ngs与其他检测序技术流程的对比图文
NGS与高通量测序技术2
限制性内切酶
The phage infection cycle
Restriction of invading phage DNA
限制性内切酶的发现
1960s, concept Type I enzyme
1970, Type II enzyme
1971, SV40 cleavage
限制性内切酶的应用
毛细管电泳测序法
四、第一代测序技术与应用
• 全基因组测序 • 人类基因组计划（HGP）
第一个被全基因组测序的生命 (1995)
Haemophilus Influenza’s genome
Craig Venter Hamilton Smith
The timeline of the Human Genome Project
流感嗜血杆菌，1995 果蝇，2000 人，2001 蚊子，2002 老鼠，2002
ABI 3730 XL DNA Sequencer 96/384 DNA sequencing in 2 hrs, approximately 600-1000 readable bps per run. 1-4 MB bps/day A human genome of 3GB need 750 days to finish
样品准备的自动生产线
The whitehead institute
内容延伸：Craig Venter
内容延伸：人造生命
Synthia 1.0, 901 genes
Syn 2.0, 525 genes
Syn 3.0, 475 genes
The human genome draft
Nature. 2001 Feb 15; 409(6822):860-921 Science. 2001 Feb 16; 291(5507):1304-51
《NGS基础培训》课件
2023《ngs基础培训》课件contents •ngs基本概念及发展历程•ngs工作原理及测序技术•ngs在临床疾病研究中的应用•ngs在生物进化研究中的应用•ngs在环境科学中的应用•ngs技术在未来医学中的应用前景目录01ngs基本概念及发展历程下一代测序技术(NGS)是一种高通量的生物学技术，可以对基因组进行大规模、并行、快速、准确的测序。
NGS技术具有高速度、高通量、高灵敏度、高准确性、低成本和可重复性等优点。
ngs定义与特点ngs发展历程人类基因组计划完成了人类基因组的初步测序。
2005年2007年2010年2012年第一台下一代测序仪(Solexa)问世，标志着NGS时代的到来。
测序技术的快速发展，使得一天内能够完成人类基因组的测序。
单分子测序技术(PacBio RS)的出现，打破了基因组测序的限制。
ngs应用领域生物进化研究等药物研发和个性化治疗罕见疾病研究遗传疾病诊断和预防肿瘤诊断和治疗02ngs工作原理及测序技术总结词双端测序技术是NGS中应用最为广泛的技术之一，可以有效测定生物体基因组的变异情况。
详细描述双端测序技术是一种基于高通量测序平台的技术，它可以从生物体的两端同时进行测序，从而获得基因组的正反方向序列。
这种方法可以大大提高测序的精度和效率，同时减少测序成本。
双端测序技术总结词单端测序技术是一种简单有效的NGS技术，适用于对特定基因或DNA片段进行深入研究。
详细描述单端测序技术只对DNA的一条链进行测序，因此可以快速获得大量序列数据，并且可以有效降低测序成本。
但是这种方法无法测定基因组的整个序列，需要结合其他技术进行分析。
单端测序技术序列组装和基因组构建是NGS技术的关键环节，对于后续的基因组分析和研究至关重要。
详细描述序列组装是将测序得到的数千个序列片段进行拼接和排列，从而得到完整基因组序列的过程。
基因组构建是在序列组装的基础上，根据生物体的基因组结构特点构建基因组图谱的过程。
《NGS基础培训》课件
诊断罕见遗传病
通过分析患者的基因变异，对罕见的遗传病进行确诊和病理 分析。
预测遗传风险
通过对家族遗传史的研究，预测患者或亲属患某种遗传疾病 的风险。
肿瘤个性化治疗
靶向治疗
通过基因测序找到肿瘤的特异基因变异，设计个性化治疗方案，提高治疗效 果和减少副作用。
免疫治疗
分析肿瘤细胞的免疫逃逸机制，为患者提供更加精准的免疫治疗。
单细胞RNA测序
通过对单个细胞进行RNA测序，研究细胞异质性和基因表达的复杂性，具有 更高的灵敏度和分辨率。
单细胞DNA测序
通过对单个细胞进行DNA测序，研究基因组变异和遗传多样性，具有更高的 灵敏度和分辨率。
空间转录组测序技术
空间RNA测序
通过对组织样本进行空间定位，研究基因表达的空间分布和细胞异质性，为研究 复杂的生物组织提供新的工具。
VS
详细描述
序列组装是将测序得到的数千至上百万条 序列拼接成较大片段的过程，需要使用高 效的算法和计算资源。基因组构建是在序 列组装完成后，利用生物信息学手段将获 得的基因组组装成完整的图谱。这些步骤 对于研究生物体的基因组变异、基因结构 和功能等具有重要意义。
03
ngs在临床医学中的应用
遗传疾病的诊断与预测
数据质量控制与处理
数据质量评估
采用FASTQC等工具对数据质量进行评估，确保数据质量符 合要求。
数据过滤与去噪
使用Trimmomatic、Novoalign等工具进行数据过滤和去噪 ，以提高数据质量。
基因变异检测与注释
基因变异检测方法
采用SOAPsnp、GATK等工具进行基因变异检测，并依据SNP位点在基因组 上的位置进行注释。
《ngs基础培训》课件
NGS基础培训课件
利用生物信息学工具对高质量序列 数据进行比对、组装、变异检测等 分析，以获得基因组组装、基因注 释、变异检测等结果。
03
ngs相关技术
短读长测序技术
总结词
高效、快速、简便
详细描述
短读长测序技术是一种高效的基因测序方法，其使用高通量的测序仪对基因组进行测序。该技术具有快速、简 便等优点，可以在短时间内完成大量基因组的测序。短读长测序技术一般使用聚合酶链式反应(PCR)扩增特定 的DNA片段，然后对这些片段进行测序。
长读长测序技术
总结词
高分辨率、低误差率
详细描述
长读长测序技术是一种基因测序方法，该技术使用一 种名为"连接酶"的酶将DNA片段连接起来，然后对这 些连接后的DNA片段进行测序。长读长测序技术具有 高分辨率、低误差率等优点，可以更准确地检测基因 变异和染色体结构变异。该技术在基因组组装、基因 注释和疾病研究等方面具有广泛的应用。
临床应用合规性挑战
01
总结词
02
详细描述
03
总结词
临床应用合规性是NGS技术在 医学领域应用中必须考虑的重 要因素。
临床应用合规性包括多个方面 ，如伦理审查、数据安全和隐 私保护、检测标准和流程等， 需要严格遵守相关法规和标准 。
应对临床应用合规性挑战需要 从多个角度进行考虑和规范， 包括制定完善的技术规范和标 准、加强监管和审查力度等。
检测方法
通过对肿瘤组织样本进行NGS 检测，分析肿瘤细胞的基因变
异情况，如EGFR、BRAF、 KRAS等。
适用人群
适用于肿瘤患者，特别是需要 进行靶向治疗、免疫治疗等个
性化治疗的患者。
检测目的
帮助医生确定治疗方案、判断 预后和复发风险。
如何读懂一份NGS检测报告 PPT培训课件
I-II类变异有详细解读
➢ Ⅲ类变异（尚无相关临床证据） ➢ IV类变异（已知无临床意义，报告未列）
The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 19, No. 1, January 2017
CAPP-seq
Guardant 360
5000X 40000X
<0.01%
读懂NGS报告，最后了解 报告是否真实可靠
靠谱的NGS报告：清晰明了的检测信息+详细的质控信息
送检临床样本，却出现质控不过关的情况？
单基因异常分析—罕见耐药突变EGFR L747P
患者基本信息： 61岁男性患者，吸烟史30年，120支/年；病理 诊断：腺癌；IV期，多处肋骨及脊柱转移。
燃石NGS液体活检结果提示为EGFR L747P
治疗方案： 一线， 六个周期的培美曲塞+顺铂化疗，PD。
二线，EGFR-TKI（厄洛替尼）1个月，PD。 带有EGFR-L747P突变的NSCLC对于TKI不敏感
NGS应用的局限性
读懂NGS报告，你首先需要知道 报告核心信息有哪些？
核心结构
➢Summary小结 ➢体细胞突变 对应有何药物？ ➢胚系突变 遗传风险？ ➢TMB/MSI等结果 免疫治疗获益？ ➢质控 样本是否符合要求
1：总体小结
信息提取
临床信息：肺癌，血浆样本 有临床意义变异：NTRK基因融合 肿瘤突变负荷：7.9个突变/Mb 胚系致病变异：无 样本质量评估：合格
CDH1(40~83%)、STK11(29%)、BMPR1A、SMAD4、MUTYH、MLH1/MSH2/MSH6/PMS2/EPCAM、SDHA、SDHB(77%)、SDHC、 SDHD(86%)、SDAF2、MET、PDGFR、KIT
(完整版)NGS简介
Pacbio测序原理
Pacbio测序原理
Pacbio测序原理
Pacbio测序原理
Oxford Nanopore
MinION 它是基于电信号而不是光信号的测序技术！
MinION最大的特点:除了极小的体积之外，就是数据 将是可实时读取的，并且起始DNA在测序过程中不被 破坏！
成簇
二代测序核心技术之一：桥式扩增
Illumina测序原理
桥式扩增
搭“桥”： DNA链与周围Oligo 通 过碱基互补配对结合
Illumina测序原理
PCR扩增： 以DNA链为模版 以新结合的Oligo为引物
变性
结果：一条DNA链变成两条
Illumina测序原理
继续桥式扩增
Illumina测序原理
基因测序技术简介
主讲人：徐德阳
目录
一、测序技术发展与比较 二、illumina测序原理 三、Pacbio测序原理
全基因组测序的英文是Whole Genome Sequencing，简称WGS，目前默认指的 是人类的全基因组测序。 所谓全（Whole），指的就是 把物种细胞里面完整的基因组序列从第1个DNA开 始一直到最后一个DNA，完完整整地检测出来，并排列好，因此这个技术几乎 能够鉴定出基因组上任何类型的突变。
Hale Waihona Puke 第一代DNA测序技术用 的是1975年由桑格（Sanger） 和 考 尔 森 （ Coulson ） 开 创 的 链 终 止 法 ， 以 及 19761977 年 由 马 克 西 姆 （ Maxam ） 和 吉 尔 伯 特 （ Gilbert ） 发 明的化学法（链降解）。
在 1977 年 ， 由 桑 格 老 人家测定了第一个基因组序 列——噬菌体phiX-174。
NGS简介
结合方式：碱基互补配对原则
Index
Illumina测序原理
延伸
RCR扩增
模版：杂交结合链 引物：Oligo
Illumina测序原理
变性
Original template： 与Flowcell 氢键连接， 不稳定 Newly synthesized strand： 与Flowcell 磷酸二酯键 连接，稳定
http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03-EstructuraDelGenoma/animaciones/secuencia.swf
目录
一、测序技术发展与比较 二、illumia测序原理
测序流程
I测序流程
cBot
Illumina测序原理
测序芯片—Flowcell
Lane：八条相对独立通道 两端小孔：进液孔与出液孔
Oligo：DNA小片段，通过化 学键连接在Flowcell上， 能与两端碱基互 补配对oligo
Illumina测序原理
杂交
变性：双链DNA变 为单链DNA， 杂交在Flowcell上
第一代 DNA 测序技术用 的是1975年由桑格（Sanger） 和考尔森（ Coulson ）开创 的 链 终 止 法 ， 以 及 19761977 年由马克西姆（ Maxam ） 和吉尔伯特（ Gilbert ）发 明的化学法（链降解）。 在 1977 年 ， 由 桑 格 老 人家测定了第一个基因组序 列——噬菌体phiX-174。
Illumina测序原理
成簇
二代测序核心技术之一：桥式扩增
Illumina测序原理
桥式扩增
搭“桥”： DNA链与周围Oligo 通 过碱基互补配对结合 PCR扩增： 以DNA链为模版 以新结合的Oligo为引物
临床NGS全流程共识——样品处理和实验室检测流程
临床NGS全流程共识——样品处理和实验室检测流程/live/webinar_play_new/454.html真实世界”——院内NGS检测数据对比研究NGS比对工具/u/5927786455划重点1. 没有精准检测就没有精准医疗，目前临床基因检测实验室尚没有统一标准，部分仍沿用科研标准进行临床检测，亟需规范化，特别是技术细节、质量控制、质量评价的具体内容；2. 实验室首先应遵守临床相关国内文件规范要求，实行分区，遵守生物安全要求；样本采集、运输与存储应根据不同样本类型进行操作，见文中表格归纳；3. 质量控制包括核酸质控、文库质控、测序数据质控，特别是文库构建需评估试剂有效性，测序需评估不同试剂批次和固定时间间隔下的仪器损耗的稳定性；4. 样本追踪包括性别一致性鉴定和SNP一致性鉴定；至少添加一个阳性质控、一个阴性质控或空白对照与常规样本同时检测进行质量评价。
重临床NGS全流程共识的由来△图：基因检测联盟（筹）历届会议合影（来源/基因慧）二代测序（NGS）已广泛应用于遗传病的临床检测。
同时遗传病基因检测流程长、环节多、技术含量高，基因检测行业亟需在检测全流程规范化方面建立共识。
为推进基因检测行业的健康有序发展，配合相关部门和临床遗传专家组制订规范并落地实施，基因检测联盟（筹）组织临床专家、遗传学家以及第三方基因检测机构开展研讨会和指定行业共识。
2017年10月在深圳召开首届临床基因检测标准和规范研讨会，会后参会专业人士共同编写《临床基因检测报告规范与基因检测行业共识探讨》，于2018年2月发表在《中华医学遗传学杂志》（点击详情）。
2019年5月在上海召开第二届基因检测联盟会议，会后形成《遗传病二代测序临床检测全流程规范化共识探讨》（简称“临床NGS全流程共识”）发表在近期的《中华医学遗传学杂志》（点击详情）。
临床NGS全流程共识涵盖技术要点和质量控制等，分为四个部分：1）遗传检测前流程；2）样品采集处理及检测；3）数据分析流程；4）检测报告解读和遗传咨询。
NGS简介ppt课件
Illumina测序原理
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Ilumina测序原理
cBot
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测序芯片—Flowcell
Lane：八条相对独立通道 两端小孔：进液孔与出液孔 Oligo：DNA小片段，通过化
学键连接在Flowcell上， 能与两端碱基互补配对oligo
Illumina测序原理
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杂交
Illumina测序原理
变性：双链DNA变 为单链DNA， 杂交在Flowcell上
Index
结合方式：碱基互补配对原则
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延伸
RCR扩增
模版：杂交结合链 引物：Oligo
Illumina测序原理
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变性
Original template： 与Flowcell 氢键连接， 不稳定
Newly synthesized strand： 与Flowcell 磷酸二酯键 连接，稳定
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第一代DNA测序技术用 的是1975年由桑格（Sanger） 和 考 尔 森 （ Coulson ） 开 创 的 链 终 止 法 ， 以 及 19761977 年 由 马 克 西 姆 （ Maxam ） 和 吉 尔 伯 特 （ Gilbert ） 发 明的化学法（链降解）。
在 1977 年 ， 由 桑 格 老 人家测定了第一个基因组序 列——噬菌体phiX-174。
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基因测序技术简介
主讲人：徐德阳
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目录
一、测序技术发展与比较 二、illumina测序原理 三、Pacbio测序原理
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全基因组测序的英文是Whole Genome Sequencing，简称WGS，目前默认指的 是人类的全基因组测序。 所谓全（Whole），指的就是 把物种细胞里面完整的基因组序列从第1个DNA开 始一直到最后一个DNA，完完整整地检测出来，并排列好，因此这个技术几乎 能够鉴定出基因组上任何类型的突变。
基因测序的前世今生（一代测序,二代测序,三代测序最详原理）
测序技术的前世今生测序技术的发展历程第一代测序技术（Sanger测序）第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）,在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
原理：ddNTP的3’无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
第二代测序技术(NGS)第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。
其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。
1.illuminaIllumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75%以上，以HiSeq系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4步：步：1）构建DNA测序文库测序文库DNA分子用超声波打断成200bp-500bp长的序列片段，并在两端添加上不同的接头。
2）测序流动槽（flowcell）结构：Flowcell是测序的载体，课吸附DNA文库，每个flowcell有8条lane，每个lane有2镜头课捕获荧光信号。
panel全外显子组与全基因组测序的全方位对比
14
捕获探针供应商
国外较大的提供杂交捕获探针库的供应商
Agilent SureSelect
Roche NimbleGen
IDT xGen™
Twist Bioscience Human Core Exome
国内
迪赢生物
15
靶向捕获与冗余数据
液相杂交捕获技术流程图
冗余数据的产生
同源序列
目标序列
同源序列干扰
panel大小约1-2M，约占全外显子的1%-2%左右
2
检测范围与测序深度
全基因组测序 全外显子组测序 不孕不育panel
30-40X 100-150X 500X以上
3
检测方案的选择
WGS
WES panel
panel和WES，临床上如何选择？
panel具有更低廉的价格，更高的测序深度 WES具有更广泛的检测范围
表型遗传异质性较高，疾病 复杂，难以区分，需要对大 量基因进行筛查，更适合 WES或WGS。
PMID: 29398702
5
检测方案的选择
神经系统疾病/发育异常类疾病
精子异常导致的男性不育
智力障碍
小儿癫痫
线粒体病
行为异常 遗传代谢病
神经肌肉病
基因数量多达2000个以上，表型异质性高，症 状难以区分，容易误诊，更适合WES/WGS
WGS包含所有碱基，可以检测 CNV和非编码序列 panel可定制检测范围，可以加 入WES不包含的目标区域
WES测序深度还不足以区分真 假基因，深度更高的panel却有 可能做到。
23
安捷伦各版本WES对比
靶标 大小
设计 大小
V8
35.1 Mb 41.6 Mb
ngs与其他检测序技术流程的对比图文
NGS技术特点及优势
精准度高 检测全面
高通量测序
世和的技术在单次检测中对每个碱基覆盖600 次以上，杜绝假阳/阴性结果
单次检测中同时发现多个基因的多种突变 包括 单碱基突变、碱基缺失、碱基插入和基因融合
上一代传统基因检测
技术局限，假阳/阴性错误率高
单次反应只能针对一种突变进行检 测，并只能检测一种突变类型
分析
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Copyright © 2013. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.
荧光原位杂交(FISH)检测——以HER2为例
FISH检测乳腺癌细胞HER2扩增代表性图例
无扩增
无扩增
高倍扩增
扩增
DNA序列测定的意义
DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如 在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因 表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求 对DNA一级结构的详细了解。
1、成本较高 2、引入PCR过程会在一定程 度上增加测序的错误率，并且 具有系统的偏向性，同时读长 也比较短 3、对数据注释和报告解读要 求高
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点突变、小片段插入/缺失
点突变 扩增 融合/重排 插入/缺失
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NGS与液体活检结合可有效解决传统检测面临的挑战
• 高敏感度检测 低丰度突变
组织、胸水、 ctDNA
下一代测序技术简介ppt课件
PPT学习交流
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各个测序平台的特点总结
ABI SOLiD
1. 无以伦比的通量 目前SOLiD 3系统单次运行能产生50 GB的人基因组序列数据，相当于基因组的
PPT学习交流
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Illumina测序原理 Illumina合成测序原理
PPT学习交流
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Illumina测序流程
PPT学习交流
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桥式PCR
PPT学习交流
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合成法测序
PPT学习交流
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数据读取
PPT学习交流
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ABI SOLiD测序原理 ABI SOLiD连接测序原理
PPT学习交流
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PPT学习交流
7p的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头 的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。
PPT学习交流
的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3…”组成的SOLiD原始颜色序列。
PPT学习交流
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各个测序平台的特点总结
Roche 454
454平台的突出优势是读长。目前454系统的序列读长已超过400 bp。虽然454平 台的测序成本比其他平台要高很多，不过对于那些需要长读长的应用，如从头拼 接和环境微生物组学，它仍是最理想的选择。
PPT学习交流
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Roche 454测序步骤 四、emRCR
PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于 后续的步骤。
NGS与感染性疾病的精准治疗ppt课件
三、三代测序
美国太平洋生物的单分子实时技术及英 国牛津纳米孔公司的纳米孔单分子测序 技术
特点是不需要进行PCR扩增，通过不同 手段区分碱基信号差异，直接读取序列 信息，其读长长、高通量，可以对RNA 和甲基化DNA序列进行直接测序
39
四、缺点
目前还存在错误率高、成本较高 和生物信息分析软件不够丰富等 缺点。
2000年之后推出的高通量测 序平台很好地解决了这个问 题，人类基因组测序的成本 直接因此下降50000倍
产生了一个新的名词：NGS
5
一、NGS是什么？
（一）传统的测序方式
大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、 聚合酶克隆（Polony Sequencing）、 454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、 Illumina (Solexa) sequencing、 ABI SOLiD sequencing、 离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、 DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等
30
真菌
通过建立本地真菌基因组学数据并 对比分析，不仅可以进行真菌感染 快速准确诊断，还能够发现不同真 菌特有的功能性基因，研究其致病 机制及药物耐药位点突变，发现新 的药物作用靶位点，从而开发具有 广谱、不良反应低、无交叉耐药性 31 的抗真菌药物。
2011年5月以德国为中心，欧 洲暴发了一次严重的出血性肠道 感染，科学家对病菌菌株进行全 基因组测序，发现致病元凶为致 死性的大肠埃希菌O104：H4， 通过对序列的分析推断其感染人 体的途径和致病机制，溯源追踪 了其感染路径，为疫病的诊断和 治疗提供了重要信息。
学习时间丨测序技术简介及对比——二代测序
学习时间丨测序技术简介及对比——二代测序▍内容参考/优医智库▍作者/学者方海英导读二代测序技术由于其解决了原有测序技术的弱点，一跃而上成为了基因测序应用的新宠。
其最大特点在于，测序通量达到了数量级的提高；得益于其通量提升，测序的边际成本显著下降，因此，以人类基因组为代表，对大量基因进行序列的测序成本也产生了指数下降的成果。
了解你手中的工具，是迈向成功必不可少的环节。
在基因检测上，了解测序相关的技术及其特点，并在合适的情境下运用合适的技术，是在保证检测有效性的前提下将总体成本最优化的必备技能之一。
图 1测序技术发展历程与技术比较[1]前面的两期已经对一代测序技术之中的qPCR以及桑格测序做了初步介绍。
两者虽然足够满足基本的分子病理学检测或基因测序需求，但是对于多基因的综合测序分析就开始力不从心；并且如果规模进一步扩大，成本与时间的指数增长就成为了一代测序的阿喀琉斯之踵。
根据美国国立卫生研究院（NIH）国家人类基因组研究院（NHGRI）的数据，人类全基因组测序计划于1990年立项，耗时13年才得以初步完成，耗资达到27亿美元[2]。
在该项计划初步完成之后，如何缩短测序所需时间，降低测序成本，就成了一个重要的发展方向。
在NHGRI发起的降低测序成本的计划刺激下，发展出了一系列的二代测序技术（NGS）。
图 2每百万碱基DNA序列测序成本演变[3]对于大规模的基因组测序来说，2011年时间点上，桑格测序法的平均成本为每百万碱基约500美元，而二代测序已经将平均测序成本压到了每百万碱基0.5美元以下[4]。
目前，二代测序技术已经将人类基因组测序成本压到了1000美元，上机测序时间48小时以下[5]。
二代测序技术相比于一代测序而言，总体上有数个共通的，大的改进。
首先，比起一代测序主流上通过细菌质粒克隆的方法对DNA碎片进行前期克隆处理，二代测序普遍使用了无细胞系统进行NGS建库的前期准备；这样可以排除质粒中克隆载体序列的干扰[6]。
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荧光原位杂交 (FISH) 检测——以 HER2 为例
FISH 检测乳腺癌细胞HER2 扩增代表性图例
无扩增
无扩增
高倍扩增
扩增ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
DNA序列测定的意义
DNA 的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如 在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因 表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求 对DNA一级结构的详细了解。
免疫组化染色
原理：根据 抗原抗体反应 和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合， 再利用一抗与标记生物素、 荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根 过氧化物酶 （HRP）或碱性磷酸酶 （AKP）等的抗生物素（如链霉 亲和素 等）结合，最后通过 呈色反 应或荧光 来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内 发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分 布和含量。
桑格测序原理
? 原理：利用 DNA聚合酶，以待测 单链DNA 为模板，以 dNTP为底物，设立四种相互独 立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的 双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP ）作为 链延伸终止剂。
? 在测序引物引导下，通过高分辨率的变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离， 放射自显影 检测 后，合成链序列 ，由此推知待测模板链的序列 。
检测方法
优势
劣势
AMRS-PCR
荧光原位杂交 FISH 免疫组化 IHC
1、灵敏度 3%-10% 2、扩增和检测同时进行，封 闭的体系，减少污染的可能性
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Sanger测序的流程
结果解读
ARMS法检测
扩增阻碍突变系统(ARMS) -又称等位基因特异性扩增（ASA），利用PCR引 物的3' 端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位 基因特异性 PCR扩增引物。
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四色荧光判别ATCG 四种碱基
?激光超高分辨率照相机
?Miseq 为首个FDA批准临床的
高通量测序仪
?国际NGS 高分文章，绝大多数 使用Hiseq 平台
新一代高通量测序 (NGS)能同时检测不同形式的基因突变
Marc Ladanyi. 2015 ASCO Annual Meeting 18
检测方法比较
免疫组化是从蛋白层面看问题的，与测序不同，一个是因（ DNA），一个是果 （Protein ），所以体内出现一些未知突变，如果对蛋白功能产生影响，也是可以看出来 的。
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荧光原位杂交（FISH）
? 定义：荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 是通过荧光标记的 DNA探针与细胞核内的 DNA 靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种 分子细胞遗传学技术。 它的基本原理是：如果被检测的染色体或 DNA 纤维切片上的靶 DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性 -退火-复性，即可形成靶 DNA与核 酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可 利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在 镜下对待测 DNA进行定性、定量或相对定位分析。
ARMS（ASA）的特点是： “只有在引物3'碱基与模板配对时才能出现 PCR扩增带，野生型的不扩增”
优势 ? ? ?
不足 ? ?
灵敏度高，重复性好，对标本突变率要求底 操作简单，仪器费用较低廉 检测时间短
仅能检测已知突变类型 不能得到具体碱基突变类型
数字微滴PCR (ddPCR )
通过将微量样品扩大倍数稀释和分液 (partitioning)，直至每个样品中所含有 的待测分子数不会超过 1个，再将所有样品在相同条件下进行 PCR扩增，并对 发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。
数字 PCR
检测方法介绍
? 免疫组化（ IHC） ? 荧光原位杂交（ FISH） ? 桑格测序（ Sanger 测序法）
检测方法的介绍 ? 扩增阻滞突变（ ARMS）-PCR法
? 数字PCR（ddPCR ） ? 二代测序
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DNA 序列分析（ sanger 测序、 ARMS 法、二代测序）等 - 针对肿瘤的癌基因 /抑癌基因、生长因子及受体 , 以及肿瘤相关的某些染色体
位点异常的检测
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组织病理学检查仍是癌症诊断的“金标准”
AC
SC
SCC
LC
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肿瘤病理诊断治疗已进入个体化分子时代
免疫组化
FISH
二代测序
肿瘤
一代测序
ARMS
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ddPCR的工作流程
新一代高通量测序 (NGS)的原理
原理是在Sanger测序方法 的基础上，用不同颜色的 荧光标记四种不同的dNTP。 通过碱基互补配对原则逐 一的添加标记过的dNTP， 每添加一种dNTP就会释放 出不同的荧光，根据捕捉 的荧光信号并经过特定的 计算机识别、转换，从而 生成相应的序列信息。
临床常用诊断技术
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肿瘤诊断方法
影像学诊断 ：超声， CT，MRI ，PET，PET-CT 组织细胞形态学诊断 ：
- HE染色 - 辨别肿瘤细胞及分型 免疫组化诊断 ： - 利用抗原抗体结合反应原理 - 针对蛋白类肿瘤标记物（癌胚抗原，糖类抗原， 甲胎蛋白等）的检测 - 鉴别组织来源 分子诊断 ： - 荧光原位杂交（ FISH）、基因探针及标记、多聚酶链式反应（ PCR）、