免疫共沉淀(Immunoprecipitation, IP)解析 共12页
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋口质和抗体的特异性结合以及细菌蛋口质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。
口前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的日的。
通过低速离心，可以从含有U的抗原的溶液中将U的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads 复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验U的。
IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4?裂解30min, 12, OOOg离心30 min后取上清；(2)取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1 P g相应的抗体和10-50 u 1 protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4?C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后,在4?C以3, 000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads 离心至管底;将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3, 4 次;最后加入15 U1的2XSDS加样缓冲液,沸水煮10分钟；（4）S DS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，笫一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法一、基本概念免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。
免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。
其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。
与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。
不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。
在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。
二、抗体的选择（一）多克隆抗体多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。
但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。
（二）单克隆抗体与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。
但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。
三、免疫沉淀方法免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。
若为前者，免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，只需压片即可检测到靶蛋白的存在；若为后者，经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后，尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。
（一）所需试剂及溶液改良的RIPA液（细胞裂解液）、稀释缓冲液（常用PBS溶液）、TSA溶液、0.05mol/lTris（pH6.8）、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)
一原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A 珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min， 12,000g 离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
免疫共沉淀
起桥梁作用；
如用western blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，
以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，
实验本身具有冒险性。
1.
实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力
也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明 书。特别是多抗的特异性是问题。
INMAP 是一个在 有丝分裂中起重 要作用的蛋白， 保证了纺锤体和 端粒的完整性。 本 文 研 究 了 INMAP 通 过 P53/P21 途 径 起 作用。
结论？
一. 二. 三.
免疫沉淀（IP） 免疫共沉淀（CO-IP） 免疫共沉淀结果分析
免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗 体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗 体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白） 从混合体系沉淀下来。
免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗原蛋 白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein
Western blotting 或质谱分析，即样品处理（温度，裂解液成 分）；抗体-agarose beads孵育（选择合适的阴性对照）；抗体 -agarose beads复合物洗涤；鉴定
非变性条件下进行实验；
需要高质量的抗体；
免疫沉淀体系需要有严格的控制指标
基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相 关实验手段：
定蛋白质的新的作用搭档。
（1） 蛋白样品准备：如果为细胞样品，需先裂解细胞；
（2） 抗原抗体结合反应； （3） Protein A/G 与抗原抗体复合物结合； （4） 免疫复合物与 protein A/G 解离： 一般采用 2% SDS 煮沸 5 分钟处理样品；
ip蛋白免疫共沉淀
ip蛋白免疫共沉淀
免疫共沉淀（Co-IP）是一种基于抗体和抗原之间的专一性作用，用于检测和确定生理条件下蛋白质之间相互作用的方法。
这种方法的基本原理是将蛋白质视为抗原，并利用抗体与之进行特异性结合的特性来进行研究。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。
因此，免疫共沉淀技术可用于确定两种蛋白质在完整细胞内的相互作用。
然而，这种方法也有一些局限性，例如难以检测到弱或瞬时的相互作用，且多个相互作用蛋白质复合物的存在也可能引起非特异性相互作用。
请注意，这是一个涉及生物技术领域的复杂问题，需要更多详细的实验数据和具体的实验操作步骤来进行深入研究。
免疫共沉淀技术
免疫共沉淀技术
免疫共沉淀技术（immuno-co-precipitation, ICP）是一种用于检测蛋白质相互作用的分子生物学技术。
它利用抗体来识别和结合目标蛋白，通过物理沉淀将目标蛋白与其它蛋白质分离出来，从而得到一组可能存在蛋白质间相互作用的蛋白质复合体。
原理上，在特异性抗体和抗原蛋白之间形成免疫复合物，并将目标蛋白质和其他蛋白质一起沉淀出来，从而实现蛋白质相互作用的检测和鉴定。
免疫共沉淀技术步骤如下：
1. 先将受体蛋白与抗原蛋白混合；
2. 加入特异性抗体，使受体蛋白与抗原蛋白形成免疫复合物；
3. 通过物理沉淀的方法将受体蛋白与抗原蛋白复合物沉淀出来；
4. 用免疫印迹技术对共沉淀蛋白复合物进行检测。
免疫沉淀Immunoprecipitation试验操作方法
免疫沉淀（Immunoprecipitation ）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP ）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如 proteinA/G 特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC 片段的现象而开发出来的特异分离富集 抗原的方法。
目前多用预先结合固化在Agarosebeads 上的proteinA/G （Agrose-proteinA/G ）, 使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物，利用Agarosebeads 的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。
实验步骤：1 .处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。
一般3X106细胞/处理（即六孔板一个孔，约200ug 总蛋白）。
2 .配IP 裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。
注意抑制剂的要现加现用。
3 .收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1XPBS （4度）洗1遍，每孔加入200ulIP 裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP 管中。
4 .超声：强度37%,5秒X4次（程序07）。
目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。
5 .离心细胞裂解液：4度10000rpm10分钟。
6 .Agrose-proteinA/G 清洗：一般1ug 抗体对应15ulAgrose-proteinA/G （不同公司产品可能CopyrightMolecularStationCtntrfuQjbmM 翱higniTrtComplt 由事，，低.而4***不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G 用量与结合抗体的用量一致。
取相应量的Agrose-proteinA/G 到EP 管中（剪枪头）并用500ul1xPBS （4度）洗两遍，5000rpmx2分钟，吸掉上清备用。
免疫共沉淀(Immunoprecipitation,+IP)ppt课件
Байду номын сангаас
异丙醇： 优点：所需容积小且速度快，适用于浓度低， 而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选 择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、 tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下 长时间放置。
缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在 DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的 乙醇漂洗DNA沉淀数次。
（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量
裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；
（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖
珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中
4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼 脂糖珠偶连；
（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000
免疫共沉淀技术的应用
肿瘤 酶与病毒 信号传导 寄生虫
免疫共沉淀技术的优点与局限性
优点：
与蛋白质亲和层析一样，检测的产物 是蛋 白质的粗提物；
抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的 浓度存在，避免了过量表达所造成的人为效 应；
蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在； 复合物以天然状态存在，蛋白的相互作用 可以在天然状态下进行，可以避免人为影响， 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复 合体.
rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；
将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。
目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物，利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。
实验步骤：1.处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。
一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)。
2.配IP 裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。
注意抑制剂的要现加现用。
3.收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4度）洗1遍，每孔加入200ul IP裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。
4.超声：强度37％，5秒×4次（程序07）。
目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。
5.离心细胞裂解液：4度10000rpm 10 分钟。
6.Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。
取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul1×PBS（4度）洗两遍，5000rpm×2分钟，吸掉上清备用。
免疫沉淀 Immunoprecipi tion IP 原理
免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复基本实验步骤(1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min， 12,000g离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。
免疫共沉淀input组
免疫共沉淀input组
免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种用于鉴定蛋白质复合物的实验技术。
在免疫共沉淀实验中，首先需要制备特定抗体，并使用该抗体将目标蛋白质捕获。
然后，利用磁珠或珠子等固相载体捕获被抗体结合的蛋白质和与之结合的蛋白质复合物。
最后通过洗涤和_elute_操作来分离并纯化目标蛋白质和复合物。
通常，在进行免疫共沉淀实验前会设计一个input组，以检测非特异性沉淀和特异性沉淀。
input组是在IP实验中与目标样品相同的组织或细胞提取物，但不添加任何抗体。
通过将input组与实验组进行比较，可以确定免疫共沉淀实验中发现的复合物是否特异性结合到目标蛋白质，并评估实验的灵敏度和特异性。
需要注意的是，在进行免疫共沉淀实验时，input组应该与实验组在处理、存储等方面保持一致，以最大程度上消除非特异性因素的干扰。
免疫共沉淀(Co-IP)
1免疫共沉淀一、实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是利用抗原A 与蛋白B 结合，通过A 的抗体（钥匙）沉淀A （锁），再利用精制的prorein A/G （钥匙链）预先结合到磁珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，磁珠上的prorein A/G 就能吸附抗原，从而获得抗原A 与蛋白B 的复合体，之后就可以对B 进行检测，从而获得蛋白质与蛋白质相互作用的信息。
二、Co-IP 标准化操作流程样品裂解（裂解液）→样品的预纯化（normal IgG/微珠）→与目标蛋白抗体共孵育（IP 抗体、Normal IgG ）→免疫共沉淀（微珠）→微珠清洗（裂解液）→洗脱→WB 分析或其他分析（WB/一抗、二抗）（一）样品裂解 1.温和裂解（1）温和的裂解液进行裂解，常用的去垢剂成分：NP-40、TritonX-100、IGEPAL CA-630、CHAPS ；（2）成品buffer ；（3）添加蛋白酶抑制剂（防止蛋白被降解）。
2.样本制备流程（1）去掉培养基，用冰PBS 清洗一次。
2（2）去掉PBS，每个板（10cm ）中加0.5mL 冰预冷的1×细胞裂解液，在冰上孵育5min 。
（3）将所有细胞刮下，收集到离心管，置于冰上。
（4）冰浴中对样品用超声处理3次，每次5s 。
（此步骤对膜蛋白提取有较好作用） （5）4 ℃，14000g 离心10min ，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。
（6）BCA 测定浓度。
3.注意事项（1）整个过程冰上操作。
（2）IP 样本一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要，可保存在-80 ℃。
（二）预纯化 1.阴性对照的选择与IP 抗体同源同型（亚型）的抗体：如 Rabbit IgG ；Mouse IgG1等。
取与IP 实验等量的裂解液，使用Isotype Control 孵育；与IP 抗体孵育同时进行。
2.Isotype Control 选择3.预纯化的目的（1）减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。
免疫共沉淀中input作用
免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与其他分子之间的相互作用。
在免疫共沉淀实验中，我们通常有两个主要组分：待测蛋白（target protein）和抗体（antibody）。
在实验中，待测蛋白是我们感兴趣的蛋白质，而抗体是一种专门识别和结合待测蛋白的分子。
免疫共沉淀实验的目标是使用特定的抗体选择性地沉淀待测蛋白，并在沉淀物中检测其与其他蛋白质或分子的相互作用。
输入（input）在免疫共沉淀实验中是一个关键的对照样品，通常是与待测蛋白没有直接相互作用的蛋白质或其他分子。
输入的作用是帮助确定实验结果中的非特异性结合或背景信号。
通过引入输入对照，我们可以区分特异性相互作用和非特异性结合。
当我们将输入样品与抗体一起加入到实验体系中时，我们期望抗体能够选择性地沉淀目标蛋白，并且与输入没有相互作用。
因此，在共沉淀物中观察到的信号应该主要来自于待测蛋白与抗体的特异性结合，而与输入无关。
输入通常是通过使用无关的抗体或与待测蛋白没有交互作用的蛋白质来实现的。
它可以帮助确定实验中的背景信号或非特异性结合，并确保我们正确地解释共沉淀实验结果。
通过与输入进行比较，我们可
以验证共沉淀物中的信号是否真正由待测蛋白与其他分子的特异性相互作用所引起。
因此，输入的作用是提供一个参考标准，用于区分特异性信号和非特异性结合或背景信号，从而帮助研究人员解释免疫共沉淀实验结果，并准确地确定待测蛋白与其他蛋白质或分子的相互作用。
这样的对照样品在免疫共沉淀实验中是至关重要的，以确保结果的可靠性和准确性。
免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理
免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复基本实验步骤(1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min， 12,000g离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。
蛋白质免疫共沉淀原理
蛋白质免疫共沉淀原理蛋白质免疫共沉淀（protein immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于从混合样品中选择性地富集、分离和纯化特定的蛋白质。
该技术基于抗体与特定蛋白质之间的高度特异性结合，通过将抗体与相应的抗原结合，然后利用抗体-抗原复合物对目标蛋白质进行富集和纯化。
以下将详细介绍蛋白质免疫共沉淀的原理和应用。
蛋白质免疫共沉淀的原理基于免疫学的基本原理。
当宿主动物（如小鼠、兔子）接种抗原后，免疫系统会产生抗体来特异性识别和结合抗原。
抗体是能够与抗原特异性结合的分子，它通常由两个重链和两个轻链组成。
抗体的抗原结合位点位于其变量区域，这个区域具有高度特异性，能够识别并结合特定的抗原。
1.制备抗体：首先，需要获得特定蛋白质的抗体。
这可以通过免疫动物（如小鼠或兔子）来实现。
将目标蛋白质注射入宿主动物体内，触发免疫反应，产生特异性的抗体。
2.抗体固定：将抗体固定在适当的固相介质上，如磁珠、琼脂糖或微孔板等。
固相抗体通常被共价地连接到固相介质上，以增加固定的稳定性和特异性。
3.样品孵育：将包含目标蛋白质的混合样品与固相抗体孵育。
在这个过程中，抗体会特异性地结合目标蛋白质，形成抗原-抗体复合物。
4.共沉淀：通过离心或其他分离方法，将抗原-抗体复合物与固相结合的抗体一起沉淀下来，从而将目标蛋白质分离和富集出来。
5.洗涤：对沉淀物进行多次洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他污染物。
洗涤的过程中，使用不同的缓冲液和洗涤条件，可以有效地去除非特异性结合的物质。
6.洗脱和纯化：通过改变盐浓度、pH值或其他条件，将目标蛋白质从抗体上洗脱下来。
洗脱的条件要使目标蛋白质脱离抗体而不破坏其结构和功能。
7.分析：对纯化的目标蛋白质进行进一步的分析，如免疫印迹、质谱分析、酶活测定等，以确定蛋白质的身份和活性。
1.蛋白质互作研究：通过免疫共沉淀，可以捕获目标蛋白质与其相互作用的互作蛋白质。
这可以帮助研究蛋白质相互作用网络、信号传导通路等。
免疫共沉淀质谱
免疫共沉淀质谱免疫共沉淀质谱（immunoprecipitation-massspectrometry，IP-MS）是一种广泛应用于生物学研究的方法，用于鉴定蛋白质相互作用的伴侣。
该方法结合了免疫沉淀和质谱分析技术，可以从复杂的混合物中鉴定目标蛋白质的相互作用伴侣，从而揭示蛋白质相互作用网络的组成和功能。
本文将介绍IP-MS的原理、步骤和应用，并讨论该技术的优缺点以及未来的发展方向。
一、原理IP-MS的原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，将其与其相互作用伴侣共同沉淀下来，再用质谱技术检测沉淀物中的蛋白质成分。
该方法的关键在于选择合适的抗体，以确保沉淀物中仅含有目标蛋白质及其相互作用伴侣。
通常，IP-MS分为两种类型：单一免疫共沉淀（single IP-MS）和串联免疫共沉淀（tandem IP-MS）。
单一免疫共沉淀是指将抗体与目标蛋白质结合后，直接进行质谱分析。
而串联免疫共沉淀则是在单一免疫共沉淀的基础上，将沉淀物再次进行免疫沉淀和质谱分析，以筛选出更加特异的相互作用伴侣。
二、步骤IP-MS的实验步骤如下：1. 选择合适的抗体：选择与目标蛋白质结合的特异性抗体，并进行验证。
2. 免疫沉淀：将抗体与混合物中的目标蛋白质结合，然后添加磁珠或琼脂糖等固相材料，使其与目标蛋白质及其相互作用伴侣结合并沉淀下来。
3. 洗涤：用缓冲液洗涤沉淀物，以去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
4. 质谱分析：将沉淀物进行蛋白质分离和消化，并用质谱技术进行分析和鉴定。
5. 数据分析：使用生物信息学工具对质谱分析结果进行分析和解释，以确定目标蛋白质的相互作用伴侣。
三、应用IP-MS已被广泛应用于生物学研究中，尤其是在蛋白质相互作用网络的研究中。
以下是IP-MS的一些应用领域：1. 鉴定蛋白质相互作用伴侣：通过IP-MS可以鉴定目标蛋白质的相互作用伴侣，从而揭示蛋白质相互作用网络的组成和功能。
2. 研究蛋白质修饰：通过IP-MS可以鉴定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化和乙酰化等。
IP免疫共沉淀与CO-IP-MS：技术选择与比较
IP免疫共沉淀与CO-IP-MS：技术选择与比较生物医学领域中，研究蛋白质相互作用是非常重要的。
蛋白质相互作用是细胞内许多生物学过程的基础，包括信号传导、代谢调节、基因表达等。
因此，研究蛋白质相互作用对于理解细胞内生物学过程以及疾病的发生和发展具有重要意义。
IP免疫共沉淀和CO-IP-MS是两种常用的技术，用于研究蛋白质相互作用。
本文将介绍这两种技术的原理、优缺点以及适用范围。
一、IP免疫共沉淀IP免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术。
该技术利用抗体与目标蛋白的特异性结合，将目标蛋白及其结合蛋白从混合物中沉淀下来，从而实现对目标蛋白的富集和分离。
IP技术可以用于研究蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用以及蛋白质-小分子相互作用等。
IP技术的基本步骤包括：1）将抗体与磁珠或琼脂糖等固相载体结合；2）将混合物与抗体-载体复合物孵育，使目标蛋白与抗体结合；3）用磁力或离心等方法将复合物沉淀下来；4）洗涤沉淀物，去除非特异性结合的蛋白；5）用SDS-PAGE或Western blot等方法检测目标蛋白及其结合蛋白。
IP技术的优点是可以选择性地富集目标蛋白及其结合蛋白，从而减少背景干扰。
此外，IP技术操作简单，适用于多种样品类型，如细胞、组织、血清等。
但是，IP技术也存在一些缺点。
例如，IP技术对抗体的特异性和亲和力要求较高，如果抗体的特异性不够好，可能会出现假阳性结果。
此外，IP技术只能检测已知的蛋白质相互作用，对于未知的蛋白质相互作用无法发现。
二、CO-IP-MSCO-IP-MS（co-immunoprecipitation coupled with mass spectrometry）是一种结合IP技术和质谱分析技术的蛋白质相互作用研究技术。
CO-IP-MS技术可以用于鉴定目标蛋白的结合蛋白，并确定它们之间的相互作用方式。
图1。
CO-IP-MS技术的基本步骤包括：1）将抗体与磁珠或琼脂糖等固相载体结合；2）将混合物与抗体-载体复合物孵育，使目标蛋白与抗体结合；3）用磁力或离心等方法将复合物沉淀下来；4）洗涤沉淀物，去除非特异性结合的蛋白；5）用质谱分析技术对沉淀物进行分析，鉴定目标蛋白及其结合蛋白。
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rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；
将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液
洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲
液，沸水煮5分钟；
（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱 仪分析。
一、 样品处理： 二、 抗体-agarose beads孵育
谢谢！
乙醇沉淀dna和异丙醇沉淀dna的区别
异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候 一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一 些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游 的实验影响小 。
异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是 去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 有 时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。 在 沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇， 所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时， 用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温 下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。
免疫共沉淀
(CO—immunoprecipitation)
用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该 分子特异性结合的其他分子也会被带着一 起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证 蛋白质之间相互特异性结合。
免疫共沉淀可分为细胞内过表达蛋白、细 胞内源性蛋白、组织内蛋白的免疫共沉淀。
基本原理
细胞裂解物中加入抗体，这样可与已知抗 原形成特异的免疫复合物，若存在与已知 抗原相互作用的蛋白质，则免疫复合物中 还应包含这种蛋白质；经过洗脱，收集免 疫复合物，然后分离该蛋白质，对该蛋白 质进行N端氨基酸序列分析，推断出相应的 核苷酸序列。将中分离出cDNA克隆 。
三、 抗体-agarose beads复合物洗涤： 四、 鉴定
免疫共沉淀技术的应用
肿瘤 酶与病毒 信号传导 寄生虫
免疫共沉淀技术的优点与局限性
优点：
与蛋白质亲和层析一样，检测的产物 是蛋 白质的粗提物；
抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的 浓度存在，避免了过量表达所造成的人为效 应；
蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在； 复合物以天然状态存在，蛋白的相互作用 可以在天然状态下进行，可以避免人为影响， 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复 合体.
异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶 液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影 响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
异丙醇： 优点：所需容积小且速度快，适用于浓度低， 而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选 择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、 tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下 长时间放置。
缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在 DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的 乙醇漂洗DNA沉淀数次。
乙醇：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少， DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实 验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效 沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍.
实验流程
（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适
量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶
抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于 4°C， 最大转速离心30 min后取上清；
（2）取少量裂解液以备Western blot分析，
剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解
液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；
局限性:
需要多克隆抗体或mAb，因而对大规模筛 选未知蛋白会遇到障碍。
免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合 物为直接相互作用的两种蛋白。
用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合 适，与Western blotting或者ELISA相比容易出 现假阳性反应。
灵敏度不如亲和色谱高。
不适于检测构成巨大、不溶性的大分子结 构的蛋白质一蛋白质相互作用。
（3）取10μl prot000 rpm离心3 min；
（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖
珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中
4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼 脂糖珠偶连；
（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000