昆明酸浆米粉优势乳酸菌筛选及发酵性能研究

昆明酸浆米粉优势乳酸菌筛选及发酵性能研究
刘慧;周茉;熊利霞;高秀芝;张红星
【摘要】In this paper, dominant Lactic acid bacteria were screened and were fitting to form Kunming Physalis alkekengi rice -noodle for the first time.The different culture temperature on the effect of separation and purification for dominant bacteria were studied, and the fermentation performance of dominant bacteria was researched as well.The dominant bacteria strains were screened by high throughput screening technology and the procedures of acid production,fermentation activity and the sensory evaluation for Physalis alkekengi rice - noodle.The dominant bacteria strains were classified and identified by trace biochemical reactions.The results showed that: Lactic acid bacteria had a dominant position at 37℃ under the conditions of isolation and culture, and Lactobacillns R1, R9 and R11 strains were obtained with excellent fermentation performance.The result of strain identification: Strain R1 was big Bi fidobacterium magnum,strain R9 was Lactobacillus rhamnosus, and strain R11 was Lactobacillus sakei ss sakei.Strain R0 had the strongest capability of producing acid and had the most fermentation activity to make the high toughness of Physalis alkekengi rice noodle.Strain R1 made the best rice flavor of Physalis alkekengi rice - noodle.Strain Rn made the Physalis alkekengi rice -noodle slippery taste.The three Lactobacillus had excellent fermentation performance and could be used to make Physalis alkekengi rice -noodle complex microbial agents artificially, so as to further
develop the good quality Physalis alkekengi rice - noodle.%从昆明酸浆米粉中首次筛选适合于米粉发酵的优势乳酸菌菌株,研究不同培养温度对优势菌分离纯化效果的影响,探讨发酵性能.采用高通量筛选技术及应用产酸能力、发酵活力与酸浆米粉的感官评价程序,筛选发酵优势菌株,并利用微量生化反应对优势菌进行分类鉴定.结果表明:在37℃分离培养条件下乳酸杆菌较占优势,获得发酵性能优良的乳酸杆菌R1、R9、R11 菌株.鉴定菌种结果:R1菌株为大双歧杆菌(Bifidobacterium magnum)、R9菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacilsu rhamnosus)、R11菌株为米酒乳杆菌米酒亚种(Latctobcillus sakei ss sakei).其中R9菌株产酸能力最强,发酵活力最高,使酸浆米粉韧性高;R1菌株使酸浆米粉的米香风味最佳;R11菌株使酸浆米粉口感爽滑.可利用此3株发酵性能优良的乳酸杆菌人工制备酸浆米粉复合发酵剂,进一步开发研制优良品质的酸浆米粉.
【期刊名称】《中国粮油学报》
【年(卷),期】2011(026)005
【总页数】6页(P1-6)
【关键词】昆明酸浆米粉;乳酸菌;分离鉴定;发酵性能
【作者】刘慧;周茉;熊利霞;高秀芝;张红星
【作者单位】北京农学院食品科学学院,北京102206;北京农学院食品科学学院,北京102206;北京农学院食品科学学院,北京102206;北京农学院食品科学学院,北京102206;北京农学院食品科学学院,北京102206
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.9
发酵米粉是将整粒大米浸泡足够长的时间使其自然发酵，从而使米粉获得比非发酵米粉更好的口感和品质［1］。

乳酸菌是酸浆米粉中主要起作用的菌群，其发酵性能对缩短发酵时间、提高米粉品质、降低断条率、延长保鲜期等方面都有重要意义［2］。

昆明过桥米粉是一种营养成分较全面均衡、独具云南特色的中式快餐食品［3］。

它之所以米香、爽滑、筋道柔韧，缘于先将优质大米在自然条件下进行乳酸发酵，其酸浆米粉中的乳酸菌种类和数量因长期受温和的自然气候、高海拔地域的氧气、温度、湿度的影响，在米粉中已形成稳定的、占优势的、发酵性能优良的乳酸菌菌群，从而保证昆明的酸浆米粉品质稳定。

然而，北京传统自然发酵的酸浆米粉比昆明的米粉口感和品质差异较大。

其原因是，在自然发酵过程中因受北京地区不同季节变化较大的温度、湿度等自然环境条件的影响，使发酵大米粉中乳酸菌的种类和数量不稳定，乳酸菌发酵米粉的质量不易被控制，这不仅导致米粉乳酸发酵时间较长，产品保鲜期较短，而且其感官品质亦不稳定，存在缺乏米香，口感不够爽滑，韧性差，筋道差，易断条等问题，从而限制了酸浆米粉的规模化生产。

本试验从昆明桥香园酸浆米粉中首次筛选适合于米粉发酵的乳酸菌优势菌株，研究不同培养温度对优势乳酸菌分离纯化效果的影响，探讨其发酵性能。

采用高通量筛选技术分离发酵性能优良的优势菌株，并利用快速、准确、重复性好的微量生化反应微生物鉴定技术对优势菌进行分类鉴定。

旨在利用筛选的发酵性能优良的乳酸菌优势菌株，模仿昆明酸浆米粉的优势乳酸菌菌群，人工制备酸浆米粉复合发酵剂，进一步研发可与云南正宗米粉媲美的具有优良品质的酸浆米粉。

1．1 材料与设备
酸浆米粉:云南省昆明市桥香园酸浆米粉，由本院食品微生物实验室保存;AN－IF 厌氧菌接种液［4］、65% 标准浊度液、0．005% 韧天青标准溶液BUA+B培养基:美国Biolog公司;3%H2O2溶液、0．1 mol/L氢氧化钠标准溶液及0．5%酚酞指示剂:北京蓝弋公司;灭菌生理盐水、革兰氏染色液等;改良MRS琼脂培养基(含
碳酸钙和纳他霉素、硫酸多黏菌素B)、改良MRS液体和斜面培养基［4］:自制。

MicroStation型全自动微生物鉴定系统(包括读数仪、浊度计、8道电动连续微量移液器、AN微量鉴定板):美国Biolog公司;130万像素数码显微摄像系统:Motic 实业集团;K－400型体视显微镜:Motic实业集团;CX41－32C02型三目生物显微镜:日本奥林巴斯公司;BS224S型电子天平(220 g/0．1 mg):德国赛多利斯公司;SA －300VL型全自动高压灭菌锅:台湾新骏实业股份有限公司;SW－LJ－IF型无菌超净工作台:苏净集团安泰公司;GHP－9160型隔水式恒温培养箱:上海一恒科学仪器有限公司;BCD－301型冰箱:青岛海尔公司;多功能食物处理机:山东九阳小家电有限公司。

1．2 筛选优势菌株操作流程
酸浆米粉→菌悬液制备→平板接种→分离培养→观察菌落特征→纯化培养→镜检→过氧化氢酶试验→保种→活化→发酵性能测定→筛选发酵性能优良菌种→菌种鉴定→改良MRS斜面培养基保种［5］
1．3 筛选优势菌株操作要点
1．3．1 稀释液的制备
称取酸浆米粉5 g移入带玻璃珠的45 mL无菌生理盐水中，以漩涡振荡器充分振荡3 min后，吸取1 mL注入9 mL无菌生理盐水。

重复以上操作，制备10－4～10－6样品稀释菌液。

1．3．2 平板接种与分离培养
以稀释倾注法接种平板，倒入含碳酸钙和纳他霉素、硫酸多黏菌素B的改良MRS 琼脂培养基，混匀，每个稀释度做两个重复。

或直接平板划线接种。

分别于30℃和37℃培养48 h，借助体视显微镜观察优势乳酸杆菌典型的菌落特征，并计数酸浆米粉中乳酸菌的初始总活菌数量［6］。

本试验设计采用的改良MRS琼脂培养基在高通量筛检乳酸菌方面与普通MRS培养基相比有以下优势:①改良MRS培养
基成分中牛肉膏、酵母浸出粉含量较高，具有丰富的氨基酸、维生素、核酸等，并以胰蛋白胨和乳酪蛋白水解物替代普通MRS培养基中的鱼肉蛋白胨，能刺激所有乳酸菌的生长;②改良MRS培养基中CaCO3的使用量也很大，有利于显示乳酸菌产生的高酸，通过菌落周围乳酸溶解CaCO3形成的透明圈识别乳酸菌;③在改良MRS培养基中加入一定浓度的纳他霉素，与普通MRS培养基相比能够选择性抑制样品中酵母菌和霉菌的生长，避免影响乳酸菌的生长繁殖。

④在改良MRS培养基中还加入硫酸多黏菌素B，以抑制样品中发酵葡萄糖或乳糖的肠杆菌科的细菌，避免与乳酸菌的菌落发生混淆，但对乳酸菌的生长并无抑制作用。

1．3．3 纯化培养
挑取CaCO3溶解圈较大的单菌落接种于改良MRS液体培养基中，分别于30℃和37℃培养24 h后，镜检观察。

1．3．4 镜检
取1环1．3．3步骤的培养物进行革兰氏染色，油镜观察个体形态和纯度，将纯粹培养物划线转接入改良MRS斜面培养基中，分别于30℃和37℃培养24 h，保种待用。

如此反复分离纯化培养，直至镜检结果得到单一形态的纯粹菌种。

1．3．5 H2O2酶试验
取1环1．3．3步骤的培养物于载玻片上做H2O2酶试验，无气泡者视为阴性［4］。

选取H2O2酶阴性菌株，进行发酵性能测定。

1．3．6 优良发酵性能乳酸菌株的筛选
菌株产酸能力测定:将1．3．4 和1．3．5 步骤筛选的生长良好的乳酸菌纯种分别接种于改良MRS液体培养基中，37℃增菌培养12 h，活化2～3代，再以2%接种量分别转接入盛米粉醪液(25 g大米粉+100 mL无菌水)的三角瓶中，每菌株做3个重复，同时以未接种的自然发酵的米粉醪液作对照，于37℃发酵30 h，每6 h测定酸度。

据此，筛选产酸能力较强的菌株。

菌株发酵活力测定:韧天青还原试验法。

吸取上述1 mL改良MRS增菌液移入9 mL米粉醪液中，加入韧天青标准溶液1 mL，同时以不加培养液作对照，试验组置于37℃水浴，对照组置于室温，每5 min观察退色结果，以终点(淡粉红色)出现时间作为评价菌种活力的指标［5］。

据此，筛选发酵能力较高的菌株。

菌株发酵米粉醪的酸度测定及酸浆米粉的感官评定:将菌株产酸能力测定步骤中乳酸菌活化增菌培养液以2%接种量分别转接入盛米粉醪液(500 g大米粉+2 000 mL无菌水)的容器中，每菌株做3个重复，同时以未接种的自然发酵的米粉醪液作对照，于37℃发酵12 h后，测定米粉发酵醪(酸浆大米粉)的酸度，同时对酸浆大米粉经过糊化(蒸煮糊化温度为80℃)、滤条、冷却等工艺制备酸浆米粉［7］，根据酸浆米粉感官评定标准(见表1)，由10位评定人员对不同菌株制作的酸浆米粉进行感官评分(包括色泽5分、风味15分、滑爽感15分、韧性15分，总分50分)，据此筛选出优良品质的菌株。

1．3．7 优良发酵性能乳酸菌株的鉴定
采用Biolog全自动微生物鉴定系统鉴定［4］:在96孔微量生化反应厌氧菌专用鉴定板中，有95个孔分别含有95种不同碳源(其中A1孔作为阴性对照)，即每一个孔可进行一种生化反应，根据待测乳酸菌细胞在代谢过程中利用不同碳源产生的酶与四唑紫发生显色反应(四唑紫氧化态为无色，还原态为紫色)的原理，检测时通过智能软件将待鉴定乳酸菌的特征指纹图谱与厌氧菌数据库比对，即可快速得出鉴定结果。

接种改良MRS平板:取2～3环发酵性能优良菌株斜面培养物，以9 mL无菌生理盐水适当稀释后，连续划线接种于改良MRS平板，37℃培养2 d，挑取单菌落进行菌种鉴定。

接种标准BUA+B平板:挑取改良MRS平板上的单菌落，分别连续划线接种于BUA+B平板(含5%无菌脱纤维绵羊血)，于37℃培养24 h。

菌悬液的制备、接种培养与读取结果:用无菌湿棉签以滚动方式轻轻蘸取BUA+B
平板上的菌落，移入AN－IF厌氧菌接种液，调整菌悬液的透光度T值至(65±3)%，分别接种于AN微量鉴定板中，于37℃厌氧培养24～48 h后，读取鉴定结果。

2．1 酸浆米粉中乳酸菌的分离结果
由表2可见，采用含碳酸钙和纳他霉素、硫酸多黏菌素B的改良MRS琼脂培养基分离培养发现，样品稀释度为10－4～10－6菌悬液的平板菌落较清晰，且其周
围产生透明圈。

这是因乳酸菌产生较多乳酸将培养基中的CaCO3溶解之故［5］。

通过识别典型菌落周围的透明圈，提高分离乳酸菌的效率;此外，酸浆米粉中微生
物复杂，有细菌(主要以乳酸菌为主)、酵母菌和霉菌［8－9］，在改良MRS培养基中加入一定浓度的纳他霉素和硫酸多黏菌素B，能选择性抑制酵母菌、霉菌及肠杆菌科的细菌生长，因而可达到高通量筛选酸浆米粉中乳酸菌的目的。

采用改良MRS琼脂培养基计数酸浆米粉中乳酸菌的初始活菌数量。

由表3可知，在30℃和37℃培养条件下乳酸菌的活菌数量分别为5．6×104cfu/g和
2．7×106cfu/g，优势乳酸杆菌的比例分别为68%和87%，选取优势乳酸菌的典型单菌落90多个进行革兰氏染色观察。

不同培养温度对乳酸菌分离纯化效果有较大影响。

由表4可知，在37℃条件下，平板菌落生长密集，菌体大多呈短杆、长杆、弯曲杆等多种形态，初步确定为乳酸杆菌，经多次分离纯化后获得4种不同
形态的乳杆菌;在30℃条件下，平板菌落生长稀疏，菌体大多为短杆菌，少部分为球菌，经多次分离纯化后原本的乳球菌又出现球菌与杆菌交替生长现象。

由此说明，在37℃条件下乳酸菌长势好且多为乳酸杆菌，而30℃条件下乳酸菌相对长势弱，并且有生长不稳定现象。

经37℃反复分离纯化，最终获得 H2O2 酶阴性、G+的
乳杆菌 R1、R4、R7、R9、R10、R11、R13、R14菌株。

故在37 ℃ 分离培养条件下乳酸杆菌较占优势，能够分离到形态多样的乳酸杆菌。

2．2 优良发酵性能乳酸菌株的筛选
2．2．1 菌株产酸能力测定
酸浆米粉风味的形成与乳酸菌发酵过程中代谢产生多种物质有关，而这些物质的产生与发酵糖类产生乳酸的速度、产酸的量(能力)、还原韧天青能力等活力指标有密切关系。

由图1可见，各菌株从发酵6 h开始酸度上升较快，24 h后上升逐渐缓慢，但仍有上升趋势。

其中R9菌株6 h至12 h酸度上升最快，30 h 后可达36．72 °T;其次是R11、R1、R7菌株，6 h之后酸度基本以匀速上升，30 h后酸度分别可达36．01、35．51、32．29 °T;R14菌株虽然在 30 h 后酸度可达33．80°T(比R7菌株稍高)，但6 h至12 h酸度上升速度较慢;R13菌株虽然从6 h至12 h酸度上升较快，但从24 h至30 h酸度由34．00°T下降至
30．78 °T;R10、R4菌株酸度上升缓慢，30 h 后分别可达23．14、18．81°T。

而未接种的对照组产酸速度最慢，30 h后酸度只有7．75°T。

由此说明，接种发
酵比自然发酵的产酸能力强，发酵时间短。

综合比较各菌株的产酸能力排序:R9＞
R11＞R1＞R7＞R14＞R13＞R10＞R4＞对照。

2．2．2 菌株发酵活力测定
韧天青加入到含有测试菌株的米粉醪液中，开始呈蓝紫色。

随着测试菌株的生长繁殖，其发酵活力与还原韧天青退色时间成反比，亦与测试菌株的初始浓度成反比。

如果菌株的初始浓度高，发酵速度快，则可迅速还原韧天青，由蓝→红紫→粉红→无色［10］。

由表5可知，R13、R9菌株还原刃天青所用时间最短，为2～7 min，发酵活力最强;R11、R7菌株还原时间为56～76 min，发酵活力较强;R1菌株还原时间为240 min，发酵活力次之。

37℃水浴试验组比较各菌株的发酵活力
排序:R13＞R9＞R11＞R7＞R1＞R10＞R14＞R4＞对照。

室温对照组各菌株的发
酵活力排序与之相同。

采用高通量筛选技术及产酸能力与发酵活力测定，获得发酵性能优良的乳酸杆
菌:R1、R7、R9、R11、R13菌株。

其中，R9菌株酸度上升最快，产酸能力最强，
且发酵活力较高。

其次是 R11、R1、R13、R7，其中R13菌株发酵活力最高，且酸度上升较快，产酸能力较强，可进一步通过对酸浆米粉的感官评定筛选出优良品质的菌株。

2．2．3 菌株发酵米粉醪的酸度测定及酸浆米粉的感官评定
筛选发酵性能优良的乳酸菌种是制备酸浆米粉复合发酵剂的关键。

筛选工作主要从两方面考虑:①产酸能力:由于乳酸菌在米粉醪液中发酵产生乳酸，导致米粉醪液的pH下降，使酸浆大米粉的酸度升高，酸度越高则发酵性能越强;②感官评价:利用发酵性能优良的乳酸菌进行纯种乳酸发酵，不仅使酸浆米粉口感筋道柔韧，而且代谢产生的乳酸使酸浆米粉的发酵香味浓郁。

由表6和表7可知，R9菌株与其他4株菌相比，其酸浆大米粉的酸度较高，酸浆米粉的韧性最优，色泽剔透如白玉，但滑爽感不突出;R1菌株可提供较佳的米香味，但酸度不高;R11菌株可提供优良的爽滑感，产酸能力处于中上水平，风味较好，色泽一般。

R7与R11菌株产酸能力相近，但韧性和色泽不佳。

R13菌株虽然使酸浆大米粉的酸度较高，但其酸浆米粉的韧性和色泽一般，并且有类似青霉素的异味;而对照组属于未接菌的酸浆大米粉自然发酵，产酸最慢，酸度最低，其酸浆米粉的感官综合评分最低，米香味和韧性差，口感黏腻，色泽差。

由此说明采用优良乳酸菌的纯种乳酸发酵可以明显提高酸浆米粉的感官品质。

通过产酸能力与感官综合评价筛选程序，最终获得发酵性能优良的乳酸杆菌R1、R9、R11菌株。

它们分别为酸浆米粉提供风味纯正，酸度较高，柔韧性高，口感爽滑等优良品质特性，是制备酸浆米粉复合发酵剂的优良菌种。

2．3 优良发酵性能乳酸菌株的鉴定
采用全自动微生物鉴定系统鉴定乳酸菌株的结果是:R1菌株为大双歧杆菌(Bifidobacterium magnum)，SIM值为0．97;R9菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，SIM 值为 0．98;R11菌株为米酒乳杆菌米酒亚种
(Lactobacillus sakei ss sakei)，SIM值为0．97。

SIM值(Similarity)表示测试结果与数据库相应的数据条的匹配程度，SIM值越接近1．00，鉴定结果的可信度
越高。

本试验鉴定株菌的SIM值均≥0．97，由此说明该鉴定系统对3株菌鉴定结果的可信度很高。

其中R9菌株产酸能力最强，发酵活力最高，使酸浆米粉柔韧性最好;R1菌株使酸浆米粉产生的米香风味最佳;R11菌株使酸浆米粉口感爽滑。

分
离筛选的3株菌均具备了优良的发酵性能。

其个体形态如图2所示(改良MRS培
养基)。

3．1 利用含碳酸钙和纳他霉素、硫酸多黏菌素B的改良MRS琼脂培养基，可有
效识别菌落周围的透明圈，提高分离乳酸菌的效率;纳他霉素和硫酸多黏菌素B能
选择性抑制酵母菌、霉菌和肠杆菌科的细菌生长，达到高通量筛选乳酸菌的目的。

在37℃分离培养条件下乳酸杆菌较占优势，能够分离到形态多样的乳酸杆菌。

3．2 采用高通量筛选技术及产酸能力与发酵活力测定，获得发酵性能优良的乳酸
杆菌:R1、R7、R9、R11、R13菌株。

其中，R9菌株酸度上升最快，产酸能力最强，且发酵活力较高。

其次是R11、R1、R13、R7，其中R13菌株发酵活力最高，且酸度上升较快，产酸能力较强，可进一步通过对酸浆米粉的感官评定筛选出优良品质的菌株。

3．3 通过产酸能力与感官综合评价筛选程序，获得发酵性能优良的乳酸杆菌R1、R9、R11菌株。

它们分别为酸浆米粉提供风味纯正，酸度较高，柔韧性高，口感
爽滑等优良品质特性。

3．4 采用全自动微生物鉴定系统鉴定菌种结果是:R1菌株为大双歧杆菌(Bifidobacterium magnum)、R9菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、R11菌株为米酒乳杆菌米酒亚种(Lactobacillus sakei ss sakei)。

其中R9菌株产酸能力最强，发酵活力最高，使酸浆米粉韧性高;R1菌株使酸浆米
粉的米香风味最佳;R11菌株使酸浆米粉口感爽滑。

可利用此3株发酵性能优良的
乳酸杆菌人工制备酸浆米粉复合菌发酵剂。

【相关文献】
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