基因突变的蛋白质效应

母源性3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症临床及基因突变分析

【摘要】目的报告5例母源性3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（maternal 3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD），通过基因突变分析证实其临床诊断。方法将串联质谱新生儿筛查发现3-羟基异戊酰肉碱（C5-OH）增高的5例新生儿及其母亲纳入研究。用尿气相色谱质谱分析进行MCCD临床诊断；基因突变检测及功能分析明确诊断。结果（1）发现5例无症状母亲血C5-OH浓度明显增高，尿3-羟基异戊酸、3-甲基巴豆酰甘氨酸增高，诊断为良性MCCD。其新生儿血C5-OH浓度增高，3例随访后浓度逐步下降或达正常。（2）发现4种MCCC1基因新变异：c.ins1680A（25%）、c.203C>T/p.A68V、c.572T>C/p.L191P、c.639+5G>T和2种MCCC2基因突变c.1406G>T/p.R469L（新变异）及 c.592C>T/p.Q198X。新变异可能影响蛋白结构和功能。结论对筛查血C5-OH增高的新生儿母亲应常规检测以诊断母源性MCCD。MCCC1基因突变多见。

【关键词】3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症；3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶；基因突变；质谱分析

3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（3-Methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD）（OMIM 210200/210210）是一种亮氨酸代谢障碍所致的常染色体隐性遗传的有机酸代谢缺陷病，1970年由Eldjarn等首次报道[1]。因基因MCCC1（MIM*609010）或MCCC2（MIM*609010）突变导致亮氨酸代谢途径中3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶（3-Methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase，MCC）缺乏，3-甲基巴豆酰辅酶A不能转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A而堆积，导致血3-羟基异戊酰肉碱（3-hydroxy-isovalerylcarnitine，C5-OH）增高、尿3-甲基巴豆酰甘氨酸（3-methylcrotonyl-glycine，3-MCG）和/或3-羟基异戊酸（3-hydroxy isovalerate，3-HIVA）代谢产物增多。患者的临床表型变异较大，多数无症状，少数可表现为严重的神经系统受损[2]。

部分发达国家于20世纪90年代初应用串联质谱（tandem mass spectrometry，

MS/MS）开展新生儿筛查，统计显示MCCD发生率约为1/36 000[2-4]。国内研究相对滞后，我们自2003年起率先在国内开展MS/MS新生儿筛查，对血C5-OH 浓度增高的新生儿，常规对其父母进行MS/MS分析，迄今已发现5例母源性MCCD。而国内除个别MCCD病例报道外[5-6]，尚未见母源性MCCD及基因研究报道。本文报道5例母源性MCCD临床、生化表型及转归，以及基因突变分析结果，以从分子生物学水平证实其临床诊断。

1 对象与方法

1.1 对象2003年至2012年9月，我们对491 700名新生儿采用MS/MS进行遗传代谢病筛查，发现60余例新生儿血C5-OH浓度高于正常切值0.6 mol/L，对其父母进行MS/MS分析，发现5例母亲（22 ~ 31岁）血C5-OH浓度明显增高（5.11 ~ 21.77）μmol/L，其中4例伴游离肉碱（free carnitine，C0）降低（

2.6 ~ 6.76）μmol/L。5例母亲平素体健、孕期及分娩均无临床症状；分娩的新生儿筛查时血C5-OH浓度增高（1.63 ~ 11.43）μmol/L，临床无症状（表1）。

1.2 方法

1.2.1 临床诊断及随访：（1）采用尿气相色谱质谱仪（gas chromatography mass spectrometry，GC/MS）对血C5-OH增高相关的有机酸代谢病进行诊断与鉴别诊断；（2）生物素酶活性测定以排除生物素酶缺乏；（3）生化检测包括乳酸、血氨、肝肾功能、血气、酮体等；（4）每3月~ 1年对5例新生儿随访，评估临床症状、生长及智能发育等，复查血MS/MS、尿GC/MS，了解临床转归。

1.2.2 基因分析

1.2.2.1基因突变检测在知情同意的原则下，采集外周血抽提父母及新生儿、50个正常对照者基因组DNA；参考文献[7]和Primer Premier 5软件设计引物，扩增MCCC1基因19个外显子和MCCC2基因17个外显子及两端内含子序列；按常规方法和反应条件进行PCR扩增、测序，Chromas软件进行突变分析（参考MCCC1 GenBank：NM_020166.3；MCCC2 GenBank：NM_022132.4）。

1.2.2.2基因新变异分析：（1）正常对照者100个等位基因的相关片段测序分析以排除多态性可能。（2）PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）：采用BstXⅠ、AlwNⅠ两种限制性内切酶对

c.203C>T/p.A68V、c.572T>C/p.L191P错义突变酶切分析。（3）逆转录PCR测序：提取患者RNA，经试剂盒TaKaRa PrimeScript® RT Master逆转录成cDNA进行测序分析，以验证剪切突变c.639+5G>T。（4）采用软件Clustal（1.81）对不同物种MCCC1和MCCC2氨基酸序列比对分析，以了解新型错义突变位点氨基酸的保守性。（5）PolyPhen-2（http//genetics.bwh.harvar

/pph2）、SIFT （/）、UniProt（/）和PDB （/pdb/home/hom

e.do）软件分析新变异是否对蛋白质的结构和功能产生影响。

2 结果

2.1 临床诊断及随访

2.1.1 母亲MCCD诊断5例母亲血MS/MS检测结果显示C5-OH浓度增高或伴C0降低，血异戊酰烯肉碱、丙酰肉碱、丙酰肉碱/乙酰肉碱浓度均正常；4例尿GC/MS结果显示3-MCG增高为2.18 ~ 272，3-HIV A增高为

3.86 ~ 499（表1），无3-羟基丙酸、甲基枸橼酸、3-羟基-3-甲基戊二酸、3-甲基戊烯二酸、2-甲基-3-羟基丁酸及酮体等排出；生物素酶活性正常；根据上述排除其它C5-OH增高相关的有机酸代谢病，结合临床无症状，诊断为良性MCCD。

2.1.2 子女诊断及随访5例新生儿筛查时血C5-OH浓度（1.63 ~ 11.43）μmol/L，出生2周召回时降至（1.01 ~ 9.37）μmol/L（下降36.14%），2例尿GC/MS分析显示3-HIV A或3-MCG略高，结合临床无症状、生化检查正常，诊断为母源性MCCD。例1和例2分别于生后2.2岁及4月随访时，血C5-OH降至正常；例4生后1.5月末次随访时，血C5-OH由11.43 μmol/L降至 5.81 μmol/L（下降49.17%）；例2生后3周复查尿GC/MS时，尿3-HIV A降至正常；例4尿3-MCG 仍微量排出；余2例未复查血尿。所有新生儿末次随访年龄（1-38）月时仍无临床症状，生长及智能发育正常。

2.2 基因分析

2.2.1 基因突变4例母亲及子女接受了基因分析：突变检出率为87.5%（7/8）；共检出4种MCCC1突变：其中c.ins1680A突变频率最高，占25%（2/8），其他3种为c.203C>T/p.A68V、c.572T>C/p.L191P以及c.639+5G>T，均未见报道。共