酵母蔗糖酶的提取工艺
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告一、实验目的本实验旨在学习酵母蔗糖酶的提取方法，并掌握其酶活力的测定方法。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种重要的生物催化剂，广泛应用于食品工业、医药工业等领域。
其提取方法主要包括细胞破碎法和超声波法。
细胞破碎法是将酵母细胞经过离心、洗涤后，在低温下使用高压均质机或超声波仪器进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
而超声波法则是将细胞悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
三、实验步骤1. 酵母菌体培养：将活性酵母菌体接种到含有10%蔗糖和0.5%酵母粉的液体培养基中，在30℃下静置48小时。
2. 细胞破碎：将培养好的菌体通过离心后洗涤两次，然后在低温下使用高压均质机进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
3. 超声波处理：将菌体悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
4. 酶活力测定：取一定量的提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，在37℃下反应30分钟后用硫酸铜试剂测定还原糖的含量。
四、实验结果通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，测得其酶活力分别为10.5 U/g和12.8 U/g。
五、实验分析1. 细胞破碎法和超声波法都可以用于酵母蔗糖酶的提取，但是超声波法更加快速、高效。
2. 酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意培养基成分和温度等因素。
3. 酵母蔗糖酶的测定方法可以采用硫酸铜法，但是也可以采用其他方法，如比色法和光度法等。
六、实验结论本实验通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，并测定了其酶活力。
结果表明，超声波法更加高效。
同时，酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意调整培养条件。
最后，硫酸铜法可以用于测定酵母蔗糖酶的活力。
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告酵母蔗糖酶的提取实验报告1. 引言酵母蔗糖酶是一种重要的酶，在许多生物过程中起着关键作用。
通过提取酵母蔗糖酶，我们可以深入了解其结构和功能，以及其在实际应用中的潜力。
本实验旨在通过一系列步骤，从酵母细胞中提取酵母蔗糖酶，并评估其活性和效果。
2. 方法和材料2.1 材料- 新鲜酵母菌浆液- 蒸馏水- 磷酸缓冲液- 蔗糖溶液- 高速冷离心机- 低速冷离心机- 离心管- 离心管架- 塑料吸管- 双室温度计- 分光光度计- 试管2.2 实验步骤步骤1：制备酵母酶提取液a) 将10ml新鲜酵母菌浆液倒入离心管中，并以1500rpm的速度在低温下离心10分钟。
b) 将上清液转移至另一个离心管中，再次进行高速离心，以去除细胞碎片。
步骤2：沉淀酵母蔗糖酶a) 将上一步中得到的上清液倒入一个含有7ml蔗糖溶液的试管中。
b) 在室温下孵育搅拌2小时，让酵母蔗糖酶与蔗糖结合形成沉淀。
c) 用低速离心将沉淀分离。
收集上清液备用。
步骤3：测定酵母蔗糖酶活性a) 在分光光度计中设置波长为540nm。
b) 取1ml上清液和1ml磷酸缓冲液混合，作为空白对照。
c) 另取1ml上清液和1ml含20%蔗糖溶液的试管中，作为实验组。
d) 在不同时间点（例如0、1、2、3、4分钟）测定两个试管的吸光度，并记录数据。
e) 计算酵母蔗糖酶的活性。
3. 结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地提取了酵母蔗糖酶，并可以测定其活性。
根据测定结果，我们观察到酵母蔗糖酶在一定时间范围内对蔗糖的降解表现出线性增加的趋势。
这表明酵母蔗糖酶在一定程度上具有稳定的催化作用。
通过本实验，我们还可以根据酵母蔗糖酶的活性表征其在不同条件下的稳定性、催化效率和适应性。
我们可以改变温度和pH值，观察对酵母蔗糖酶活性的影响，从而了解其最适宜的操作条件。
通过进一步的研究，我们还可以探索酵母蔗糖酶在生物制药、食品加工和能源生产等领域的应用潜力。
总结回顾：通过酵母蔗糖酶的提取实验，我们深入了解了酵母蔗糖酶的结构、功能和应用前景。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法酵母蔗糖酶是重要的糖分解酶，它可以被用来制造蔗糖、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物。
因此，它在化工、食品、制药行业中有着重要的应用价值。
本文介绍了从发酵酵母或发酵液中提取酵母蔗糖酶的方法。
一、原料准备首先，准备发酵酵母或发酵液。
发酵酵母可以使用乳酸乳杆菌培养基发酵培养，得到的酵母菌可以悬浮在一定的温度和 pH 下曝气发酵，以获得最大的效果。
发酵液可以采用蔗糖和氨基酸等制备，并需要调节合适的 pH温度，可以提高酶的活性。
二、提取酵母蔗糖酶1.发酵酵母或发酵液放入滤器，用中压过滤来滤出悬浮体；2.过滤得到的酵母蔗糖酶悬浮液中加入NaCl，来降低活性；3.溶液中的毛细管类蛋白分离出来，加入45%的乙醇萃取分离；4.溶液冷冻至冰点，冻干抽滤以获得纯化的蔗糖酶；5. 从冻干抽滤物中继续利用膜精制器以及离子交换柱等方式，将蔗糖酶高纯度分离出来；6.高纯度蔗糖酶经过适当稀释处理，可获得最终产品。
三、性能测试为了判定提取的酵母蔗糖酶的性能，需要进行一系列的性能测试，这些测试可以用来检测酶的活性、热稳定性、抗菌性以及稳定性等。
通过这些测试，可以确定提取的酵母蔗糖酶的性能，从而确保它能够满足采用的要求。
四、应用实践酵母蔗糖酶的提取方法在实际应用中几乎是必不可少的，它可以用来生产糖浆、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物等，常用于食品加工、精细化工、制药行业等。
此外，这种提取方法还可以应用于糖类合成、氨基酸修饰等方面，发挥着重要的作用。
综上所述，酵母蔗糖酶是一种重要的糖分解酶，用于生产糖类衍生物，它的提取方法包括发酵酵母或发酵液的原料准备、提取、性能测试以及应用实践等，是一项重要的工作。
只有抓住机会，把提取的酵母蔗糖酶用好，才能实现糖分解酶的高效利用。
实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化
实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化原理蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖⽔解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化⾮还原糖中的α—呋喃果糖苷键⽔解，具有相对专⼀性。
不仅能催化蔗糖⽔解⽣成葡萄糖和果糖，也能催化棉⼦糖⽔解，⽣成密⼆糖和果糖。
每⽔解1mol 蔗糖，就⽣成2mol 还原糖。
还原糖的测定有多种⽅法，本实验采⽤Nelson ⽐⾊法测定还原糖量，由此可得知蔗糖⽔解的速度。
在研究酶的性质、作⽤、反应动⼒学等问题时都需要使⽤⾼度纯化的酶制剂以避免⼲扰。
酶的提纯⼯作往往要求多种分离⽅法交替应⽤，才能得到较为满⾜的效果。
常⽤的提纯⽅法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离⼦交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋⽩在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能⾼的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。
啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。
本实验⽤新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，⼄醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进⾏测定。
⼀、蔗糖酶的提取与部分纯化（⼀）实验⽬的学习酶的提取和纯化⽅法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供⼀定量的蔗糖酶。
（⼆）实验原理（略）（三）实验仪器、材料及试剂仪器1. ⾼速冷冻离⼼机、恒温⽔浴箱、－20℃冰箱2. 电⼦天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯3. 离⼼管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒材料及试剂1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）2. ⽯英砂（海沙）、甲苯（使⽤前预冷到0℃以下）3. 95%⼄醇（预冷－20℃）、去离⼦⽔（使⽤前冷⾄4℃左右）4. Tris-HCl （pH7.3）缓冲液（四）操作步骤 1. 提取＋ H 2O 蔗糖酶O HH O（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离⼼10 min，除去⼤量⽔分。
酵母蔗糖酶的分离纯化
低温保持酶活性
蔗糖酶提取步骤
1.破碎细胞 10g左右的干酵母+20ml甲苯，研磨5分钟，加水
10-15ml，研磨5-10分钟，重复加水研磨，共加3 次水，离心12000rpm,4℃，5-10分钟。共分3层， 上层白色为甲苯及其抽提物，中间为水层(含酶)， 下层为细胞碎片沉淀(甲苯和水体积不用准确） 2.抽提(第一组分) 取中间水层于干净离心管，12000rpm, 4℃，510分钟，上清取出量体积并记为V1，然后留2ml保 存于冰上后面做检测，其余的样品（V1-2ml）继续 进行纯化
酵母蔗糖酶的分离纯化
生化技术综合系列实验(一)
原理
生物大分子 蛋白质 酶
生物大分子提取基本步骤
材料 破细胞
提取
检测
பைடு நூலகம்
纯化
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质， 可据酶蛋白的结构和性质选择分离提纯条件 和含量测定方法。
酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比 活力）及收率；依据在溶液中的性质（分子 大小、溶解度、电荷、吸附等）进行分离;
将留下的一、二、三组分样标记清楚后保存于-20 ℃ 冰箱中。
注意事项
1.低温 2.一、二、三组分的准确体积V1、V2、V3 3.标记 4.离心后弃、留 5.记录现象
3.热抽提(第二组分)
调pH约5.0(加5滴1M醋酸即可)，50℃，摇动或搅 拌20分钟，冰浴冷却3分钟， 12000rpm, 4℃，5-10 分钟，量取上清体积(V2)，留2ml保存于冰上检测。 其余样（V2-2ml)继续提纯。
4.乙醇沉淀(第三组分)
酵母蔗糖酶实验报告
一、实验目的1. 学习酵母蔗糖酶的提取方法。
2. 掌握酶活力测定的原理和方法。
3. 了解酶的专一性及其影响因素。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验通过提取酵母细胞中的蔗糖酶，并在一定条件下测定其活力，以了解其催化活性。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母粉2. 蔗糖3. 缓冲液4. 斐林试剂5. 旋光仪仪器：1. 电子天平2. 研钵3. 移液器4. 恒温水浴锅5. 烧杯6. 试管7. 离心机四、实验步骤1. 酵母蔗糖酶的提取- 称取适量酵母粉，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆。
- 将匀浆转移至离心管中，离心分离，收集上清液即为酵母蔗糖酶提取液。
2. 酶活力测定- 取适量提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，置于恒温水浴锅中保温。
- 定时取样，用斐林试剂检测反应液中的还原糖含量。
- 根据还原糖含量计算酶活力。
3. 酶的专一性实验- 将提取液分别与蔗糖、淀粉等底物反应，观察酶的催化活性。
- 对比实验结果，分析酶的专一性。
4. 影响酶活力的因素实验- 分别在酸性、中性、碱性条件下进行酶活力测定，观察pH对酶活力的影响。
- 分别在不同温度下进行酶活力测定，观察温度对酶活力的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定- 酵母蔗糖酶提取液在37℃、pH 6.8条件下，酶活力最高，约为0.5单位/毫升。
2. 酶的专一性实验- 酵母蔗糖酶对蔗糖具有特异性催化作用，而对淀粉无催化活性。
3. 影响酶活力的因素实验- 酶活力受pH和温度的影响较大。
在pH 6.8、37℃条件下，酶活力最高；在酸性或碱性条件下，酶活力明显降低；在低温条件下，酶活力较低。
六、实验结论1. 成功提取了酵母蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 酵母蔗糖酶具有特异性催化作用，对蔗糖具有高效催化活性。
3. 酶活力受pH和温度的影响较大，适宜的pH和温度有利于提高酶活力。
七、实验讨论1. 本实验中，酶活力的测定方法较为简单，但结果准确可靠。
浙江大学生物化学实验甲 酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析
酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于植物和微生物体内，专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶分子量约270000D，pI约5．0，最适pH4．6，耐酸和热，50℃保温30min 仍具有相当的活力，最适温度37℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提。
加热纯化。
乙醇分级沉淀。
纤维素柱层析分离纯化。
㈠、前三步分离纯化的原理如下：甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等取中层50水浴中使热不稳定蛋白变性上清：蔗糖酶、可溶性糖等（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等㈡、纤维素柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。
离子交换层析是一种液-固相层析技术。
其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。
在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE纤维素、强碱型的离子交换树脂等。
反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。
离子与交换剂的静电结合作用具如下特点：选择性：离子所带的电荷越多，离子半径越小，越易结合。
遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交换剂结合方向进行可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它）离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。
生化综合实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、蔗糖酶的制备1、提取称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀。
再于35℃恒温水浴中搅拌30min，然后补加30ml蒸馏水，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜。
之后，1000r/min离心10min，抽取酯层后再次离心，得到无细胞提取液。
用1M HCl将其PH调至5.0，即可得到级分Ⅰ。
（取出3ml于冰箱中保存）2、热处理（1）盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，1000r/min离心10min。
（3）上清液即为热级分Ⅱ。
（取出3ml于冰箱中保存）3、乙醇沉淀将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰浴，逐滴加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌（此过程共需30 min）。
然后在冰浴中静置10 min，以沉淀完全。
然后4℃，1000r/min离心10min。
倾去上清，并滴干。
将沉淀保存于离心管中，冷冻保存，此即级分Ⅲ。
二、蔗糖酶的纯化将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。
及洗脱峰图如下：三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定（一）还原糖含量测定1、各级分稀释倍数的确定级分Ⅰ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅱ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅲ：取50μl稀释至15ml（300倍）取20μl稀释至2ml（100倍）释100倍。
在上述表格中，Glu含量是由标准曲线求得的，E'=Glu含量*稀释倍数/（10 min*0.6 ml）Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数由洗脱峰可知，第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白（第一个峰一般情况下是杂蛋备注：由测定数据可知，第二个峰不是目标蛋白，第三个峰为目标蛋白。
（二）蛋白质含量测定1、各级分稀释倍数的确定由以上数据可知，级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释，级分Ⅲ需稀释5倍。
酵母蔗糖酶的分离提取
酵母蔗糖酶的分离提取作者：XX 指导老师：XX摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，即在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎再通过乙醇的分级与透析，得到纯化的酵母蔗糖酶。
本实验也通过考马斯亮蓝G250染色法，测定蔗糖酶的活力和蛋白质浓度，对蔗糖酶的性质进行了研究。
最后的纯化倍数为2.8倍，所得产率为36.85%。
关键词：蔗糖酶，分离提取，酶活力，蛋白质含量前言：蔗糖酶又称转化酶，可作用于β-1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
蔗糖酶在工业上用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，还用来制造含果糖和巧克力的软心糖等。
蔗糖酶在畜牧方面，可防治禽兽的疾病，促进幼龄禽兽的发育，节约饲料和提高肉产量等；在农业方面可防治植物病害、刺激植物生长、提高作物产量；在工业上可用作鱼、肉、蔬菜和水果等食品的保鲜剂，同时也在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用，并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。
目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。
本实验采用自溶法从酵母中分离提纯蔗糖酶，通过测定得到的蔗糖酶的活力及蛋白质的含量。
1.材料与方法1.1试剂酵母粉（实验室提供），醋酸钠(0.5g)，乙酸乙酯（8ml），10%醋酸，无水乙醇，1mol/LNaOH，蒸馏水，PH=4.7缓冲液，DNS试剂，0.9%NaCL，考马斯亮蓝G-250，系列标准蛋白液，150mol/L 磷酸等。
1.2器材离心机，722分光光度计，水浴锅，量筒25ml，烧杯100ml，大小试管若干，各种专用移液管，吸耳球，玻离棒，胶头滴管，PH试纸等。
1.3操作方法1．3.1蔗糖酶粗品制备方法(1)自溶法将5g酵母粉倒入500mL烧杯中、少量多次的加入15mL蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入0.5g乙酸钠、8mL乙酸乙酯，搅匀，盖好，于35℃恒温水浴中搅拌30min。
浙江大学生物化学实验甲 酵母蔗糖酶的制备、纯化步骤-离子交换
酵母蔗糖酶的制备一、酵母蔗糖酶的制备1.缓冲液抽提称取10克干酵母粉，加3克石英砂，于研钵中研磨约2分钟；再加30毫升0.02 mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液（以6毫升1份分次加），边加边研磨至成浆状，将匀浆转移到50ml 离心管中，于8000转/分离心20分钟，形成三层；用滴管插入取水层（中层）于50ml离心管中，于10000转/分离心10分钟，取上清到量筒中，量体积，记为F1。
留0.5毫升以测定酶活力和蛋白质含量（Fraction I），其余转入50ml离心管中用于加热纯化。
2. 加热纯化将上清液置于50℃水浴中保温30分钟，随时摇动；然后于冰—水浴中冷却，以10000转/分离心10分钟，取上清液到量筒中，量体积，记为F2。
留0.5毫升测酶活力及蛋白质含量（Fraction Ⅱ）。
其余用于醇分级分离。
3. 醇分级分离于上清液中加入等体积-20℃预冷的95%乙醇，冰上进行，慢慢滴加，边滴边摇（控制在6-8分钟加完）。
充分混匀后，于冰-水浴中放置20分钟；以10000转/分离心10分钟，取沉淀，用4-5毫升0.05mol/L、pH7.3的Tris-HCl缓冲液（含0.025mol/LNaCl）溶解沉淀，于10000转/分离心10分钟，取上清到量筒中量体积，记为F3。
留1毫升测酶活力及蛋白质含量（FractionⅢ），其余用于柱层析。
样品保存于冰箱中备用。
4.DEAE-Sepharose柱层析分离纯化柱规格：1×20（cm，直径）流速：3ml/10min上清（约3~4ml）加到DEAE-Sepharose柱上进一步分离纯化。
流速3ml/10min，洗脱液：0.02 mol/L pH7.4的Tris-HCl，在0～1mol/L NaCl下进行线性梯度洗脱，收集：3ml /管。
二、各步提取液蛋白质含量的测定1. 蛋白质含量标准曲线的制作项目试管号0 1 2 3 4 5蛋白质含量（μg）/ 50 100 150 200 250蛋白质标准液（ml）/ 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0无离子水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 /Follin酚甲液（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0充分混匀，于室温（20~25℃）放置10分钟Follin酚乙液（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5充分混匀，于30℃水浴保温30分钟OD650（nm）蛋白质标准液浓度：250ug/ml2. 各步提取液蛋白质含量测定(已预热到37℃)项 目 试管号空白 Fraction Ⅰ（1：10） Ⅱ（1：5） Ⅲ（1：2）1 2 3 4 5 6 7 稀释酶液（ml ） 0 0.1 0.2 0.1 0.2 0.1 0.2 无离子水（ml ） 1.0 0.9 0.8 0.9 0.8 0.9 0.8 Follin-酚甲液（ml ） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0充分混匀，于室温放置10分钟 Follin-酚乙液（ml ） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 充分混匀，于30℃水浴保温30分钟OD 650nm蛋白质含量（μg ） 平均值（μg ）提取液蛋白质总含量（mg ）三、各步提取液酶总活力及比活力测定1. 葡萄糖标准曲线的制作 项目 试管号0 12 3 4 5 6 8含糖量（）葡萄糖标准液（ml ） / 0.1 0.20.3 0.40.5 0.6 0.7无离子水（ml ） 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 DNS 试剂（ml ） 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8混匀，于100℃水浴中保温5分钟，取出经流动水冷却后，再加5ml 蒸馏水，混匀。
实验一 高压匀浆法破碎酵母细胞提取蔗糖酶
5．使用实验仪器时，应注意用电安全；实验仪器使用结束后，应 及时关闭电源。
6．严禁在实验室吸烟。 7．禁止在实验室用电炉或明火取暖。 8．实验时，应保持桌面的整洁不乱；实验结束后，应将自己的桌
面收拾干净方可离开实验室。
名称 MW
Km
pI
最适pH
(底物为蔗 (等电
糖)
点)
膜外酶 27万(22万) 26mM
5.0 (3.5～ 5.5)
最适温 度
60℃
膜内酶 13.5万 25mM
4.5 (3.5～ 60℃ 5.5)
注：pH 4.2-4.5最适温度：高浓度时60℃，低浓度时 45~50℃，80℃失活
pH 3.0 最适温度40℃以下 pH 5.0 最适温度40℃以下 pH 7.0 最适温度45℃以下
高速匀浆破碎的动力学方程为：
l 1 n 1S
k Pa Nb
细胞破碎率S与操作压力P和循环次数N之间的关系。
k为破碎速度常数
上述参数随微生物种类和培养条件的不同而有所差异
压力P可用动能表达：
l 1 n 1 S
k ( u2 )a N b
2
细胞破碎率用包内产物释放率表示：
三、操作步骤
1、称取32克活性酵母和60克蔗糖放入1000ml烧杯中，加入 300ml水于室温条件下活化2小时（课前活化，节省实验时 间），然后加入500ml冷却至10℃左右的去离子水，用玻璃 棒搅拌均匀，再用组织捣碎机打碎使其呈均匀状。（注意： 此用量为全班30组共用）
2、用高压匀浆机对酵母悬浮液进行细胞破壁。压力表设定为 560~600bar，循环操作3次。
实验三十八 (9)酵母蔗糖酶的提取
2、超声破碎法提取蔗糖酶(3组)
称取5 g酵母粉于小烧杯中，加入30 ml pH5.8的醋酸-醋 酸钠缓冲液用玻棒搅匀，在600W下处理，每工作3s停 3s（120个循环），形成菌体匀浆。此法的缺点是在处 理过程会产生大量的热，应在冰浴中进行。
破碎液摇匀后转入离心管，加10 ml 缓冲液洗涤烧杯后 并入离心管，8000 r/min离心10 min，取上清液，称为 “粗级分I”，测量其总体积V1，并留下5 ml用于蔗糖酶 活力测定。
酵母蔗糖酶的提取
实验原理
蔗糖酶属于水解酶，催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖 ，本实验选用蔗糖酶含量丰富的酵母为材料提取。
从酵母细胞提取纯化蔗糖酶时，首先需设计合理的 提取方法将酵母细胞破碎（机械法、物理法、化学 法、酶法 ），使蔗糖酶释放出来得到粗酶液；粗 酶含有大量杂质，通过粗分级（沉淀技术、膜分离 技术）可以有效的除去大量的杂质并使酶蛋白得到 浓缩。
（3）酶活力测定
• 取5 ml 5%蔗糖溶液于试管，共加两管，于25℃水浴保温5min， 向其中一管加入蔗糖酶溶液1.0 ml，立即混匀并计时，准确反 应5min后，加入5.0 ml 0.1mol/L NaOH溶液终止酶反应。另一 对照管先加入5.0 ml 0.1 mol/L NaOH溶液，再加入蔗糖酶溶液 1.0 ml。 • 取比色管3支，第l、2支管分别加入上述反应液各1.0 ml及水各 1.0 ml，第3管加蒸馏水2.0 ml，然后各管均加3.0 ml DNS试剂。 置于沸水浴中5 min，取出后用自来水冷却3 min，加蒸馏水至 25 ml，混匀。以第3管调零点，测A520nm。以测定管的A520nm 值减去对照管A520nm值，求得的差值代入标准曲线上得到相应 的还原糖含量，求出各个粗级分的酶活力。 • 一个蔗糖酶活力单位定义为在上述条件下，每分钟催化底物 蔗糖水解产生1 mg还原糖所需的酶量。
实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
五、实验的主要仪器
1．冷冻离心机 2．研钵 3．恒温水浴箱 4．-20℃冰箱 5．梯度混合器 6．层析柱 (1×20cm)
六、实验操作流程
干酵母粉→加缓冲液研磨→离心→热处理→酒 精沉淀→离心→上清夜→上DEAE—Sepharose FF 柱→层析→活力检测
七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处
Hale Waihona Puke 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子 交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离 子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以 离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团 对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过 程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质 所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就 有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提 高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂 的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一 被洗脱下来，达到分离的目的。
DEAE-Sepharose F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液，其中含0.5mol/L NaCl。
酶活力检测：
取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖 （pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺 序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀， 置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。
酵母中蔗糖酶提取
实验酵母蔗糖酶的提取一、实验目的：1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。
2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级、透析和离子交换柱层析技术及分子筛层析技术。
3、学习独立设计实验应遵循的原则二、实验原理：蔗糖酶主要存在于酵母中，但工业上通常从酵母中制取。
酵母蔗糖酶系胞内酶，提取时细胞破碎或菌体自溶。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换和凝胶柱层析。
以此可得到较高纯度的酶。
细胞破壁的几种方法1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料。
5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。
有机溶剂沉淀法即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低溶质的溶解度使其沉淀被析出。
三、试剂：啤酒酵母、二氧化硅、甲苯（使用前预冷到0℃以下）、去离子水（使用前冷至4℃左右）、1mol / L 醋酸、95%乙醇四、仪器：研钵1个、离心管3个、3. 滴管3个、量筒50ml 1个、水浴锅1个、恒温水浴、烧杯100ml 2个、广泛pH试纸、高速冷冻离心机四、操作步骤：1. 提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
预先在冰箱中冷却20g干酵母和10g二氧化硅。
（2）将20g干酵母粉和10g二氧化硅，放入研钵中。
量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。
[生物学]酵母蔗糖酶的提取工艺
![[生物学]酵母蔗糖酶的提取工艺](https://img.taocdn.com/s3/m/98b79150680203d8cf2f242c.png)
酵母蔗糖酶的提取工艺摘要蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。
它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。
采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。
纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。
蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化Study on Purification of Invertase from YeastAbstractSucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms 实用文档of carbon and energy supplies in microorganism growth and development.This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast.The results of our study were followed:1、Purification of invertase from yeastThe specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%.2、Properties of sucrase实用文档The kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min.Key words : yeast;invertase;extraction;purification第一部分文献综述蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26）又称转化酶（Invertase），是将蔗糖水解成D-葡萄糖和D-果糖的ß-D-果糖苷酶的一种。
实验1 蔗糖酶的提取
你认为还有哪些方法可以运用？说说你的设想。
显示 桌面 .scf
下次实验
实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
预习参考资料
李建武等 生物化学实验原理和方法
北京大学出版社
赵永芳 生物化学技术原理及应用（第三版） 科学出版社
3、有机溶剂（乙醇）沉淀：
将热处理后的上清液逐滴加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温
和搅动混匀，至少放置20分钟，然后转移至两支50ml离心管中，两支离心管 平衡后，4℃，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰 箱保存，以备用于下周实验——实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶。 六、实验结果分析讨论
实验一 蔗糖酶的提取
一、实验目的和要求 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。
二、实验基本原理 1、酵母细胞破碎
细 机械法 胞 破 碎 的 常 用 方 法 非机械法
液体剪切法 超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法
固体剪切法
压力和研磨
物理法、化学渗透法、酶溶
本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把 蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。
2、蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进
行初步的提纯。 由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯
度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法摘要：采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶，经质量分数50%的乙醇分级沉淀、MonoQ阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。
比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究。
纯化的酶经等电聚焦测定，等电点为5.6，SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60kD。
以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013mol／L。
结果显示3种提取方法各有优劣，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中SDS抽提法的效率最高，加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。
可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值。
可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。
作者采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种不同的方法从酵母中提取蔗糖酶，将冻融法和SDS法提取的蔗糖酶进一步纯化，并对其基本性质进行了研究。
通过不同提取方法的比较，为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的下游技术开发，提供了实验依据。
1材料与方法1．1材料酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。
1．2主要化学试剂和仪器十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva公司提供；等电点标准品，Amersham公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。
UV一2201型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters650型高级蛋白纯化系统，Waters公司制造；PhastSystem全自动快速水平电泳仪，Amersham公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco公司制造；电泳仪，Bio-Rad公司制造；精密酸度计，Orion公司制造。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法李楠;庄苏星;丁益【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2007(026)004【摘要】采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶,经质量分数50%的乙醇分级沉淀、Mono Q阴离子交换柱层析纯化后,制得高纯度的酵母蔗糖酶.比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究.纯化的酶经等电聚焦测定,等电点为5.6,SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60 kD.以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013 mol/L.结果显示3种提取方法各有优劣,冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法.其中SDS抽提法的效率最高,加之其操作简便,更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取.【总页数】5页(P83-87)【作者】李楠;庄苏星;丁益【作者单位】南京大学,生命科学学院,医药生物技术国家重点实验室,江苏,南京,210093;南京大学,生命科学学院,医药生物技术国家重点实验室,江苏,南京,210093;南京大学,生命科学学院,医药生物技术国家重点实验室,江苏,南京,210093【正文语种】中文【中图分类】Q556.2;TS201.25【相关文献】1.超声破碎酵母细胞提取蔗糖酶条件优化 [J], 李聪;朱晓吉2.从啤酒酿造酵母中提取蔗糖酶及酶的性质研究 [J], 邹东恢;郭宏文3.人蔗糖酶卵黄抗体三种不同提取方法的比较 [J], 邵敏;王新颖;杜凤霞;冯昆;田忠;周鹤峰4.自制酵母蔗糖酶进行"酶的专一性"实验探究 [J], 夏天;李晖5.蛋白变性剂对酵母蔗糖酶及其修饰酶的催化活性影响及其作用分子机制 [J], 黎春怡;王丹菊;黄卓烈因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酵母蔗糖酶的提取工艺摘要蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。
它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。
采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS 抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。
纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。
蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化Study on Purification of Invertase from YeastAbstractSucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms of carbon and energy supplies in microorganism growth and development.This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast.The results of our study were followed:1、Purification of invertase from yeastThe specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%.2、Properties of sucraseThe kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min.Key words : yeast;invertase;extraction;purification第一部分文献综述蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26）又称转化酶（Invertase），是将蔗糖水解成D-葡萄糖和D-果糖的ß-D-果糖苷酶的一种。
除广泛分布于微生物、植物外，类似的活性也在动物的消化液中发现。
传统的酵母蔗糖酶的提取方法是甲苯自溶法，尽管此方法所用试剂简单、价格低廉，但由于其消耗时间长、重复性差、酶活性较低等缺陷，现已很少采用。
目前也有采用乙醇沉淀法和硫酸铵分级沉淀法制得的蔗糖酶，再用柱层析的方法提纯，由于柱层析工艺复杂，处于实验室探索研究阶段。
经查新，已见采用冻融法和SDS抽提法的文献报道。
文献说明，相对于甲苯自溶法，这两种方法提取的酶的活性要高出很多。
SDS抽提法对酵母蔗糖酶的提取效率比较高，是冻融法的2倍，但其中总蛋白量提取也较高，是冻融法的3倍，因此如果采用SDS法，对酵母蔗糖酶的纯化需要去除较多的杂蛋白本实验结合传统方法和新兴方法，寻找从经济和效率上最优的酵母蔗糖酶的提取工艺3.3图33.3.2图43.3.33.6.2 最适温度的测定在21℃～70℃范围内，设置一系列不同的温度梯度，分别测定各个温度梯度下蔗糖酶的活性，活性最高的温度即为蔗糖酶的最适温度。
表六3.6.3 蔗糖酶Km 及Vmax 的测定以蔗糖为底物，在最适条件下，分别设置不同的底物梯度，测定蔗糖酶催化蔗糖的反应速度，以1/[S]为横坐标，1/V 为纵坐标，按双倒数法作图，可以得到Lineweaver –Burk 双倒数直线方程，在1/V 纵轴的截距是1/Vmax,在1/[S]横轴上的截距是-1/Km ，求出Km 和Vmax ，双倒数方程如下：maxmax max 1][1][][1V S V K S V S K V m m +=+= 表七3.7 实验结果与分析 3.7.1 离子交换层析图酵母经过冻融法粗提蔗糖酶、硫酸铵分级沉淀后进行DEAE-Sephrose 离子交换层析。
其洗脱曲线如下图，蔗糖酶集中在稳定后一个小时至第二个小时之间。
其洗间。
图63.7.2蔗糖酶的分纯化计算各步的总蛋白、总活性、比活、回收率和纯化倍数，蔗糖酶比活力为947.805U/mg，最后纯化倍数为16.14倍，回收率为51.6%。
表八从上表可以看出，选用乙醇沉淀+冻融法和乙醇沉淀+SDS法是最优组合，但SDS法得到的酶液，容易随时间的改变而变化，见下表；这极有可能是因为，SDS为强的蛋白质变性剂，随着时间的变化，其对蛋白质的活性有很大的影响，这在酶的生产过程中对周期的要求就大大增加了，而冻融法却没有这种生产限制：表十3.7.3 蔗糖酶纯度鉴定图71——冻融法+硫酸铵分级沉淀法得到的酶液2——Marker（由Amersham公司提供）3——冻融法+乙醇分级沉淀法得到的酶液4——冻融法+乙醇分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液5——冻融法+硫酸铵分级沉淀法得到的酶液6——冻融法+硫酸铵分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液7——冻融法+乙醇分级沉淀法得到的酶液8——冻融法+乙醇分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液9——Marker（由TaKaRa公司提供）10——冻融法+硫酸铵分级沉淀法+DEAE-Sephrose离子交换层析得到的酶液从上图可以看出，除了2号泳道和9好泳道有Marker条带，其余没有条带跑出。
初步认为，是由于上样量太少（10uml），但由于存样量不够继续加样实验。
3.7.4 酶促反应动力学研究3.7.4.1 最适PH值用不同PH值的缓冲液体系代替原来的缓冲液体系，然后按常规测定条件和方法测定酶活。
结果表明，酵母蔗糖酶在PH4.5的条件下活性最大（如下图所示）。
图83.7.4.2 蔗糖酶最适温度在一系列不同温度下测定蔗糖酶的活性，结果表明，蔗糖酶的最适温度在50℃左右。
（如下图所示）图93.7.4.3 蔗糖酶Km及Vmax在蔗糖酶的最适温度和PH下，测定不同底物浓度时的反应速度，按测定结果计算1/[S]和1/V，并按双倒数法作图，得到线性回归方程（如下图），求得蔗糖酶的Km为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为 5.98ug/min。
图10第四部分讨论4.1 蔗糖酶的分离纯化在进行实验之前，根据已有的文献报道和实验室现有的条件设计了一条常规的纯化路线，即粗提、分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析。
在本实验中经过DEAE-Sepharose 离子交换层析后，得到了纯的蔗糖酶。
酵母蔗糖酶的提取较常使用甲苯自溶法的，冻融法和SDS抽提法报道较少。
本实验中比较了上述三种酵母蔗糖酶的提取方法（见表八），可以看出SDS抽提法和冻融法的酶活性远高于甲苯自溶法的。
尽管甲苯自溶法所用试剂简单、价格低廉，但由于其耗时长、重复性差、酶活性低等缺陷，提取效率远不如其它两种方法。
通过对不同放置时间相同SDS浓度提取酵母蔗糖酶效果的比较，可以看出（见表九），随着放置时间的增加，酶的总活力和比活力都大大下降了，而冻融法却不然（见表十），随着放置时间的增加，酶的总活力和比活力几乎没变，因此，SDS抽提法在提取酵母蔗糖酶的过程中对操作周期的要求要比冻融法要严格的多！综合各个资料中对几种物种蔗糖酶的分离纯化实验，一般都是通过乙醇分级沉淀。
乙醇分级沉淀法是指在混合组分的溶液中加人与该溶液能互溶的溶剂，通过改变溶剂的极性而改变混合组分溶液中某些成分的溶解度，使其从溶液中析出。
如在含有糖类或蛋白质的水溶液中，分次加入乙醇,使含醇量逐步增高，逐级沉淀出分子量段由大到小的蛋白质、多糖、多肽在含皂苷的乙醇溶液中分次加入乙醚或丙酮可使极性有差异的皂苷逐段沉淀出来等。
与硫酸铵分级沉淀相比，该方法更简便易行，时间周期要求更短，且对操作温度没有限制，还可以有杀菌的作用。
离子交换层析是分离蛋白质应用最广泛的技术，蛋白质的两性特征意味着他们可以依PH值不同而呈阳离子或阴离子状态存在，与离子交换剂之间进行结合。