ngs与其他检测序技术流程的对比图文

免疫组化染色
原理：根据 抗原抗体反应 和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合， 再利用一抗与标记生物素、 荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根 过氧化物酶 （HRP）或碱性磷酸酶 （AKP）等的抗生物素（如链霉 亲和素 等）结合，最后通过 呈色反 应或荧光 来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内 发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分 布和含量。
分析
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荧光原位杂交 (FISH) 检测——以 HER2 为例
FISH 检测乳腺癌细胞HER2 扩增代表性图例
无扩增
无扩增
高倍扩增
扩增
DNA序列测定的意义
DNA 的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如 在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因 表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求 对DNA一级结构的详细了解。
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ddPCR的工作流程
新一代高通量测序 (NGS)的原理
原理是在Sanger测序方法 的基础上，用不同颜色的 荧光标记四种不同的dNTP。 通过碱基互补配对原则逐 一的添加标记过的dNTP， 每添加一种dNTP就会释放 出不同的荧光，根据捕捉 的荧光信号并经过特定的 计算机识别、转换，从而 生成相应的序列信息。
检测方法
优势
劣势
AMRS-PCR
荧光原位杂交 FISH 免疫组化 IHC
1、灵敏度 3%-10% 2、扩增和检测同时进行，封 闭的体系，减少污染的可能性
桑格测序原理
? 原理：利用 DNA聚合酶，以待测 单链DNA 为模板，以 dNTP为底物，设立四种相互独 立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的 双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP ）作为 链延伸终止剂。
? 在测序引物引导下，通过高分辨率的变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离， 放射自显影 检测 后，合成链序列 ，由此推知待测模板链的序列 。
免疫组化是从蛋白层面看问题的，与测序不同，一个是因（ DNA），一个是果 （Protein ），所以体内出现一些未知突变，如果对蛋白功能产生影响，也是可以看出来 的。
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荧光原位杂交（FISH）
? 定义：荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 是通过荧光标记的 DNA探针与细胞核内的 DNA 靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种 分子细胞遗传学技术。 它的基本原理是：如果被检测的染色体或 DNA 纤维切片上的靶 DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性 -退火-复性，即可形成靶 DNA与核 酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可 利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在 镜下对待测 DNA进行定性、定量或相对定位分析。
DNA 序列分析（ sanger 测序、 ARMS 法、二代测序）等 - 针对肿瘤的癌基因 /抑癌基因、生长因子及受体 , 以及肿瘤相关的某些染色体
位点异常的检测
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组织病理学检查仍是癌症诊断的“金标准”
AC
SC
SCC
LC
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肿瘤病理诊断治疗已进入个体化分子时代
免疫组化
FISH
二代测序
肿瘤
一代测序
ARMS
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四色荧光判别ATCG 四种碱基
?激光超高分辨率照相机
?Miseq 为首个FDA批准临床的
高通量测序仪
?国际NGS 高分文章，绝大多数 使用Hiseq 平台
新一代高通量测序 (NGS)能同时检测不同形式的基因突变
Marc Ladanyi. 2015 ASCO Annual Meeting 18
检测方法比较
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Sanger测序的流程
结果解读
ARMSHale Waihona Puke Baidu检测
扩增阻碍突变系统(ARMS) -又称等位基因特异性扩增（ASA），利用PCR引 物的3' 端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位 基因特异性 PCR扩增引物。
ARMS（ASA）的特点是： “只有在引物3'碱基与模板配对时才能出现 PCR扩增带，野生型的不扩增”
优势 ? ? ?
不足 ? ?
灵敏度高，重复性好，对标本突变率要求底 操作简单，仪器费用较低廉 检测时间短
仅能检测已知突变类型 不能得到具体碱基突变类型
数字微滴PCR (ddPCR )
通过将微量样品扩大倍数稀释和分液 (partitioning)，直至每个样品中所含有 的待测分子数不会超过 1个，再将所有样品在相同条件下进行 PCR扩增，并对 发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。
数字 PCR
检测方法介绍
? 免疫组化（ IHC） ? 荧光原位杂交（ FISH） ? 桑格测序（ Sanger 测序法）
检测方法的介绍 ? 扩增阻滞突变（ ARMS）-PCR法
? 数字PCR（ddPCR ） ? 二代测序
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临床常用诊断技术
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肿瘤诊断方法
影像学诊断 ：超声， CT，MRI ，PET，PET-CT 组织细胞形态学诊断 ：
- HE染色 - 辨别肿瘤细胞及分型 免疫组化诊断 ： - 利用抗原抗体结合反应原理 - 针对蛋白类肿瘤标记物（癌胚抗原，糖类抗原， 甲胎蛋白等）的检测 - 鉴别组织来源 分子诊断 ： - 荧光原位杂交（ FISH）、基因探针及标记、多聚酶链式反应（ PCR）、