免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项以下是免疫荧光双标操作方法及注意事项的详细介绍：方法：1.样品制备：a.细胞：将培养皿中的细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，并以适当浓度悬浮于PBS（磷酸盐缓冲液）中。
b.组织：从动物体内取出组织样本，用PBS洗涤并切成适当大小的块。
2.固定：a.细胞：用适当浓度的乙醛在室温下固定细胞。
b.组织：用适当浓度的乙醛固定组织样本，然后在PBS中冲洗。
3.渗透：a.细胞和组织：将样本浸泡在PBS-T（含0.2%的肌凝蛋白酶）中，进行渗透处理，以增强抗体的渗透性。
4.阻断：a.使用几何草酸或明胶作为非特异性蛋白质的抗原来阻止非特异抗体的结合。
5.主抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的一抗（特异抗体），孵育样本，可以在室温或4°C条件下进行。
6.洗涤：a. 用PBS-T或TBST（含0.1%的Tween 20）进行多次洗涤，以去除未结合的一抗。
7.次抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的二抗（荧光标记的抗体），与一抗结合后，通过固定区域与目标蛋白进行特异结合。
8.洗涤：a.用PBS-T或TBST进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。
9.核染色/细胞膜染色：a.加入DNA染色剂（如DAPI）或细胞膜标记（如细胞膜标记染料），用于定位目标蛋白。
10.显微镜观察：a.将样本放置在玻片上，用荧光显微镜观察并拍照或记录图像。
注意事项：1.温度控制：孵育和洗涤过程中，适当控制温度可以提高抗体结合的特异性和效率。
2.抗体稀释倍数：需要根据实验要求和试剂手册推荐的稀释倍数来使用抗体。
3.阻断剂的选择：根据实验要求选择适当的非特异性蛋白质抗原来阻断非特异抗体的结合。
4.试剂保存：将抗体和荧光标记物保存在适当的低温条件下，避免暴露在光和高温下。
5.孵育时间：一抗和二抗的孵育时间需要根据试剂手册推荐的时间来进行。
6.具体细胞/组织类型的处理：不同的细胞或组织在样品制备和处理过程可能需要略微不同的方法，可以参考试剂手册或已发表的方法。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是一种常用的免疫学研究方法，可以用于检测和定位抗原或抗体在细胞或组织中的表达和定位。
免疫荧光操作步骤及注意事项如下：步骤1：样品制备1.收集需要检测的细胞或组织样品。
2.如有需要，固定细胞或组织样品以保持其形态和抗原性。
3.如有需要，对组织样品进行切片以便于检测。
步骤2：抗体选择和标记1.根据需要选择合适的一抗和二抗，一抗用于识别目标抗原，二抗用于与一抗结合并携带荧光标记。
2. 选择合适的荧光染料或荧光标记，常用的有荧光素色素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
3.根据供应商指南或经典实验文献中的方法，进行抗体标记。
步骤3：荧光标记试剂的制备1.根据推荐的配方或说明书，在标记试剂的缓冲液中加入合适的荧光染料或荧光标记，并进行充分混匀。
2.如有需要，可以在标记试剂中加入其他辅助试剂以增强染色强度或减少非特异性结合。
步骤4：样品孵育1.将样品均匀分布在载玻片或孵育板上，并使其附着。
2.加入一抗和二抗的混合物，并在暗处孵育一段时间，通常在室温下孵育1-2小时或在4°C下孵育过夜。
3.如果需要，可以在抗体孵育结束后进行染色或共孵育其他标记试剂。
步骤5：洗涤1.在孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤样品，以去除未结合的抗体和其他杂质。
2.洗涤次数根据需要，通常进行3-5次洗涤，每次洗涤时间约5分钟。
步骤6：显微镜观察和成像1.将标本置于显微镜上，并使用荧光显微镜或倒置显微镜观察荧光信号。
2.使用合适的荧光滤光片或滤片盒，选择适当的波长来显现荧光染色。
3.根据需要，使用数字相机或图像分析软件进行图像采集和分析。
注意事项：1.仪器和试剂的准备与操作一定要在无菌和干净的条件下进行，以避免外源性污染或感染的发生。
2.使用抗体和试剂前请仔细阅读供应商提供的说明书，遵守推荐的使用和储存条件。
3.一抗和二抗的选取要慎重，确保其与目标抗原或抗体具有高度特异性。
4.荧光标记试剂的制备要注意在无菌和干净的条件下进行，避免污染或降低荧光标记效果。
[教材]免疫荧光操作步骤及注意事项
![[教材]免疫荧光操作步骤及注意事项](https://img.taocdn.com/s3/m/bfd95ed44128915f804d2b160b4e767f5acf80ab.png)
免疫荧光操作步骤及注意事项一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。
细胞免疫荧光标记实验步骤
细胞免疫荧光标记实验步骤细胞免疫荧光标记实验是用来观察和分析细胞中的特定分子或结构的一种常用方法。
下面是一些常见的细胞免疫荧光标记实验步骤：1. 细胞培养准备:- 在无菌条件下准备所需培养基和培养器具。
- 将待标记细胞接种在培养皿中，以适当的细胞密度使其在培养基中生长。
2. 固定细胞:- 将细胞培养皿中的培养基倒掉。
- 用生理盐水或磷酸缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除未附着的细胞和培养基残留。
- 加入适当的固定液，例如4%的乙醛，固定细胞并封存其内部结构。
3. 渗透化处理:- 使用适当的渗透剂，如0.1%的Triton X-100，以打破细胞膜，使抗体能够渗透到细胞内部。
- 进行渗透化处理的时间应根据实验要求而定。
4. 抗体标记:- 制备适当的抗体和荧光染料稀释液。
- 将抗体稀释液加入到细胞上，使其与目标分子结合。
- 按照实验要求，在适当的温度和时长下孵育细胞，促使抗体与目标分子充分结合。
5. 洗涤和染色:- 用洗涤缓冲液充分洗涤细胞，以去除未结合的抗体和荧光染料。
- 使用适当的荧光染料对细胞进行染色。
如需防褪色，可以添加适当的抑制剂。
6. 显微镜观察和图像捕获:- 用适当的显微镜观察细胞，并捕获荧光图像。
- 根据需要，使用图像处理软件对图像进行分析和量化。
注意事项：- 实验前确保实验室和设备都是清洁的，并遵守实验安全操作规范。
- 涉及有害物质时，戴好个人防护用品，如实验手套和护目镜。
- 每个实验步骤的时间和条件可能因实验要求而异，需根据具体实验方案进行调整。
这些步骤提供了一般的细胞免疫荧光标记实验的大致流程，但具体实验方法还需根据实验目的和材料的特性进行优化和调整。
参考资料：[1] Smith, C. et al. ___. Cold Spring Harb. Protoc. 7, 1052–1055 (2013).[2] Manders, E. M. M. et al. FISH: ___. Cold Spring Harb. Protoc. 2006, db.rot4111 (2006).。
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
免疫荧光共沉淀实验的操作步骤及注意事项
免疫荧光共沉淀实验的操作步骤及注意事项The steps of immunofluorescence co-precipitation are as follows:1. Sample preparation: Collect the biological sample of interest and fix it appropriately to preserve the antigenic epitopes.2. Blocking: Treat the sample with a blocking agent, such as BSA or serum, to prevent non-specific binding of antibodies.3. Primary antibody incubation: Incubate the sample with a primary antibody specific to the target antigen. This antibody will bind to the antigen of interest.4. Washing: Wash the sample to remove any unbound primary antibody.5. Secondary antibody incubation: Incubate the sample with a secondary antibody conjugated to a fluorescent dye. This secondary antibody will bind to the primary antibody, allowing for detection and visualization of the target antigen.6. Washing: Wash the sample to remove any unbound secondary antibody.7. Mounting and imaging: Mount the sample on a microscope slide and cover it with a mounting medium. Then, visualize the fluorescence using a fluorescence microscope or other imaging system.中文回答:免疫荧光共沉淀的步骤如下：1. 样本制备：收集所需的生物样本，并适当固定以保留抗原表位。
多重免疫荧光染色步骤
多重免疫荧光染色步骤引言：多重免疫荧光染色是一种常用的实验技术，可以同时检测多个目标分子在细胞或组织中的分布和表达情况。
本文将详细介绍多重免疫荧光染色的步骤和操作要点。
一、样品处理1. 固定样品：将细胞或组织样品固定在载玻片上，以保持其形态和结构的完整性。
常用的固定剂包括甲醛、乙酸乙酯和乙醇等。
2. 渗透化处理：使用适当的渗透化剂，如Triton X-100或Tween-20，使抗体能够渗透到细胞或组织中。
二、抗体染色1. 阻断非特异性结合：在样品中加入非特异性抗体，如牛血清白蛋白（BSA）或羊血清蛋白（GFP），以阻断非特异性结合位点。
2. 加入第一抗体：将第一抗体加入样品中，与目标分子结合。
第一抗体可选择单克隆抗体或多克隆抗体。
3. 温育：将样品在适当的温度下孵育一段时间，以促进抗体与目标分子的结合。
4. 洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体。
5. 加入第二抗体：将与第一抗体来源不同的二抗加入样品中，与第一抗体结合。
第二抗体通常是标记有荧光染料的抗动物IgG。
6. 温育：将样品在适当的温度下孵育一段时间，以促进二抗与第一抗体的结合。
7. 洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的二抗。
三、显微镜观察和图像分析1. 准备显微镜：调整显微镜的倍数和对焦，确保观察的图像清晰。
2. 拍摄图像：使用数码相机或显微镜系统，拍摄染色后的样品图像。
3. 图像分析：使用图像处理软件对图像进行分析，包括定量分析和定位分析。
可以通过计算荧光强度和位置来获取目标分子的表达水平和分布情况。
四、注意事项1. 抗体选择：选择适当的抗体对目标分子进行检测，确保其特异性和敏感性。
2. 温育条件：温育时间和温度需根据抗体和样品类型进行优化，以提高染色效果。
3. 洗涤条件：洗涤时需充分去除未结合的抗体和试剂，以减少背景信号。
4. 控制实验：进行相应的阴性对照实验，用于验证染色结果的特异性。
5. 图像分析方法：选择合适的图像处理软件和分析方法，确保准确、可靠地分析染色结果。
免疫荧光实验的实验操作步骤及注意事项
免疫荧光1.免疫荧光所用玻片的处理(1) 玻片的规格：圆形18mm×18mm可放入12孔盘；(2) 处理方法：将玻片一片一片的放入1M的盐酸中，65度浸泡过夜，每一遍均要一片一片的清洗，第一遍用流动的自来水冲洗，，其余在盆里清洗，要洗5次以上，再用蒸馏水洗，同样的方法洗5次以上，再用超声，低功率，一小时。
完后再用蒸馏水洗5遍，洗完以后放入95%的乙醇中长期保存。
临用时，在酒精灯上过一下，使玻片上残余的乙醇燃烧，干燥后放入12孔板。
2. 铺板子如细胞难以贴壁（如293T）或需观察细胞骨架的相关指标，需用多聚赖氨酸处理玻片。
多聚赖氨酸1ml，置于37度孵箱30-60min，吸干液体，用DDW洗三遍，吸干液体，紫外照射5-10min，晾干。
实验前一天将含2-3×10^4细胞的单细胞悬液铺种在放有盖玻片的十二孔盘中一个孔中（要保证有单个细胞）。
每个条件做两个复孔，待细胞贴壁12~24h后，用于实验分析；3. 固定用PBS洗涤细胞3 次(注意免疫荧光所用的PBS，均为常温的)，吸干，4%的PFA 1ml/ 孔于室温固定10min ；4. 防淬灭吸出PFA ，注意不能使细胞干燥，用PBS 洗3 次，加入1ml 的50mM 氯化铵于室温孵育10min，吸出氯化铵，PBS 洗3 遍，2-3min/次；(此步可省略)5. 通透加入1ml 的0.1%Triton X-100，10min，吸出Triton，用PBS 洗3 次，2-3min/次；6. 封闭加入1ml 3%的BSA（PBS配）封闭，室温1h，可在摇床上晃动，吸出BSA ，用PBS 洗10min；7. 一抗一般稀释比例为1：200-1：500，将抗体（BSA配；双染各加20μl ，单染加40μl ）加到封口膜上，将盖玻片从十二孔盘中取出，吸干多余的水分，有细胞的一面接触抗体，室温>1h 或4°C 过夜（效果好），将玻片重新放回到十二孔板中，有细胞的一面朝上，用PBS 洗4 次，10min/次；8.二抗稀释比例一般为1：400（BSA配），操作同一抗，避光室温反应1h, 将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS 洗3 次，10min/ 次；9. DAPI染细胞核一般浓度为1μg/ml，每个盖玻片需20ul ，操作同一抗，避光于室温反应10min，将玻片重新放回到用锡纸包裹的十二孔盘中，有细胞的一面朝上，PBS 洗3 次，10min/ 次；10.封片把封片剂（mowoil）滴在载玻片上，每片15μl，将有细胞的面朝下，勿有气泡。
活细胞免疫荧光染色实验步骤
活细胞免疫荧光染色实验步骤
活细胞免疫荧光染色实验步骤如下：
1.细胞培养：在无菌条件下，将细胞种植在适宜的培养基中，进行细胞培
养。
2.固定：在适宜的时机，弃去培养基，用冷的PBS清洗两次，然后使用适当
的固定剂（如4%多聚甲醛）进行固定。
3.透膜处理：在固定后的细胞中加入0.1% Triton X-100的PBS进行透膜处
理，以使荧光染料能够进入细胞。
4.抗体孵育：根据实验需求，选择适当的特异性抗体，加入细胞中，室温孵
育一定时间，使抗体与细胞内的目标蛋白结合。
5.洗涤：在抗体孵育后，用PBS洗涤细胞，以去除未结合的抗体和其他杂
质。
6.荧光标记：选择适当的荧光染料标记二抗，加入细胞中，室温孵育一定时
间，使二抗与结合的特异性抗体结合。
7.洗涤：再次用PBS洗涤细胞，以去除未结合的荧光染料和其他杂质。
8.观察：在荧光显微镜下观察染色后的细胞，观察目标蛋白的分布和定位情
况。
请注意，具体的实验步骤可能因不同的实验需求和条件而有所差异。
在进行实验前，建议仔细阅读相关文献和实验指南，以确保实验的准确性和可行性。
免疫荧光技术
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS （1：1）。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物；（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物；（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red （红）。
2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。
5、其余事项同免疫荧光单标操作。
免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化：不同的是1 免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同2 免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定3 二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS （1：1）5 条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久6荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光87荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照注意事项1. 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色实验步骤1.标本固定：将所需分析的细胞、组织或细胞培养物固定在载玻片上，常用的固定方法有：乙醛、甲醛、乙酸醋酸洗等。
固定时间视具体对象而定，一般为10-30分钟。
2.细胞透膜处理：对于细胞，需进行细胞透膜处理，常用方法有：冷冻切片、石蜡包埋切片、异丙醇造液切片等。
其中，冷冻切片方法操作简单，适用于原代组织、生物样品等。
3.抗原解膜：将标本解膜以增强抗原表面表达，使其易于与抗体结合。
常用方法有：酸性解膜（如：使用0.01M蛋白酶K）、热解膜（如：使用高温蒸气）等。
解膜时间和条件因抗原种类、标本类型而异。
4.阻断非特异性蛋白质结合：使用蛋白质阻断剂（如：牛血清白蛋白、小鼠胶原蛋白等）对标本进行阻断，以防止非特异性蛋白质与抗体结合。
阻断剂的浓度和时间视实验要求而定，一般为30分钟。
5.抗体结合：将与目标抗原相关的特异性一抗加入到试管中，与待检样本中的抗原结合。
一抗的浓度和孵育时间需进行优化，一般为1-2小时。
6.清洗：使用缓冲液对载玻片或试管中的非结合抗体进行清洗，以去除非特异性、非结合的一抗。
常用的缓冲液有：PBS、TBS等。
7.二抗结合：加入特异性的荧光标记的二抗（如：荧光染料标记的抗小鼠IgG）与一抗结合。
二抗的浓度和孵育时间需进行优化，通常与一抗相同。
8.清洗：重复第6步骤，去除非结合的二抗。
9.盖玻片：将载玻片或切片用透明胶带盖住，以防止样本干燥。
10.显微镜观察：用荧光显微镜观察载玻片，记录目标抗原的荧光信号分布。
除了以上的步骤，还有一些增强免疫信号的步骤可选用，如增强素方法，例如亲和素-酶联生物素-生物素-(酶)染色。
总结：免疫荧光染色实验步骤齐全且繁多，每一步骤的条件、孵育时间和浓度等都需进行优化和调整。
实验者应根据实验目的、所用抗体和标本的特性，进行合理的实验设计和优化操作，确保得到准确可靠的实验结果。
冰冻切片漂片
免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃；5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6.DAB配方为：10mgDAB固体加到20ml0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。
7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。
一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。
8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。
干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。
9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。
如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。
免疫荧光步骤及注意事项：1，将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3，然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48或72小时；5，然后，PBS洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。
免疫荧光步骤注意事项
（一）免疫组化组织细胞的固定凡需进行病理研究的标本均需进行固定。
将组织置于某些化学试剂中，使细胞内的物质免疫组织化学实验技术及应用尽量接近于其生活状态时的形态结构和位置称为固定。
而用于免疫组化研究标本的固定不仅是使细胞内的蛋白质凝固，终止或减少外源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更重要的是保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。
不同的抗原，其抗原稳定性不同，依抗原耐受固定液的程度可分为：①不稳定性抗原，如T淋巴细胞表面抗原属此类抗原，一般以冰冻切片进行免疫组化染色；②半稳定性抗原，如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等；③较稳定抗原，例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S—100、Keratin和部分多肽类激素等，其抗原性受固定剂种类、固定时间、温度等影响不大。
固定剂的种类很多，性能不一，因此固定不同的组织应选择合适的固定剂，特别是标记半稳定抗原时，更要选择合适的固定剂和固定条件。
固定液的种类较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织内部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定硬度，有较好的折光率。
固定液分为简单固定液和混合固定液。
因目前大多数固定液都是有毒有机溶剂组成，欧美国家已不再使用，基本由环保组织固定液替代。
西奈山环保组织固定液由植物多糖、乙醇、醋组成，固定效果明显优于常规甲醛。
固定的方法1．浸泡法这是最常用的固定法，将取好的组织直接浸泡在固定液中，固定的时间一般在2～24h它适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。
2．蒸气法比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。
主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。
具体方法：在一有盖培养皿内滴人1％一2％锇酸水溶液3滴，将涂片放人其中，固定30s至lmin左右，立即水洗后进行染色。
3.注射、灌注固定法主要适用于动物实验标本的固定。
将固定液注入血管，以达到充分的固定。
免疫荧光层析注意事项
免疫荧光层析注意事项免疫荧光层析（immunofluorescence assay, IF）是一种常用的实验技术，用于检测、鉴定和定量抗体、抗原或其他生物分子的存在和相互作用。
它结合了抗体特异性、荧光标记和层析技术的优势，可用于检测广泛的生物分子，例如蛋白质、多肽、糖类和核酸等。
然而，这种检测技术涉及到多个步骤，需要仔细执行和控制各种实验条件，以确保准确、可靠的结果，下面我们将介绍免疫荧光层析实验的注意事项。
1. 样品质量和处理在开始免疫荧光层析实验前，需要确保待测样品的质量和纯度。
样品的来源可以是生物样本、细胞培养物或纯化的蛋白质等，需要根据实验需要选择合适的样品，并进行相应的处理和纯化。
例如，可以通过离心、柱层析、凝胶电泳等技术来去除杂质、分离目标分子。
此外，为保持样品稳定性和活性，通常需要加入一些添加剂，例如保护剂、酶抑制剂、牛血清蛋白等。
但是，添加剂也可能影响实验结果，应根据不同实验需求进行优化和控制。
2. 抗体和荧光探针选择在免疫荧光层析实验中，选择合适的抗体和荧光探针是十分关键的。
抗体应具有高亲和力、特异性和稳定性，以免在实验过程中出现误差。
重要的是要记住，多个抗体的特异叉反应可能会导致实验结果的偏差。
荧光探针应有强荧光信号、稳定性和光稳定性，以提高检测灵敏度和精度。
常见的荧光探针包括荧光素、二甲基吡啶等可以挑选出荧光性质相适应的探针。
3. 样品处理和层析步骤在样品处理和层析步骤中，需要注意反应体系的选择和控制。
一般来说，反应体系应包括样品、抗体和荧光探针，并在合适的条件下进行反应。
避免反应体系中存在的污染物和杂质会导致实验结果的偏差。
此外，酸碱度、离子强度和温度等条件也对实验结果产生显著的影响。
因此，必须在样品处理和层析步骤中保持稳定的实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
4. 数据分析和质量控制在免疫荧光层析实验完成后，需要进行数据分析和质量控制。
数据分析可以通过光谱仪或荧光显微镜等工具进行。
免疫荧光总结步骤
免疫荧光总结步骤免疫荧光是一种广泛应用于生物学，医学和免疫学研究中的技术。
它利用免疫学原理和荧光色素来检测和定量分析对特定抗原具有特异反应的抗体。
以下是免疫荧光实验的基本步骤的总结，包括标本处理，抗体染色，显微镜观察和数据分析等。
1.标本处理：免疫荧光实验的第一步是准备样本。
这可能涉及到对细胞、组织、流体或血液样品进行处理，以获得要检测的目标抗原。
处理方法根据实验的目的和样本的性质而不同。
例如，对于细胞和组织样品，可以使用固定剂或冰冻剂来固定或保存目标抗原。
2.抗体染色：染色是免疫荧光实验中的关键步骤。
要进行染色，请使用已知与目标抗原结合的抗体。
这些抗体可以通过购买商业化的荧光标记抗体或自己标记的可溶性抗体。
抗体可以选择单克隆抗体或多克隆抗体，具体取决于实验的需要。
3.抗体交联：为了增强信号的强度和稳定性，必须进行抗体交联。
这意味着将荧光染料链接到抗体上，使其能够与目标抗原结合并发光。
通过选择适当的荧光标记剂和进行适当的染色条件，可以实现高灵敏度和特异性的检测。
4.样品处理：在进行显微镜观察之前，必须对样品进行适当的处理。
这可能包括去除非特异性背景信号，如细胞的内部自动荧光，以及对细胞进行固定或渗透处理，以使抗体能够进入细胞内部。
5.显微镜观察：准备好的样品被放置在显微镜载玻片上，并使用荧光显微镜观察。
荧光显微镜能够通过特定的荧光滤光片选择性地激发荧光标记染料，并观察其发射。
通过调整显微镜的焦距和放大倍数，可以获得目标抗原的高质量图像。
6.图像采集和分析：观察到的图像应该被摄取下来，并使用图像分析软件进行定量分析。
可以测量目标抗原的信号强度、定位和数量，并与对照组进行比较。
一些常用的图像分析软件还具有进一步处理和建模的功能，以获得更详细和精确的数据。
7.数据解释：最后，通过分析和解释数据来得出结论。
抗原的定量结果可以与其他实验结果进行比较，并根据研究的目的得出相关结论。
如果需要，可以使用统计学方法对数据进行进一步分析。
免疫荧光技术操作步骤
免疫荧光技术操作步骤 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT免疫荧光技术操作步骤一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L，荧光标记的抗体溶液：以 L，的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 L，的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加 L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 L，的 PBS 冲洗后，再按顺序过 L，的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。
染色温度多采用室温（25℃左右），高于 37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用 0-2℃的低温，延长染色时间。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；• 2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min•抗体染色：C孵育30min；︒–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37• 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
•缓冲甘油封片–分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
•镜检：在荧光显微镜下观察。
•优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
直接免疫荧光法的注意事项μ•对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；•一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；–染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；C的低温，延长染色时间。
︒C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2︒C)，高于37︒–染色温度：多采用室温(25C 30 min效果好的多。
︒–低温染色过夜较37•试验时需设置下列对照：–自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
•若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
•一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；•经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
之阳早格格创做正在共一构造细胞标本上需要共时检测二种抗本时，需举止单沉荧光染色.单沉免疫荧光标记表记标帜法(double immunofluorescence labeling method)也分为间接法战间接法.(1)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：将标记表记标帜有二种分歧荧光素的抗体(如抗A战抗B)以适合比率混同，滴加正在标本上孵育，而后洗去已分离的荧光抗体，正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，即可对于二种抗本举止定位战定量.间接法简即稳当，然而敏捷度较矮.(2)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：用已标记表记标帜的二种特同性第一抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第一抗体后，再用二种分歧的荧光素分别标记表记标帜的第二抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第二抗体，后正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，进而对于二种抗本举止定位战定量.使用此法应注意二种特同性第一抗体必须根源于分歧种属，且荧光标记表记标帜第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光单标技能中支配重心战注意事项一、免疫荧光技能中标本创造的基础步调近似于酶免疫组化，分歧面如下： 1、免疫荧光不需要使用单氧火处理，启关战一抗孵育与其相共. 2、免疫荧光的二抗使用分歧荧光标记表记标帜的二抗孵育，孵育时间根据抗体的处事浓度决定. 3、二抗孵育之后充分洗片后即可揭片、启片战瞅察. 4、免疫荧光正在启片常常使用博用启片剂或者苦油：0.01M PBS (1：1).条件许可，提议买买抗淬灭的启片液，使标本不妨保存更暂. 5、荧光抗体的孵育以及后绝处理需要躲光. 6、荧光抗体染色假阳性大概会多，需要分别设定阳性战阳性对于照.二、注意事项 1、荧光染色后普遍正在1h内完毕瞅察，或者于4℃保存4h，时间过少，大概会使荧光提前出落. 2、屡屡考查均需树立以下三种对于照：(1) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (2) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (3) 荧光标记表记标帜物对于照：PBS+荧光标记表记标帜物.三、免疫荧光单目标体味之道 1、采用一抗时，央供根源于二种分歧的动物，尔用的是根源于家兔战大鼠的抗体，二抗则是分歧荧光旗号标记表记标帜的，尔用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)战donkey anti-rat-Tex-Red(黑). 2、尔的干法是二种一抗共时孵育，而后二种二抗共时孵育.抗体浓度、孵育时间要自尔摸索，尔感觉一抗4℃孵育过夜比较佳，背景比较浑晰. 3、尔的阳性对于照采与的是阳性构造切片，阳性对于照则分别是家兔战大鼠的IgG，荧光标记表记标帜物对于照是PBS+荧光标记表记标帜物. 4、启关血浑是二抗根源动物的平常血浑，尔用的是10%平常donkey血浑. 5、其余事项共免疫荧光单标支配.免疫组化单沉染色要领战步调正在死物医教战临床钻研考查中，常常需要检测二种分歧物量是可正在共一般品中共存或者共一种细胞中共存，果此出现了免疫构造化教单沉染色.此要领有几种典型，包罗免疫酶构造化教战免疫荧光细胞化教法分离;共十足片的再度染色法(先对于第一种抗本染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗本抗体解离，继之，对于第二种抗本染色、拍照);二种酶标抗体3又沉染色(分别用辣根过氧化物酶战碱性磷酸酶标记表记标帜第二抗体.用间接法分别隐现A战B抗本，如二种一抗去自共一种属，常有沉叠染色);分歧种属根源的抗体单沉染色.暂时，最常常使用的是末尾一种要领.分歧种属根源的抗体单沉染色，二种抗体间无接又反应.特同性较下，纵然细胞内抗本量很少也能检测.然而是，当二种抗本存留于共一部位而其中之一浓度较下，占千万于劣势时将妨碍另一种抗本染色，此种情况应分别染色，最先染色含量较少的抗本，再隐现含量歉富的抗本.正在该要领中应用最多的是把SABC法或者SP 法的真验过程沉复二次，其中二种分歧特同性抗体(不妨是小鼠或者大鼠单克隆抗体战兔多克隆抗体的所有二个拉拢)，与一抗对于应的分歧种属死物素化二抗战二种分歧隐色系统.即可将分歧部位或者相共部位的二种抗本隐现出去.该要领用于石蜡切片时应试虑所采用的二个抗体的建复要领该当普遍或者一个抗体的建复对于另一个抗体的染色截止不做用.SP法单沉染色步调1～6步调与SABC法相共，然而无需使用死物素阻断剂：7.切片加进A特同性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS浑洗3次，屡屡5分钟8.滴加死物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，既而PBS浑洗3次，屡屡5分钟;9.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟10.碱性磷酸酶隐色液(BCIP/NBT)隐色(紫蓝色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟;11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可预防已隐色的抗本褪色);12.滴加抗小鼠二抗共种属的非免疫血浑，37~C孵育10分钟;13.滴加B特同性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育.PBS浑洗3次，屡屡5分钟;14.滴加死物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟.PBS浑洗3次，屡屡5分钟：15.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟16.过氧化物酶隐色液(AEC)隐色(陈黑色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟17.苏木粗复染细胞核;18.火溶性启片剂启片. 正在使用SP法单沉染色之前需要对于待测抗本的本量、二抗的种属典型战隐色系统举止仔细安排.买买免疫组化单染试剂盒时;应采用与安排规划相共的配套试剂.正在采用一抗时应预防定位正在细胞的共一部位(如胞核、胞浆战胞膜)的二种抗本，如果不可预防，最佳采用免疫荧光构造细胞化教单沉染色要领，果为二种分歧颜色的荧光沉叠后浮现另一种颜色的荧光(如黑色荧光与绿色荧光沉叠浮现黄色荧光)，它比SP法的隐色系统更简单辨别战辨别阳性截止. 正在举止单沉染色之前，必须对于所采用的一抗分别举止单独染色预真验，预真验条件必须与单染条件相共，正在瞅察预真验截止战抗体定位粗确后，再举止单染真验.。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
紫外光激发荧光物质放射荧光示意图
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。
这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。
固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。
免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。
最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。
总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：
（1）细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（2）固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
PBS洗涤3×5 min.
（3）通透。
使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。
通透的时间一般在
5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.
（4）封闭。
使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.
（5）一抗结合。
室温孵育1h或者4℃过夜。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min.
（6）二抗结合。
间接免疫荧光需要使用二抗。
室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7）封片及检测。
滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
（一）细胞准备
用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。
贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。
少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（二）固定和通透
除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。
固定的目的有三：
①防止细胞从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；③使标本易于保存。
标本的固定原则是：
①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③应保持细胞和亚细胞结构；
④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。
通常固定方法可以分为两类：有机溶剂和交联剂。
有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。
交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。
交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但因为交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。
两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。
最常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇，少数情况也使用乙醇，丙酮及戊二醛等进行固定。
通常，细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果，而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。
细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。
通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。
但是，如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透。
相反，如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。
丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。
甲醇同样具有通透作用，但有些场合并不适合用甲醇，因为一些表位对甲醇非常敏感。
常用的通透剂是去垢剂，如Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。
Triton 和NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。
但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。
Triton X-100是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原。
后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。
适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定，这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。
固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（三）封闭
封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常用的封闭剂为1% BSA, PBS pH 7.5,其他可选择的封闭剂还有 1% gelatin, 1%bovine 或与二抗种属相同的血清（3-10%）等。
（四）抗体孵育
直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。
此外，为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
（五）封片及荧光观察
标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察，特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。
但在绝大多数情况下，为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，需作封片处理。
常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂。
（六）标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。
因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。
由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现，荧光标记的标本可以在低温（4℃或-20℃）下保存相当长的时间。
在某些情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，比如固定标本片后低温保存，在需要时再进行荧光标记，即随用随染。