5PCR产物检测
7.5.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测
7.5.1.1玻璃板的清洗
用洗涤剂清洗玻璃板（长板和短板），自来水冲洗干净，随后将玻璃板用蒸馏水冲洗2次，再用无屑纸巾沾取无水乙醇擦拭2遍，置于通风橱内垂直晾干待用。

7.5.1.2胶槽装配
a)玻璃板的固定
将长板玻璃板平铺于通风橱内，边条擦拭干净后置于长板玻璃板两侧，随后用短板玻璃板整齐地压盖住，确认边条与两玻璃板均对齐后，将其放入封胶框中并用夹子固定在制胶板上。

b)封胶
配制1%的琼脂糖凝胶，煮沸后用胶头滴管吸取，沿底边从左至右缓缓灌注入封胶框中，避免出现气泡，待琼脂糖凝胶完全漫过玻璃板底部，停止灌注，放置于温室下待其凝固后再进行下一步操作。

7.5.1.3丙烯酰胺胶的配制
在30mL8%聚丙烯酰胺贮备液中加入100μL10%过硫酸铵和200μL四甲基乙二胺，迅速轻轻混匀。

7.5.1.4灌胶
按照LY/T2756要求的方法进行灌胶。

灌胶后，将梳子轻轻插入灌胶口中，室温凝固30min。

7.5.1.5上样和电泳
待凝胶完全凝固后，将装有凝胶的玻璃板轻轻从制胶板上取下，灌胶口向内用夹子固定在电泳槽上，使用1×TBE缓冲溶液灌注电泳仪的上下两槽，使下槽溶液漫过封胶框，上槽溶液漫过灌胶孔。

垂直缓慢将梳子从灌胶口中拔出，并用1×TBE缓冲溶液清洗和整理样品槽。

使用200μL移液器从左至右逐个对点样孔进行吹打，直至点样孔内无碎胶、气泡以及其他杂质。

取5μL步骤7.4.3处理后的PCR扩增产物上样，并在胶板的一侧或适当位置的点样孔中加入4μL的DNA Marker(DL2000Marker)作为对照，电泳在200V稳压，电流100mA条件下进行，电泳时间约为1.5~2h。

7.5.1.6卸胶
电泳结束，关闭电源，将上槽中1×TBE缓冲液放出，取下固定的夹子，去掉下部琼脂糖，取下玻璃板。

将玻璃板水平放置，用起胶铲沿灌胶口一侧边缘将玻璃板缓慢撬起，将紧贴有凝胶的玻璃板放入装有双蒸水的洗胶盘中轻轻摇晃，待凝胶与玻璃板完全分离后，取出玻璃板，放净双蒸水。

7.5.1.7银染
按照LY/T2426要求的方法，对电泳样品进行银染检测。

7.5.1.8谱带记录
参照DNA Marker电泳结果或扫描结果，根据每对SSR引物从检测样品中扩增出的条带数以及分子量大小，按“有”带记录为“1”、“无”带记录为“0”的方法，仔细记录每对SSR引物的PCR结果。

建立SSR引物、检测样品及有无（1/0）对应扩增条带数据库。

7.5.1.9SSR标记结果分析
利用相关统计分析软件，根据Nei（1973）的遗传相似系数（Genetic Similarity,GS）按式（1）计算检测样品间的遗传相似性水平。

采用非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA）进行聚类分析；绘制聚类分析结果图，显示SSR标记的直观结果。

(1)
式中：
GS——遗传相似系数，%；
Ni——第i个样品的扩增条带数；
Nj——第j个样品的扩增条带数；
Nij——第i个样品和第j个样品共有的扩增条带数。

7.5.2毛细管电泳荧光检测
7.5.2.1样品准备
对6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍（注：不同荧光标记的扩增产物他的最适稀释度通过预实验确定）。

分别取等体积的上述2种稀释液混合，从中吸取1μL加入到基因分析仪专用96孔板中，在各孔分别加入0.5μL的ROX-500分子量内标和8.5μL去离子甲酰胺，置于离心机中1000g 下离心10s。

将样品在PCR仪上95℃变性3min后上机测序。

7.5.2.2收集数据
启动基因分析仪，检查仪器工作状态后更换缓冲液。

将装有样品的96孔板置于样品架基座上，打开数据收集软件。

将电泳板信息等录入后，启动运行程序，基因分析仪自动收集毛细管电泳数据。

将检测得到的原始数据文件导入到分析软件GeneMapper 3.2中进行自动分析。

8分析和鉴定
用多对SSR引物组合进行检测，将不同种源或家系待测样品的电泳结果进行统计，据SSR位点的多态性，从而分析不同种源或家系间的遗传组成差异。

附录A
（资料性）
原理
A.1原理
SSR广泛分布于蒙古栎基因组中，不同蒙古栎种源或家系间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。

针对两侧序列高度保守的特点，设计一对特异引物。

利用PCR技术对重复序列进行扩增。

在电泳过程中，由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。

因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术，可以对蒙古栎种源或家系间遗传组成差异进行分析。

附录B
（资料性）
仪器设备及试剂
B.1主要仪器设备
PCR仪、基因分析仪、凝胶成像系统、水平电泳槽及配套的制胶配件、垂直电泳槽及配套的制胶配件、台式低温高速冷冻离心机、超微量紫外/可见分光光度计、高压灭菌锅、液氮罐、超低温冰箱、高压电泳仪、移液器、超纯水系统、水平摇床、电子天平、制冰机。

B.2试剂
三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、RNase A、氯仿、异戊醇、β-巯基乙醇、硼酸、氢氧化钠、浓盐酸、溴化乙锭（EB）、琼脂糖、SSR引物、Taq DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸（dNTPs）、10×PCR缓冲液（含Mg2+）、λ-DNA分子量标准液、DNA Marker、丙烯酰胺、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED)、甲醛、硝酸银、冰乙酸、无水乙醇、甲叉双丙烯酰胺、ROX-500分子量内标、离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青、DNA分析用光谱校准基质（包括FAX、HEX荧光标记DNA片段）、DNA分析仪专用电泳缓冲液。

附录C
（资料性）
SSR（简单重复序列）标记引物序列
表C.1SSR（简单重复序列）标记引物序列
位点引物序列（5’-3’）重复单元片段长度
(bp)
荧光退火温度（℃）
N1010265F:AGACTCTCCGGATGCTCCTT
(CAA)9180-1925’6-FAM51 R:ATGCCGAACCCTAACCTCTT
N1014482F:GCCAATGTTGCTGAATTTCC
(AAT)6171-2025’6-FAM50 R:TCTAGCATGGACTGACGTGC
N1105306F:TCTTCTTCCAAACCTCGTCG
(TTC)7150-1685’6-FAM50 R:GGTTAGAACGGCATCATCGT
N1110207F:GTTCTGTACGAAGGCCGAAG
(CAA)8164-1835’6-FAM52 R:CGGTGTTGGAGACACGTAAG
N1345390F:TTAGGAGGCGTGATCGTACC
(GAC)7135-1535’6-FAM50 R:AGACGAGCATTTCACAATCG
N12361F:GACACGTCACGACCACTCAC
(CAAA)5139-1525’HEX53 R:TTACGCAGAATGCCACTGTC
N1247890
F:AGGGACACGTGCTCATTAGG
(CTTT)6185-2055’HEX54 R:CTCTACTCCGATCACTCCGC
N1457047F:AGCACAAGCCAATGTAGAAGC
(AAAT)5156-1715’HEX50 R:TTTGGACAGCAACAACAACC
N4544558F:TTCTACTCTTGCCCTGGACG
(AAT)6168-1825’HEX52 R:TAAGGCCTGCAGAGTTGGAC
N4529840F:CCAGCTAAGACGCTCAATCC
(TTC)5200-2155’HEX51 R:AATCGAAACTCACTCCGTGG
附录D
（资料性）
主要试剂的配制
D.1常用贮备液
D.1.10.5mol/L EDTA-二钠（pH8.0）溶液
O中，加入氢氧化钠（NaOH）调节pH至8.0，用超纯水定将18.61g乙二胺四乙酸二钠溶于80mL H
2
容至100mL，高压灭菌，4℃保存。

D.1.21mol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液
将24.22g三羟甲基氨基甲烷溶解于160mL水中，用浓盐酸（HCl）调节pH至8.0，用超纯水定容至200mL，高压灭菌，4℃保存。

D.1.35mol/L NaCl溶液
将58.44g氯化钠（NaCl）溶于160mL水中，定容至200mL，高压灭菌，4℃保存。

D.1.4CTAB提取缓冲液
缓冲液成分为2%（质量浓度）溴代十六烷基三甲胺、100mmol/L Tris-HCl（1mol/L pH8.0）、20 mmol/L EDTA（0.5mol/L，pH8.0）和1.4mol/L NaCl（5mol/L）。

在500mL超纯水中加入20gCTAB，搅动溶解后，加入100mL1mol/L Tris-HCl（pH8.0）、40mL0.5mol/L EDTA（pH8.0）和280mL5mol/L NaCl，定容至1L，高压灭菌，4℃保存。

D.1.5TE（pH8.0）缓冲液
取1mol/L Tris-HCl（pH8.0）1mL，0.5mol/L EDTA（pH8.0）0.2mL，用水定容至100mL，高压灭菌，4℃保存。

D.1.610mol/L NaOH溶液
称取80g氢氧化钠（NaOH），先用160mL水溶解后，在加水定容至200mL，高压灭菌，室温保存。

D.1.7EB（1mg/mL）溶液
取0.05g溴化乙锭（EB）用50mL水溶解，用铝箔或黑纸包裹容器，室温保存，工作浓度为1mg/mL。

D.1.86×DNA上样电泳缓冲液(DNA Lording Buffer)
6×DNA Lording Buffer，其中含0.05%（质量分数）溴酚蓝、0.05%（质量分数）二甲苯青、30 mmol/LEDTA、36%（质量分数）甘油和ddH
O。

使用时按照每5μL DNA样品加入1μL DNA上样缓冲
2
液的比例，混匀DNA样品和DNA上样缓冲液后，直接加到点样孔即可。

D.2琼脂糖凝胶电泳溶液的配制
称取1g电泳级琼脂糖置于200mL三角瓶中，加入100mL1×TBE电泳缓冲液，在微波炉中熔化至溶液透明（确保所有琼脂糖颗粒均完全熔化），冷却至50℃~60℃，加入EB（1mg/mL）溶液使其终浓度为0.5μg/mL，混匀后倒入放好梳子（距底板约1mm）的载板上，凝胶厚度为3mm~5mm，待凝胶完全凝固后放入电泳槽中，然后向槽内加入1×TBE稀释缓冲液至液面刚好没过胶板上表面。

D.3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制
D.3.140%丙烯酰胺贮备液
分别称取丙烯酰胺380g和甲叉双丙烯酰胺20g，用灭菌双蒸水定容至1000mL,混匀，过滤。

于棕色瓶中室温保存。

D.3.210%过硫酸铵溶液
称取过硫酸铵1g,用灭菌双蒸水定容至10mL，4℃冰箱保存（现用现配）。

D.3.310倍三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸缓冲液（10×TBE缓冲液）
分别称取Tris碱108g和硼酸55g，再加入0.5mol/L EDTA（pH8.0）40mL，用灭菌双蒸水定容至1000mL，混匀，室温保存。

D.3.48%非变性聚丙烯酰胺工作液
分别量取40%丙烯酰胺贮备液10mL，10×TBE5mL，10%过硫酸铵100μL，四甲基乙二酸200μL 和双蒸水35mL，混匀后4℃保存备用。

D.4银染试剂配制
D.4.1固定/脱色液
量取100mL冰乙酸，加灭菌双蒸水定容至1000mL（现用现配）。

D.4.2硝酸银染色液
称取3g硝酸银，加灭菌双蒸水定容至500mL，加入1.6mL37%甲醛，混匀。

D.4.3氢氧化钠显影液
称取10g氢氧化钠，加入500mL灭菌双蒸水，在4℃冰箱预冷30min后，加入2mL37%甲醛，混匀（现用现配）。

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