细菌标本片的制备及染色方法

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细菌涂片的制备及革兰氏染色实验报告

实验三细菌涂片的制备及革兰氏染色[实验目的]1、掌握细菌涂片的制备方法及革兰氏染色。

2、学习无菌操作，树立无菌观念。

[实验原理]细菌细胞微小，无色而半透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助染色使菌体着色（由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应）后，使其与背景形成明显的色差，从而能较清楚的观察到细菌的基本形态和结构。

根据不同的染色反应，可作为鉴别细菌的一种依据。

微生物染料是一种带苯环的有机化合物，其分子上具有发色基团和助色基团。

前者给化合物以特有的颜色，但不能与细菌结合；后者使化合物具成盐的性质，能和菌体结合。

分为碱性染料、酸性染料和中性染料三类。

根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为三种方法即简单染色、鉴别染色和特殊染色。

革兰氏染色：1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。

此法可将所有细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。

是细菌学上最常用的鉴别染色法，有着重要的理论和实践意义。

其染色过程是先用草酸铵结晶紫进行初染，再加媒染剂-革兰氏碘液，以增加染料和细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子量较大的复合物，然后用脱色剂-乙醇脱色，最后用沙黄液复染。

凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者即为G+菌，反之，脱色后染上复染剂颜色（红色）者即为G-菌。

其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同，通过染色加以鉴别。

革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，且类脂质含量少，经乙醇处理发生脱水作用后反而使其孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘形成的复合物保留在细胞内而不被脱色，结果细胞呈现紫色。

而革兰氏阴性菌的的肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂质含量较高，经乙醇处理后，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，结果细菌被脱色，再经沙黄复染后呈现红色。

细菌涂片和革兰染色法

细菌涂片和革兰染色法是常用的微生物学实验技术，用于观察和鉴定细菌。

细菌涂片是一种简单而常见的方法，用于制备细菌样品的薄层。

它通常包括以下步骤：
1.取少量细菌样品：从培养基或临床标本中取少量细菌，并使用吸管或接种环在玻璃
片上均匀涂抹。

2.干燥：将涂片放置在室温下使其自然干燥，以确保细菌固定在玻璃片上。

3.固定：通过加热或使用特定化学药剂（如甲醇）进行固定，以保持细菌在涂片上的
形态结构。

4.染色：涂片可以使用不同的染色方法进行染色，例如格拉姆染色、苏木精染色等，
以区分不同类型的细菌。

5.观察：准备好的细菌涂片可在显微镜下观察。

通过观察细菌的形态、大小、排列方
式等特征，可以初步判断细菌的类型和特性。

革兰染色法是最常用的细菌染色方法之一，用于区分细菌的革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两类。

它包括以下步骤：
1.取少量细菌样品：从培养基或临床标本中取少量细菌，并涂抹在玻璃片上。

2.固定：对细菌进行固定，通常使用加热的方法使其附着在玻璃片上。

3.染色：首先将细菌涂片涂上紫色的革兰染色试剂（如紫晶染剂），然后用碘溶液形
成复合物。

接下来，使用酒精溶液洗去多余染料，并进行脱色。

最后，用蓝色的对
照染剂（如苏木精）进行染色。

4.观察：通过显微镜下观察细菌涂片。

革兰阳性细菌会呈现紫色或深紫色，而革兰阴
性细菌则呈现粉红色。

革兰染色法的结果可以提供有关细菌类型及其细胞壁结构的信息，这对于细菌分类和鉴定非常重要。

它是微生物学中常用的一种初步鉴定方法。

细菌标本片的制备及染色方法

实训目标
能利用不同的材料进行细菌标本片的制备掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性
仪器材料
酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等
1．碱性美蓝染色液
甲液：美蓝0.3g、95%酒精30mL；乙液：0.01%苛性钾溶液100mL 先配甲液，将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精研磨均匀后，把甲、乙两液混合，过夜后用滤纸过滤即成。新鲜配制的美蓝液染色不好，陈旧的染色好。
2．革兰氏染色液
（1）草酸铵结晶紫溶液甲液：结晶紫2g、95%酒精20ml；乙液：草酸铵0.8g、蒸馏水80ml 将结晶紫放入研钵中，加酒精研磨均匀制成甲液，然后将完全溶解的乙液与甲液混合即成。
2．革兰氏染色法
（1）在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1～ 3min，水洗。
（2）加革兰氏碘液，作用1～2min，水洗。
（3）加95％酒精脱色约30s至1min，水洗。
（4）加稀释石炭酸复红，复染30s左右，水洗，吸干后镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
（2）组织抹片的制作
待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的压迹。
（二）常用的细菌染色方法
1．美蓝染色法 2．革兰氏染色法 3．瑞氏染色法
1．美蓝染色法
在已固定好的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2～ 3 min，水洗，吸水纸轻压吸干或晾干和镜检，结果菌体呈蓝色。

微生物的染色实验报告

微生物的染色实验报告微生物的染色实验报告一、引言微生物是一类极小的生物体，包括细菌、真菌和病毒等。

它们在自然界中广泛存在，对人类的生活和健康具有重要影响。

为了更好地研究微生物的形态和结构，染色实验成为一种常用的方法。

本实验旨在通过染色技术观察微生物的形态和结构。

二、实验材料和方法1. 实验材料：（1）细菌标本：如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等；（2）染色试剂：如甲基蓝、碘液等；（3）显微镜和玻片。

2. 实验方法：（1）制备细菌涂片：取一滴细菌液滴在玻片上，用另一块玻片将其均匀涂开。

（2）甲基蓝染色：将制备好的细菌涂片放入甲基蓝溶液中浸泡片刻，然后用水冲洗净。

（3）碘液染色：将经过甲基蓝染色的细菌涂片放入碘液中浸泡片刻，然后用水冲洗净。

（4）观察：将染好色的细菌涂片放在显微镜下观察，并记录所见。

三、实验结果经过甲基蓝染色和碘液染色后，观察到细菌在显微镜下呈现出不同的形态和结构。

1. 大肠杆菌大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，呈杆状。

在染色后，我们观察到大肠杆菌呈现出深蓝色，细胞形态清晰可见。

通过放大镜，我们可以看到大肠杆菌的细胞体长约为2-3微米，直径约为0.5微米。

细菌细胞内部还可观察到细胞核和胞质等结构。

2. 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌，呈球状。

在染色后，我们观察到金黄色葡萄球菌呈现出浅蓝色，细胞形态圆润。

放大镜下，我们可以看到葡萄球菌的细胞直径约为1微米左右，呈团状生长。

细菌细胞内部可见到细胞壁和胞质等结构。

四、实验讨论通过本实验，我们成功地使用染色技术观察了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态和结构。

染色技术能够使细菌在显微镜下更加清晰可见，有助于研究微生物的特征和生理功能。

细菌的染色实验是一种常用的方法，不仅可以观察细菌的形态和结构，还可以帮助鉴定不同种类的细菌。

在实际应用中，染色技术在医学、食品安全和环境监测等领域具有重要作用。

例如，医生可以通过染色技术快速鉴定细菌感染的类型，从而指导治疗方案的选择。

细菌标本片的制备及染色方法PPT精选文档

技能训练5 细菌标本片的制备及染色方法
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实训目标
能利用不同的材料进行细菌标本片的制备掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性
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仪器材料
酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等
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（2）组织抹片的制作待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的压迹。
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（二）常用的细菌染色方法
1．美蓝染色法 2．革兰氏染色法 3．瑞氏染色法
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1．美蓝染色法
在已固定好的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2～ 3 min，水洗，吸水纸轻压吸干或晾干和镜检，结果菌体呈蓝色。
（2）卢戈氏碘液碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml。将碘化钾放入研钵中，加入少量蒸馏水，使其溶解，再放入已磨散的碘片，徐徐加水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸馏水倒入，再装入瓶中。
（3）石炭酸复红稀释液取碱性复红酒精饱和溶液（碱性复红10g溶于 95%酒精100ml中）1ml和5%石炭酸水溶液9ml混合，即为石炭酸复红原液。再取原液10ml和90ml蒸馏水混合，即成石炭复红稀释液。
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3．瑞氏染色法
细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上以固定标本，1～3min后，再滴加与染色液等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗，干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞等物呈其他颜色。

细菌染色标本制作的基本程序

细菌染色标本制作的基本程序细菌染色是微生物学中最常用的一项实验技术，它可以通过给细菌染色剂上色，使其在显微镜下更容易观察和分辨。

当然，制作细菌染色标本是一项需要一定技巧和步骤的工作，下面将为您介绍细菌染色标本制作的基本程序。

首先，我们需要准备好实验所需的材料和试剂。

这些包括：细菌培养物、正常盐水、草酸、无菌显微镜玻璃片、无菌染色盒、无菌棉签、无菌吸管、脱脂酒精、革兰氏染色液（包括靛基紫、碘酒、酒精洗涤液和地高辛溶液）等。

第二步，我们需要从培养物中取出一小部分细菌。

这时候，我们可以用无菌吸管将一小滴的细菌悬浮液滴在无菌玻璃片上。

这个步骤要小心且迅速，以避免细菌的污染。

第三步，取一片无菌玻璃片，将其浸入细菌悬浮液中，在载玻片上面均匀地涂抹细菌，然后将它晾干。

第四步，取一片已经晾干的载玻片，将其放置在无菌染色盒中，并加入足够的靛基紫染液。

注意，染液要保持润湿玻璃片的表面。

第五步，加入适量的草酸，进行解染处理。

解染时间要控制好，一般为10-15秒。

解染液会使染色菌体失去原有的紫色。

第六步，用水冲洗载玻片，直至冲洗出的水完全清晰。

这个步骤的目的是除去多余的染色剂和解染液，同时保留已染色的细菌。

第七步，加入碘酒，进行固定处理。

这个步骤可使细菌维持染色，还可以增加其稳定性。

第八步，用脱脂酒精进行洗涤处理。

这个步骤可以除去碘酒和细菌的余溶剂。

第九步，用无菌棉签将细菌标本上的水分吸干，然后将载玻片晾干。

最后，将制作完成的细菌染色标本放置在显微镜下观察。

在观察时，我们可以通过调整显微镜的倍数和焦距，进一步细致地观察和分析细菌的形态、结构和染色情况。

在进行细菌染色标本制作时，需要注意一些关键点。

首先，所有使用的材料都必须经过无菌处理，以避免外源性细菌的污染。

其次，在进行每个步骤时，都要小心操作，严格控制每一步骤的时间和温度，以确保染色结果的准确性和可靠性。

最后，制作完成的染色标本要储存好，以便保持其染色效果的稳定性。

细菌标本片的制备及染色法.

细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 镊子、剪刀在酒精灯火焰上烧灼灭菌，用镊子夹持、剪刀剪取小块病料组织，以其新鲜切面在玻片上轻触3~5个压迹。
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 室温下自然干燥或将标本片的涂面向上，置酒及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
• 滴加瑞氏染色液于涂片上以固定标本，1～3min后，再滴加与染色液等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗，干后镜检
• 注：瑞氏染液含甲醇，无需另行固定
瑞氏染色镜检结果
细菌（蓝色）细胞
(2)液体培养物可直接用灭菌接种环钩
取细菌培养液1～2环，在玻片上作直径1cm的涂面
细菌培养物涂片及革兰氏染色
1 涂片 2 干燥 3 固定 4 革兰氏染色
• 室温下自然干燥或将标本片的涂面向上，置酒精灯火焰高处微烤加热干燥。
细菌培养物涂片及革兰氏染色
1 涂片 2 干燥 3 固定 4 革兰氏染色
水洗水洗水洗
革兰氏染色镜检结果
葡萄球菌（G+菌，蓝紫色）
大肠杆菌（G-菌，红色）
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
45°
• 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端醮取血液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上，以45°角均匀推成一薄层的涂面。
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
– 组织病料（肝脏）：触片及美兰染色 – 固体细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌）：涂片及革
兰氏染色 – 液体病料：血涂片及瑞士染色
3. 镜检结果 4. 注意事项

实验二、细菌染色法

微生物分类鉴定的特征
形态学和生理生化特征血清学实验和噬菌体分型氨基酸序列和蛋白质分析核酸碱基组成和序列分析
形态学特征
培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表面特征、光泽等细胞形态：形状、大小、排列方式特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、荚膜等细胞内涵物染色反应：革兰氏染色、抗酸性染色运动性
察(防止水的折射，以便于观察)。
Microbiological Sterile Techniques
实验二细菌染色法
一、目的要求
1、掌握细菌染色标本的制备。
2、掌握简单染色法、革兰氏染色法的原理及操
作步骤。
3、熟悉革兰染色法在鉴定细菌上的重要意义。
二、基本原理
细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使
菌体着色，显示出细菌的一般形态结构及特殊结构，
从而有利于对细菌标本的观察。细菌染色法可分为单染色法和复染色法两大类。
染色时间：
吕氏碱性美蓝染色1~2min；石炭酸复红染色约1min 草酸铵结晶紫染色约1min。
5、水洗
将细菌涂片上染液倒入废液缸中；手持细菌染色涂片，臵于废液缸上方，用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无色为止。注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。
呈红色。
革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较
成分占细胞壁干重的%
革蓝氏阳性菌革蓝氏阴性菌
肽聚糖含量很高（50-90）含量很低（~10）
磷壁酸含量较高（<50）无类脂质一般无（ < 2）蛋白质无含量较高（~20）含量较高
革兰氏染色的意义
• 细菌分类鉴定 • 指导临床用药

微生物的制片染色技术

微生物的制片染色技术微生物的细胞含水量大（一般可达80～90％或更高），菌体薄而透明，折光性强，因此，除观察活细胞外，绝大多数情况下，都必须经过染色才能在显微镜下观察。

至于细菌的特殊结构——鞭毛、芽孢、荚膜，以及真菌的有性或无性孢子等，均需经特殊方法染色后，才能进行观察。

细菌的制片染色细菌涂片的制作与简单染色涂片制作：在干净载片上加清水1滴，用接种环（或牙签）取纯培养菌种（或牙垢等含菌标本）少许，与水混匀，涂布成薄层，在酒精灯火焰上方微热烘干，杀死菌体并使其固定在载片上。

注意：载片一定要清洁无油，即水滴可均匀散开，不收缩；取样要适当，不可过多；涂片要薄而均匀，干后呈淡乳白色、半透明状；烘干过程载片背面保持温热。

简单染色：在涂片上滴1滴复红或其他染色液，染色1分钟，倾去染料，用水沿玻片一侧轻轻冲去多余染料，擦干载片背面及周围水渍，风干，镜检。

此方法用于观察细菌外形及大小。

革兰氏染色细菌学中广泛使用的一种染色方法。

用于鉴别细菌，可将细菌分为革兰氏染色阳性及革兰氏染色阴性两大类。

染色步骤：用上述方法制备细菌涂片，干燥后，加结晶紫1滴，初染1分钟，用水冲去多余的染料；稍干后，加媒染剂卢戈氏碘液2～3滴，固定1～2分钟，用水冲去碘液；稍干后，加95％酒精1～2滴，脱色20～30秒，迅速用水冲洗（此时革兰氏阳性菌紫色，阴性菌无色）；滴加0.5％番红1滴复染1分钟，使被脱色的阴性菌着色。

镜检时，阳性菌紫色，阴性菌红色。

革兰氏染色的关键为酒精脱色，脱色过轻，阴性菌脱不掉紫色；若脱色过重，阳性菌的紫色也会脱掉。

因此，染色时首先应制好薄而均匀的涂片，并掌握好脱色时间。

此外还应注意菌龄，某些革兰氏染色阳性菌，其老龄菌常呈阴性反应，因此，染色用菌种应是24小时内的培养物。

特殊结构染色细菌的鞭毛、芽孢、荚膜等特殊结构，必须用特殊方法才能使其着色。

芽孢染色：芽孢壁较厚，染料不易透过，但着色后亦不易脱色。

芽孢染色一般需用培养24～48小时的菌种，涂片风干后，加5％孔雀绿染液3～5滴，用酒精灯微火加热至出现蒸气（不断补充染液，使其保持不干，也不沸腾），染色5～10分钟，冷却后，用水冲洗，再用0.5％番红液复染1分钟，水洗，风干后镜检。

技能训练2 细菌标本片的制备和染色法

技能训练2 细菌标本片的制备和染色法一、目的要求：正确掌握细菌培养物涂片的制作和常用染色法二、设备材料病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。

三、操作方法细菌标本片制作的基本步骤为：涂片或触片→干燥→固定→染色→镜检。

(一)细菌涂片的制备1．液体培养物及液体病料(1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

(2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40cm处适当加热干燥。

(3)固定分为火焰固定和化学固定两种。

火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。

此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。

(4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。

2．固体培养物用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央→用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合→均匀地涂布成适当大小的薄层→干燥→固定→染色。

(二)细菌触片的制备将固体病料(病变组织)作无菌切开→用切面在玻片的中央接触一下或稍用力印压成一薄层→干燥→固定→染色。

(三)细菌的染色法1．单染色法又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。

(1)美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液1—2min后，水洗，干燥(吸水纸吸干或自然干燥)，镜检。

(2)瑞特氏染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1—3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3—5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。

也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3—5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。

细菌染色和涂片观察的方法

细菌染色和涂片观察的方法细菌的染色和涂片观察是微生物学中非常重要的实验方法，可以帮助我们识别和研究细菌的形态、结构和特征。

下面将详细介绍细菌染色和涂片观察的方法。

一、细菌染色方法：1.革兰氏染色法：革兰氏染色法是细菌染色中最常用的方法之一、通过该方法，细菌可以被分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

步骤：(1)取一块玻璃片，将细菌涂布于玻璃片上。

(2)用火炬预热玻璃片，使玻璃片夹持菌液返燃。

(3)在火焰中反复将菌液加热，使其彻底干燥。

(4)将干燥的玻片放在青霉素醛固定液中，固定细菌片。

(5)用生理盐水将玻璃片在微生物操作台上反复冲洗，去除青霉素醛固定液。

(6)将玻璃片放在碘酒液中浸泡3-5分钟，使菌液变成深度蓝黑色。

(7)洗净玻片，以去除碘酒液。

(8)将玻片放入95%乙醇中，进行除膜操作，1-2秒钟后取出。

(9)玻片反复在试管中加乙醇，直至洗涤液基本为无色，然后将玻片放入流动水中漂洗。

(10)用草绿素溶液染色，将玻片浸泡5分钟。

(11)用水漂洗片面，直至玻片颜色基本不变。

(12)用纤维纸轻轻拍去多余的水分，放在显微镜载物玻片上中间，覆盖一层玻璃标本纸，压平，尽量避免产生气泡。

(13)利用显微镜观察染色结果，革兰氏阳性菌为紫色或紫蓝色，革兰氏阴性菌为粉红色。

2.肥湖水染色法：肥湖水染色法也是常用的细菌染色法之一，可以用来观察鞭毛、纤毛等细菌结构。

步骤：(1)取一块玻璃片，将细菌涂布于玻璃片上。

(2)用火焰热熔玻璃片，使其保持与菌液接触状态，避免菌液干燥。

(3)将玻璃片放在肥湖水溶液中浸泡2-3分钟。

(4)用生理盐水将玻璃片反复冲洗，去除肥湖水溶液。

(5)用希森润湿法将玻璃片上覆盖一层希森润湿剂。

(6)利用显微镜观察染色结果，鞭毛呈现鲜绿色，纤毛呈现暗蓝色。

二、涂片观察方法：1.涂片制备：涂片制备是观察细菌形态和结构最常用的方法之一、涂片制备的步骤如下：(1)在无菌条件下，将细菌涂布于玻璃片上。

(2)用火焰或紫外线灭菌，使其迅速晾干。

细菌标本片的制备及染色

细菌标本片的制备及染色同学们，大家好！今天我们要学习的内容是--《细菌标本片的制备及染色》。

我们这节课要用到的仪器和材料有酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、革兰氏染色液、洗瓶、显微镜、香柏油、擦镜纸、细菌培养物、细菌病料、无菌镊子和剪刀、铅笔等。

（实物照片或网上图片）本次实验的基本流程是：制片—干燥—固定—染色好，我们开始今天的实验:（一）玻片准备：选择干净、清晰、透明、无油渍的载玻片，滴上水后能均匀展开。

（学生演示）（二）细菌标本片的制作过程，根据所用材料不同，制片的方法有差异，这节课我们以制作葡萄球菌标本片为例，给大家做个示范。

1. 先用灭菌接种环取1~2环无菌生理盐水，置于玻片中央，再将接种环灭菌，冷却后挑取少量葡萄球菌，与水混合，涂布成适当大小的薄层。

接种环用后需再次灭菌。

（学生演示）在涂布时切忌涂抹过厚，否则不利于染色和观察。

2.干燥：将涂面向上置火焰高处微烤加热干燥（学生演示）3.固定：将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（一般4~6次），以手背触及玻片微烫手为宜。

（学生演示）固定的目的是使菌体蛋白质凝固，形态固定，易于着色，并且经固定的菌体牢固黏附在玻片上，水洗时不易冲掉。

（三）革兰氏染色法：1.初染：在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1~2min，水洗。

2.媒染：加革兰氏碘液媒染，作用1~3min，水洗。

3.脱色：加95%酒精脱色0.5~1min，水洗。

4.复染：加稀释石碳酸复红复染30s左右，水洗，吸干后镜检。

（动画展示或学生演示）结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

因葡萄球菌为革兰氏阳性菌，所以称蓝紫色。

（四）镜检观察应用拓展：革兰氏染色液的配制课后练习：同学们根据今天所学的细菌标本片的制备及染色方法，练习大肠杆菌的标本制片及染色。

实验二细菌涂片的制备和染色镜检

革兰阳性菌革兰阴性菌
革兰氏染色法
革兰氏染色法动画
实验报告：
1、细菌抹片或涂片革兰氏染色的显微镜观察结果。 2、革兰氏染色法的具体程序和注意事项。
细菌的单染色
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干
染色1~2min
细菌抗酸染色
1. 初染:用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。
2. 脱色: 3%盐酸酒精脱色30秒~1分钟；用水冲洗。
3.复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水镜检
目的要求：1、掌握细菌抹片的制备方法和常用染色方法。 2、认识革兰氏染色和抗酸性染色的反应特性。
实验内容：
1、细菌抹片的制备：
玻片准备：透明、洁净、无油渍。
细菌抹片的制备
抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。
干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。
5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。 6. 镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。
革兰氏染色法原理：
革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。 G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。

细菌标本片的制备及染色方法

细菌标本片的制备及染色方法1.材料准备-细菌培养物：选择代表性的细菌培养物，如液体培养物、固体培养物、接种物等。

-玻片：选择无痕的玻片，经高温消毒或与有机溶剂清洗后晾干备用。

-液体固定剂：如95%乙醇、甲醛等。

-染色剂：如碘酒、靛蓝溶液、絮状靛蓝等。

-水：经蒸馏水或高纯水处理。

2.细菌标本片制备(1)涂薄法：采取适量的培养物，滴于玻片上，使用无菌铁环将培养物涂匀于玻片表面，待溶液蒸发，自然晾干。

(2)刮刀法：将细菌培养物取下适量，用棉签或刮刀将菌落刮到玻片上，制成薄层。

(3)叠片法：将细菌培养物滴于玻片上，然后使用另一片玻片压在上面，使培养物均匀分布在两片玻片之间。

然后慢慢滑动两片玻片，使液体薄层均匀分布。

3.细菌标本片固定(1)液体固定法：加入同等体积的液体固定剂于细菌标本片上，浸泡5-10分钟。

固定剂能使细菌细胞变硬，保持细胞原态形态。

(2)干燥法：将细菌标本片放置在室温下，自然晾干，使细菌固定在玻片上。

此方法适用于脆性细菌。

4.细菌标本片染色(1)碘酒染色：取适量碘酒滴于细菌标本片上，置于室温下静置10-20秒。

然后用水冲洗，使过多的碘酒洗掉。

(2)靛蓝溶液染色：取适量靛蓝溶液滴于细菌标本片上，置于室温下静置10-20秒。

然后用水冲洗，使过多的靛蓝洗掉。

5.透明化处理(1)絮状靛蓝法：将细菌标本片在300倍以下的低倍率镜下观察，确定细菌形态无误后，将玻片倾斜，滴入絮状靛蓝液。

待颜色由淡到重，停在合适的颜色时，用水冲洗玻片上多余的靛蓝。

(2)水透明化法：可使用蒸馏水或高纯水将细菌标本片浸泡5-10分钟，然后取出晾干。

透明化后，细菌会变得透明，观察细胞内部结构会更清晰。

6.滴水封片在制备完成的细菌标本片上滴一滴蒸馏水或高纯水，将盖片平放在上面。

用纸巾或吸水纸轻轻按压玻片两侧，使水均匀分布。

然后将封片剂滴于玻片四周，使玻片与盖片紧密结合，定期晾干即可。

细菌染色技术总结

细菌染色技术（2010-11—22 22：29:46)目的要求初步掌握细菌涂片制作，单染色法及革兰染色法等染色技术。

实验内容1．细菌染色一般程序涂片干燥固定初染（媒染) 脱色复染（1）涂片临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上，固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水，然后取菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊.涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。

（2)干燥涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上,置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。

（3)固定细菌的固定常用火焰加热法,即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3～5次，温度以手能摸时热而不烫为度。

目的在于杀死细菌，凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。

(4）初染不同的染色方法，所用染液也不同.染液以覆盖菌膜为度。

（5) 媒染通过媒染可增加染料和被染物质的亲和力。

媒染剂还可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。

（6）脱色此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。

（7) 复染细菌初染色被脱色后常以复染液复染，便于观察。

复染液的颜色与初染液有明显不同。

2．常用染料原液配制一般制备100ml纯酒精饱和溶液所需染料量：美兰2g～5g；结晶紫7g~14g；碱性复红3g～7g。

3．常用的染色方法(1) 单染色法即用一种染料染色的方法。

常用吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液。

1）染液①吕氏美兰液美兰酒精饱和液30ml+0.01％KOH溶液70ml即成.②稀释石炭酸复红液碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸溶液90ml,然后用蒸馏水作10倍稀释即成。

2) 菌种大肠埃希菌普通斜面培养物。

3）染色方法于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液，染色1min，以水冲洗至无颜色流下为止，自然干燥或以远火烘干后镜检。

4) 结果以美兰染色者菌体呈现兰色;以稀释石炭酸复红染色的菌体呈现红色.（2）革兰染色法1) 原理细菌被结晶紫着色后，再经媒染剂处理，染成深紫色或紫黑色。

实验3细菌标本制备革兰染色

（二）革兰氏染色法

G+
G-
初染：滴加结晶紫液媒染：加碘液脱色：加95%酒精复染：加石炭酸复红液
油镜观察紫色红色
五、结果
革兰染色
G+菌呈紫色
G-菌呈红色

革兰染色：涂片不易过厚，薄而均匀为好；脱色不足或脱色过度均会造成革兰染色的假阳性或假阴性，脱色时间取决于涂片厚度、室温等。
三、材料

葡萄球菌培养物大肠杆菌培养物革兰染液生理盐水、载玻片接种环、酒精灯、显微镜
三、材料

革兰染液: ⑴结晶紫染液 ⑵碘液 ⑶95%酒精 ⑷石炭酸复红液
四、方法
步骤：
（一）细菌标本片制作
葡萄球菌大肠杆菌
涂片干燥
固定
取1～2环生理盐水挑取少细菌与盐水混匀，涂成直径约1cm的薄膜。
1.G+菌细胞壁结构致密，粘肽层厚，酒精不易透入，阻止染料由细胞内渗出。G-菌的细胞壁较疏松，粘肽层薄，脂质含量多，酒精易透入被脱色。 2.G+菌等电点（pH2～3）比G-菌（pH4～5）低， G+菌所带负电荷比G-菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。
3. G+菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐与结晶紫染料结合牢固，不易脱色； G-菌反之。
结晶紫染液碘液95酒精石炭酸复红液三材料一细菌标本片制作涂片干燥固定取12环生理盐水挑取少细菌与盐水混匀涂成直径约1cm的薄膜
医学微生物学实验
实验三
实验项目
细菌染色技术
细菌标本片的制备革兰染色

一、目的

掌握细菌标本片制作；掌握革兰染色方法；熟悉革兰染色的原理与注意事项

细菌玻片制备实验报告

一、实验目的1. 掌握细菌玻片制备的基本方法。

2. 熟悉无菌操作技术，培养无菌观念。

3. 通过观察细菌形态，了解细菌的基本结构。

二、实验原理细菌是微小的单细胞生物，肉眼无法直接观察到。

为了在显微镜下观察细菌，需要将细菌制成玻片标本。

细菌玻片制备主要包括涂片、固定、染色和封片等步骤。

通过染色，可以使细菌着色，便于观察其形态和结构。

三、实验材料1. 细菌样本：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。

2. 实验器材：接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、无菌生理盐水、结晶紫染液、碘液、95%酒精、无菌水等。

四、实验步骤1. 涂片（1）将接种环在酒精灯上灼烧，待其冷却后，蘸取少量细菌样本。

（2）将接种环在载玻片中央轻轻涂抹，形成直径约1cm的菌膜。

（3）将载玻片翻转，使菌膜朝上。

2. 固定（1）将涂有细菌的载玻片放入酒精灯火焰上，使菌膜固定。

（2）固定过程中，不断用接种环轻轻刮动菌膜，确保菌膜均匀附着在载玻片上。

3. 染色（1）将载玻片放入结晶紫染液中染色，染色时间为1-2分钟。

（2）取出载玻片，用蒸馏水冲洗掉多余的染液。

（3）将载玻片放入碘液中媒染，媒染时间为1分钟。

（4）取出载玻片，用蒸馏水冲洗掉多余的染液。

4. 洗涤与封片（1）将载玻片放入95%酒精中脱色，脱色时间为30秒。

（2）取出载玻片，用蒸馏水冲洗掉酒精。

（3）将载玻片放入50%酒精中，封片。

五、实验结果通过观察显微镜下的细菌玻片，可以看到细菌呈现出不同的形态和结构。

金黄色葡萄球菌呈球形，革兰氏染色呈紫色；大肠杆菌呈杆状，革兰氏染色呈红色。

六、实验讨论1. 细菌玻片制备过程中，无菌操作至关重要。

应严格按照无菌操作规程进行实验，防止细菌污染。

2. 染色过程中，染色时间、媒染时间、脱色时间等参数对染色效果有较大影响。

应严格控制染色时间，确保染色均匀。

3. 本实验通过制备细菌玻片，使学生了解了细菌的基本形态和结构，为进一步学习细菌学知识奠定了基础。

七、实验总结通过本次实验，我们掌握了细菌玻片制备的基本方法，熟悉了无菌操作技术，并观察了细菌的形态和结构。

细菌标本片的制备及染色法

细菌病料触片及美兰染色
细菌病料触片及美兰染色细菌病料触片及美兰染色明确本技能在实践中的意义。
瑞氏染色镜检结果
酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油
、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物(大肠杆菌、葡萄球菌等)、细菌病料、镊子、剪刀、标记笔等
组织病料（肝脏）：触片及美兰染色
葡萄球菌（G+菌，蓝紫色）
葡萄球菌（G+菌，蓝紫色）
标本片固定必须确实，以免水洗时菌被冲掉。
干燥及火焰固定时，切勿紧靠火焰，以免温度过高造成菌体结构破坏。
(2)液体培养物可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1～2环，在玻片上作直径1cm的涂面
滴加美蓝染色液覆盖涂面，静置染色2~3min，水洗，用吸水纸吸干镜检。
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 镊子、剪刀在酒精灯火焰上烧灼灭菌，用镊子夹持、剪刀剪取小块病料组织，以其新鲜切面在玻片上轻触3~5个压迹。
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 室温下自然干燥或将标本片的涂面向上，置酒精灯火焰高处微烤加热干燥。
• 滴加美蓝染色液覆盖涂面，静置染色 2~3min，水洗，用吸水纸吸干镜检。
美兰染色镜检结果
细菌（蓝色）细胞核（蓝色）
细菌培养物涂片及革兰氏染色
1 涂片 2 干燥 3 固定 4 革兰氏染色
(1)固体培养物取洁净的玻片一张，把
接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌后，取1～2环的无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，作成直径1cm 的涂面。接种环用后需灭菌。

细菌标本片的制备及染色方法

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