一种从水培拟南芥中提取花青素的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710585941.X
(22)申请日 2017.07.18
(71)申请人 中国科学院南京土壤研究所
地址 211300 江苏省南京市高淳区古檀大
道1号开发区管委会
(72)发明人 沈仁芳　赵旭升　朱晓芳　吴启　
(74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限
公司 32200
代理人 唐循文
(51)Int.Cl.
C07D 311/62(2006.01)
(54)发明名称
一种从水培拟南芥中提取花青素的方法
(57)摘要
一种从水培拟南芥中提取花青素的方法，其
特征在于该方法以拟南芥为提取材料，通过施加
养分胁迫提高茎叶中的花青素含量，茎叶样品经
液氮破碎，并用稀硫酸溶液提取，再通过阴离子
交换树脂从而浓缩在甲醇中。

本发明通过施加养
分胁迫的方法，大大提高了拟南芥中的花青素含
量，使得我们能充分利用拟南芥生长周期短、适
于室内水培等优点，为花青素的提取提供了一种
新的选择；用稀硫酸溶液能充分提取出拟南芥中
的花青素，同时免除了茎叶中叶绿素的干扰；拟
南芥培养及花青素提取工艺操作简单，耗费较
少，
无有害物质残留。

权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 107459504 A 2017.12.12
C N 107459504
A
1.一种从水培拟南芥中提取花青素的方法，其特征在于该方法以拟南芥为提取材料，通过施加养分胁迫提高茎叶中的花青素含量，茎叶样品经液氮破碎，并用稀硫酸溶液提取，再通过阴离子交换树脂从而浓缩在甲醇中。

2.根据权利要求1所述一种从水培拟南芥中提取花青素的方法，其特征在于具体步骤为：
（1）拟南芥培养：播种后，将拟南芥先用全营养液培养4-6周，再转移至去离子水中培养，然后剪取茎叶样品，用作提取花青素；
（2）花青素的粗提取：称取拟南芥茎叶，置于研钵中，加入液氮充分研磨；然后加入1-5mol/L的稀H 2SO 4溶液，用钵杵研匀后，再用去离子水将其全部洗入离心管中；静置后离心，将上清液用定量滤纸过滤，滤液收集在新的离心管中；
（3）花青素的精制：向滤液中加入过量的CaCl 2溶液去除硫酸根，混匀后静置，接着离心，将上清液用定量滤纸过滤，并收集在新的离心管中；然后将滤液通过阴离子交换树脂，并用甲醇洗脱；最后将洗脱液旋干，再用甲醇溶解，最后用氮气吹干，即得精制的花青素。

3.根据权利要求2所述一种从水培拟南芥中提取花青素的方法，其特征在于所述拟南芥培养步骤中，转移至去离子水中的培养时间为1周。

4.根据权利要求2所述一种从水培拟南芥中提取花青素的方法，其特征在于所述硫酸溶液与茎叶的体积质量比为100μL/g。

5.根据权利要求2所述一种从水培拟南芥中提取花青素的方法，其特征在于所述花青素的粗提取步骤中，静置时间为2-48h，离心条件为4100g下5min。

6.根据权利要求2所述一种从水培拟南芥中提取花青素的方法，其特征在于所述花青素的精制步骤中，静置时间为1h，离心条件为4100g下5min。

7.根据权利要求2所述一种从水培拟南芥中提取花青素的方法，其特征在于所述花青素的精制步骤中阴离子交换树脂为Amberlite ® IRA402 chloride form。

8.根据权利要求2所述一种从水培拟南芥中提取花青素的方法，其特征在于所述花青素的精制步骤中旋干条件为40℃、50hPa。

权　利　要　求　书1/1页CN 107459504 A
一种从水培拟南芥中提取花青素的方法
技术领域
[0001]本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种从水培拟南芥中提取花青素的方法。

背景技术
[0002]花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，作为一种重要的类黄酮物质，受到了食品、药物及保健产业的持续关注。

因为在食品及药物的着色过程中，花青素作为无毒的天然色素，有着替代合成染料的潜在应用价值。

另外，由于具有抗氧化和抗癌活性等有益人类健康的特性，花青素正被越来越多地被应用在保健品中。

[0003]花青素广泛分布在植物的根、茎、叶、花和果实等器官中，是植物形态建成过程中或响应逆境而产生的一种次生代谢物质，在植物生长过程中起重要作用。

紫甘蓝、蓝莓中的花青素含量比较高，是良好的花青素提取材料，相关的提取方法也有很多。

而对模式植物-拟南芥的关注则很少，这是由于在正常生长条件下，拟南芥中只能合成少量的花青素，开发提取的价值不明显。

[0004]拟南芥(Arabidopsis thaliana)与白菜、油菜、甘蓝等经济作物同属十字花科，其本身并无明显的经济价值。

而由于拟南芥具有植株较小、生长周期短、结实多、基因组小等优良特性，使其成为了全球应用最广泛的模式植物。

花青素生物合成受内外环境因素的影响较大，如:温度、光、糖、胁迫以及植物激素等都影响花青素的合成。

因此，可以通过施加养分胁迫等逆境条件，使原本正常生长拟南芥幼苗产生大量的花青素。

发明内容
[0005]解决的技术问题：本发明提供一种从水培拟南芥中提取花青素的方法，该提取工艺操作简单，耗费较少，无有害物质残留。

[0006]技术方案：一种从水培拟南芥中提取花青素的方法，该方法以拟南芥为提取材料，通过施加养分胁迫提高茎叶中的花青素含量，茎叶样品经液氮破碎，并用稀硫酸溶液提取，再通过阴离子交换树脂从而浓缩在甲醇中。

[0007]具体步骤为：(1)拟南芥培养：播种后，将拟南芥先用全营养液培养4-6周，再转移至去离子水中培养，然后剪取茎叶样品，用作提取花青素；(2)花青素的粗提取：称取拟南芥茎叶，置于研钵中，加入液氮充分研磨；然后加入1-5mol/L的稀H2SO4溶液，用钵杵研匀后，再用去离子水将其全部洗入离心管中；静置后离心，将上清液用定量滤纸过滤，滤液收集在新的离心管中；(3)花青素的精制：向滤液中加入过量的CaCl2溶液去除硫酸根，混匀后静置，接着离心，将上清液用定量滤纸过滤，并收集在新的离心管中；然后将滤液通过阴离子交换树脂，并用甲醇洗脱；最后将洗脱液旋干，再用甲醇溶解，最后用氮气吹干，即得精制的花青素。

[0008]优选的，上述拟南芥培养步骤中，转移至去离子水中的培养时间为1周。

[0009]优选的，上述硫酸溶液与茎叶的体积质量比为100μL/g。

[0010]优选的，上述花青素的粗提取步骤中，静置时间为2-48h，离心条件为4100g下5min。

[0011]优选的，上述花青素的精制步骤中，静置时间为1h，离心条件为4100g下5min。

[0012]优选的，上述花青素的精制步骤中阴离子交换树脂为IRA402chloride form。

[0013]优选的，上述花青素的精制步骤中旋干条件为40℃、50hPa。

[0014]有益效果：本发明通过施加养分胁迫的方法，大大提高了拟南芥中的花青素含量，使得我们能充分利用拟南芥生长周期短、适于室内水培等优点，为花青素的提取提供了一种新的选择；用稀硫酸溶液能充分提取出拟南芥中的花青素，同时免除了茎叶中叶绿素的干扰；拟南芥培养及花青素提取工艺操作简单，耗费较少，无有害物质残留。

附图说明
[0015]图1为不同营养液浓度对拟南芥茎叶中花青素含量的影响图；
[0016]图2为不同硫酸浓度对花青素提取效果的影响图；
[0017]图3为不同浸提时间对花青素提取效果的影响图。

具体实施方式
[0018](1)将饱满的拟南芥野生型(Col-0)种子，点播在吸满全营养液的海绵上，在人工气候室中发芽、生长。

用全营养液培养4-6周后，将拟南芥幼苗转移到去离子水中生长一周，然后剪取茎叶样品，用来提取花青素。

[0019](2)气候室中的温度保持在22-24℃，每天的光照/黑暗时间为18h/6h，光照强度为100μmol m-2S-1。

所用到的全营养液pH值为5.6，养分组成如下：
[0020]
[0021]
[0022](3)称取拟南芥茎叶，置于研钵中，加入液氮充分研磨。

然后加入1-5mol/L的稀H2SO4溶液(100μL/g茎叶)，用钵杵研匀后，再用去离子水将其全部洗入离心管中。

静置2-48h 后，在4100g下离心5min，将上清液用定量滤纸过滤，滤液收集在新的离心管中。

[0023](4)向滤液中加入过量的CaCl2溶液去除硫酸根，混匀后静置1h。

接着在4100g下离心5min，将上清液再次用定量滤纸过滤，并收集在新的离心管中。

然后将滤液通过阴离子交换树脂(IRA402 chloride form)，并用甲醇洗脱。

最后将洗脱液在40℃、50hPa 的条件下旋干，再用少量甲醇溶解，然后用氮气吹干，即得精制的花青素。

[0024]实施例1
[0025](1)将饱满的拟南芥野生型(Col-0)种子，点播在吸满全营养液的海绵上，在人工气候室中发芽、生长。

用全营养液培养五周后，将大小一致的幼苗，分别转移到含量为0、
1％、10％、100％的营养液中生长。

7天后剪取茎叶样品，用来提取花青素。

[0026](3)称取约2克的拟南芥茎叶，放在直径60mm的研钵中，加入液氮充分研磨。

然后加入0.4mL 3mol/L的H2SO4溶液，用钵杵研匀后，再用7.6mL去离子水将其全部洗入10mL离心管中。

静置过夜后，在4100g下离心5min，将上清液用定量滤纸过滤，滤液收集在新的10mL离心管中。

[0027](4)吸取滤液，用分光光度计测定530nm及657nm下的吸光值。

花青素相对含量用(A530–0.25A657)/样品重量表示，测定结果如图1所示。

[0028](5)向滤液中加入过量的CaCl2溶液去除硫酸根，混匀后静置1h。

接着在4100g下离心5min，将上清液再次用定量滤纸过滤，并收集在新的离心管中。

然后将滤液通过阴离子交换树脂(IRA402 chloride form)，并用甲醇洗脱。

最后将洗脱液在40℃、50hPa 的条件下旋干，再用少量甲醇溶解，然后用氮气吹干，即得精制的花青素。

[0029]由图1可知，正常生长5周的拟南芥植株，在用纯水培养一周后，茎叶中花青素含量大幅提高，相对于继续正常培养一周的对照处理，花青素含量提高约30倍。

[0030]实施例2
[0031](1)将饱满的拟南芥野生型(Col-0)种子，点播在吸满全营养液的海绵上，在人工气候室中发芽、生长。

用全营养液培养五周后，将长势一致的幼苗，转移到去离子水中生长。

7天后剪取茎叶样品，用来提取花青素。

[0032](3)随机称取约2克的拟南芥茎叶，放在直径60mm的研钵中，加入液氮充分研磨。

然后分别加入0.4mL 0、1、2、3、4、5mol/L的H2SO4溶液，用钵杵研匀后，再用7.6mL去离子水将其全部洗入10mL离心管中。

静置过夜后，在4100g下离心5min，将上清液用定量滤纸过滤，滤液收集在新的10mL离心管中。

[0033](4)吸取滤液，用分光光度计测定530nm及657nm下的吸光值。

花青素相对含量用(A530–0.25A657)/样品重量表示，测定结果如图2所示。

[0034](5)向滤液中加入过量的CaCl2溶液去除硫酸根，混匀后静置1h。

接着在4100g下离心5min，将上清液再次用定量滤纸过滤，并收集在新的离心管中。

然后将滤液通过阴离子交换树脂(IRA402 chloride form)，并用甲醇洗脱。

最后将洗脱液在40℃、50hPa 的条件下旋干，再用少量甲醇溶解，然后用氮气吹干，即得精制的花青素。

[0035]由图2可知，相对于用去离子水提取拟南芥茎叶中的花青素，1-5mol/L的H2SO4溶液均能将花青素的提取效率提高约一倍。

但随着H2SO4溶液浓度的增加，提取效率并没有显著提高。

[0036]实施例3
[0037](1)将饱满的拟南芥野生型(Col-0)种子，点播在吸满全营养液的海绵上，在人工气候室中发芽、生长。

用全营养液培养五周后，将长势一致的幼苗，转移到去离子水中生长。

7天后剪取茎叶样品，用来提取花青素。

[0038](3)随机称取约2克的拟南芥茎叶，放在直径60mm的研钵中，加入液氮充分研磨。

然后分别加入0.4mL 3mol/L的H2SO4溶液，用钵杵研匀后，再用7.6mL去离子水将其全部洗入10mL离心管中。

分别静置0.5、1、2、4、8、16、24、48h后，在4100g下离心5min，将上清液用定量滤纸过滤，滤液收集在新的10mL离心管中。

[0039](4)吸取滤液，用分光光度计测定530nm及657nm下的吸光值。

花青素相对含量用
(A530–0.25A657)/样品重量表示，测定结果如图2所示。

[0040](5)向滤液中加入过量的CaCl2溶液，混匀后静置1h。

接着在4100g下离心5min，将上清液再次用定量滤纸过滤，并收集在新的离心管中。

然后将滤液通过阴离子交换树脂(
IRA402 chloride form)，并用甲醇洗脱。

最后将洗脱液在40℃、50hPa的条件下旋干，再用少量甲醇溶解，然后用氮气吹干，即得精制的花青素。

[0041]由图3可知，随着浸提时间的延长，从拟南芥茎叶中提取花青素的效率并没有显著提高。

[0042]以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

图1
图2
图3。