生物化学实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定

实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定

一、目的要求

学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。

二、实验原理

酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。

核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。

三、器材与试剂

1〉材料

酵母粉。

2〉器材

乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。

3〉试剂

(1)

0.04mol/L氢氧化钠溶液。

(2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。

(3)95%乙醇。

(4)乙醚。

(5)

1.5mol/L硫酸溶液。

(6)浓氨水。

(7)

0.1mol/L硝酸银溶液。

(8)三氧化铁-浓盐酸溶液：

将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl

3·6H

2O配制)加入到400ml浓盐酸中。

(9)苔黑酚乙醇溶液：

溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。

(10)定磷试剂。

a.17%硫酸溶液：

将17ml浓硫酸(比重

1.84)缓缓加入到83ml水中。

b.

2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。

c.10%抗坏血酸：

将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。

临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰

2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。

四、实验步骤

1〉RNA提取

将10g酵母悬浮于90ml

0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml 锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。

2〉鉴定

取200mg提取的RNA，加入

1.5mol/L硫酸溶液10ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。

(1)嘌呤碱：

取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1mL

0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。

(2)核糖：

取一支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液

0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。

(3)磷酸：

取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min，观察若溶液变成蓝色，说明有磷酸存在。

五、结果处理

记录现象并解释。

现象：

(1)与硝酸银反应生成了少量的银化合物沉淀。

(2)反应后沸水浴，溶液变成绿色。

(3)反应后沸水浴，溶液变成蓝色。