原位杂交自己整理
原位杂交步骤自己整理的精讲
原位杂交步骤自己整理的精讲原位杂交是一种常用的实验方法，可以用来检测DNA或RNA序列在细胞或组织中的分布情况。
这种方法可以帮助研究人员确定基因在染色体上的位置，并研究基因的表达和调控。
下面是原位杂交的详细步骤：1.样品处理：首先，需要提取并处理样品中的细胞或组织。
这一步骤通常包括细胞固定、组织切片和蛋白酶处理等。
细胞固定能够保持细胞的形态和结构，而组织切片则能够使得样品更容易进行观察和分析。
蛋白酶处理的目的是通过消化蛋白质来提高核酸的可达性。
2.探针设计：在进行原位杂交之前，需要准备一个能够与目标DNA或RNA序列互补配对的探针。
这个探针通常是由DNA或RNA序列构建而成的，可以通过人工合成或PCR扩增获得。
在设计探针时，一般要考虑到探针的长度、碱基组成和互补性等因素。
3.标记探针：为了便于后续的检测，需要将探针标记上报告标记物。
常用的报告标记物有荧光染料、放射性同位素和酶等。
标记探针的方法通常包括非放射性标记和放射性标记两种方式，具体选择哪一种方法取决于实验的需求和要求。
4.杂交反应：将标记好的探针与样品中的DNA或RNA序列进行杂交反应。
这种反应通常在固定样本上进行，样品和探针会在适当的杂交缓冲液中反应一段时间。
杂交反应的温度和时间会根据探针的长度和互补性等因素进行调节。
反应结束后，通常需要进行洗涤以去除未结合的探针和杂交缓冲液。
5.可视化和分析：经过洗涤之后，探针与目标DNA或RNA序列杂交形成的杂交体可以通过其中一种方法进行可视化和分析。
常用的方法包括荧光显微镜观察、放射性测量和酶活性检测等。
通过这些方法，可以确定目标序列在样品中的分布情况和数量。
除了上述的基本步骤，还可以根据实验的具体要求进行一些改进和优化。
例如，可以采用双标记法来同时检测不同序列的分布情况；可以使用探针混合标记法来提高检测的灵敏度和特异性；可以用信号扩增技术来增加检测的信号强度等。
总体来说，原位杂交是一种常用的实验方法，可以用于研究基因的定位和表达。
原位杂交(修改稿)
核酸分子杂交概述 核酸分子杂交，简称分子杂交 （molecular hybridization）,是指一定条件 下，两条来源不同按其碱基互补的配对原则 通过氢键形成杂合（异质）双链的过程，这 是一项利用DNA变性――复性原理而设计的 极其重要的分子生物学技术。 （DNA－DNA杂交）（RNA－RNA杂） （DNA－RNA杂交）。
ii. 随 机 引 物 延 伸 （ Random primer extension）法 随 机 引 物 延 伸 法 是 从 单 链 DNA 或 RNA合成高比例活性的放射性同位素（ 如 32P）标记探针所选用的方法。其原理 是使被称为随机引物(primer)的长6~8个核 苷酸的寡核苷酸片断，与变性的DNA或 RNA模板随机互补结合（退火）。
第一节
原位杂交组织化学的分子 生物学基础
一、 核酸的分子结构
一） 核酸的化学组成
表1：核酸的化学组成
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ嘌呤碱
DNA RNA 腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G) 腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)
嘧啶碱 胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T) 胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U) 戊糖 酸 脱氧核糖 磷酸 核糖 磷酸
二）核酸的一级结构
把50％DNA分子发生变性的温度称为变性温 度或融解温度（Tm）。 （1）DNA的均一性：病毒DNA，解链发生在 很窄的Tm值范围，动物细胞DNA其Tm值的范围较 宽。 （2）DNA分子中（G＋C）的含量： （二）DNA的复性 变性的DNA只要消除变性条件，两条互补 链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一 过程成为复性。 变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构，因此 复性过程又叫作退火。
（4）杂交时间短：由于寡核苷酸链短， 其序列较简单. （5）特异性强 （6）使用简便：合成的寡核苷酸探针 性质上是脱氧核糖核酸，所以对RNA酶 不敏感，因此比RNA探针更稳定;杂交时 不需预先加热解链。
原位杂交
原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。
其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。
原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。
这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。
该技术最早应用于6 0年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。
但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。
整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。
原位杂交实验步骤
原位杂交实验步骤原位杂交实验呀，就像是一场精心编排的舞蹈。
首先呢，得准备好舞台，也就是标本的处理。
这就好比给舞者们准备一个合适的场地，要把标本固定好，让它稳稳地待在那儿，可不能在中途出啥岔子。
接下来，就是探针的准备啦。
这探针就像是舞蹈的主角，得精心挑选和设计。
它要能准确地找到自己的目标，和标本上特定的序列结合。
然后，杂交这一步可太关键啦！就像舞者们在舞台上的精彩互动。
让探针和标本在合适的条件下相遇、结合，产生奇妙的反应。
之后呢，要进行信号的检测。
这就好比要看到舞者们的精彩表现呈现出来的效果。
通过各种方法，让杂交后的信号能够清晰地被我们看到。
再说说洗片这一步吧，就像是给舞台打扫干净。
把多余的杂质、干扰都去掉，只留下最精彩的部分。
整个过程中，每一步都得小心翼翼，就跟跳舞时每个动作都要精准到位一样。
要是哪一步出了差错，那可就像舞蹈中出现了失误，会影响整个演出的效果呀！做原位杂交实验，还得有耐心。
不能着急忙慌的，得一步一步慢慢来。
就像跳舞，不能一下子就跳到结尾，得按照节奏，一个动作一个动作地来。
而且呀，实验环境也很重要呢。
温度啦、湿度啦，都得控制好，这就好比舞蹈的灯光、音响，得配合得恰到好处，才能让整个表演更加完美。
想象一下，如果标本处理得不好，那后面的步骤不就都白费啦？或者探针没准备好，那还怎么去找到目标呢？所以啊，每一步都不能马虎，都得认真对待。
这原位杂交实验，可不就是一场科学与技术的精彩舞蹈嘛！咱可得把这场舞跳好，跳出精彩，跳出成果来！这就是原位杂交实验的步骤啦，大家可都得记住咯！。
斑马鱼的原位杂交技术
斑马鱼的原位杂交技术整理人邵明:将特定时期的斑马鱼胚胎在多聚甲醛中C4%4o固定过夜第一天：、洗1PBST2x5min、剥膜2、洗3PBST5min可选步骤蛋白酶处理前的胚胎不处理(: K: 24hpf, 24hpf-的胚胎蛋白酶处理分钟以后的胚胎处理半小时48hpf10ug/ml K15, 48hpf,然后洗PBST3x5min)、C5min4hyb- 65o孵育、C4h（可选步骤: 可将胚胎置于hyb+中-20oC长期储存）5hyb+ 65o孵育、加探针(探针孵育置于冰上65oC10min, 5min, 655oC-孵育过夜65oC先将然后使用).第二天：、回收探针, I2x30min1（探针可以重复使用10次以上）洗液孵育探针的温度、洗液孵育探针的温度2II 1x15min、洗液孵育探针的温度3III 2x30min、室温4MABT 3x5min、封闭液孵育室温5 4h、AP, 4oC (-20oC, 61:2500 Anti DIG-稀释于封闭液中孵育过夜稀释好的抗体保存于可重复使用3次以上。
)第三天、回收抗体1、2MABT 2x30min3、PBST 2x30min、平衡缓冲液左旋咪唑4+0.5mg/ml （60mg/ml左旋咪唑储液稀释120倍）孵育10min、显色液中孵育直到信号足够强为止。
5试剂配方固定液: 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde）in 1XPBSWeigh 2 g PFA and dissolve it in 50 ml 1XPBS. (PFA is hard to dissolve.) Incubate the mixture at 65oC for around 2 hours. Shake the mixture during the incubation). After dissolved, the solution is stored at 4oC.10XPBS stock solution: mix 76 g NaCl, 9.9 g Na2HPO4, 3.6g NaH2PO4. Dissolve them in less than 1 liter nanopure water, adjust to pH7.0 and a final volume of 1 liter. Autoclave for 35 minutes to sterilize.130 mM NaCl = 10 X 0.13 X 58.44=76 g NaCl7 mM Na2HPO4 = 10 X 0.007 X 142 = 9.9 g Na2HPO43 mM NaH2PO4 = 10 X 0.003 X 120 = 3.6 g NaH2PO4Paraformaldehyde (PFA) (Mallinckrodt 2621).（注意所用的试剂有没有结晶水）Proteinase K (Sigma P-2308); Stock solution (10 mg/ml = 10 ug/ul): weigh 10 mg proteinase K and dissolve in 1 ml nanopure water. Aliquot 50 ul each and store at -20oC. Thaw at room temperature before usage. Long storage may appear to see white precipitate after thawing. V ortex the tube and make sure the precipitate be mixed evenly.20XSSCFor 1 liter: 1 X 3 mol = 3 X 58.44 =175.3 g NaCl1X 0.3 mol = 0.3 X 294.1 = 88.2 g Na3.Citrate.2H20adjust pH=7 using HCl. autoclave 35 minutes for sterilizeization.（注意所用的试剂有没有结晶水）Yeast RNA: dissolve 50 mg RNA in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oC肝素（Heparin） (Sigma H3393): dissolve 50 mg heparin in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oCMAB X 2 liters pH7.5100 mM Maleic acid (Sigma M-0375) = 23.2 g (2 X 0.1 X116.1)150 mM NaCl = 17.5g (2 X 0.15 X 58.44)add solid (? g) to adjust pH=7.5, autoclave for 35 minutes to sterlize.Blocking regent (1096 176, Boehringer Mannheim, now Roche?). 10% stock solution. Weigh 10 g blocking regent and dissolve it in 100 ml MAB, shaking and heating in a microwave oven for 1 minutes (?), autoclave for 25 minutes and then aliquot into 14 ml and store at -20oC.50mg/ml 酵母RNA：称取2g酵母RNA干粉（生工），加入40ml去离子水，超声振荡溶解，-20oC保存。
(整理)原位杂交手册.
第1章共用程序引言：本章介绍了本实验最基本的实验程序，包括中期染色体制片；质粒的转化与DNA 的提取；探针标记检测以及基因组总DNA的提取第1节原生质体染色体制片试剂：饱和a-溴萘、0.075MKCl、固定液（新鲜3：1甲醇冰乙酸）、酶解液（20%纤维+2%果胶酶）、IN HCl、95%酒精实验步骤：浸种室温下浸种约一天（也可1-2h）发芽培养皿中垫湿滤纸三层，利子分散其上，间留间隔，勿堆积，种子上层覆盖一层水浸湿的滤纸，25-30℃下发芽，每天水洗一两次，约2-3天可取根。
NOTE：换水是很重要的，水不能过多，以不留流动水为好，水分过多易长芽而根长不好。
预处理方法1：根长至1.5-2cm长时切取1.5mm 左右的根尖，饱和a-溴萘约25℃处理2-3小时，水稻一般不预处理。
方法2：根长好后将种子置于4℃冰箱处理一个晚上，第二天在25℃下恢复2-3h，也可得到许多分裂相。
NOTE：何进取根尖最好具随机性，与季节以及细胞分裂时期很有关系。
（玉米8:00AM，水稻11:00-12:00AM）水洗反复几次前低渗ddH2O或0.075M KCl（0.6KCl溶于100ml ddH2O）低渗30min（室温）。
固定新鲜3∶1甲醇冰乙酸固定2-3小时或4℃过夜。
NOTE：一定要用新鲜固定液；如果用于石蜡切片组化显色，甲醇固定的材料会导致很高背景，应换用4%多聚甲醛。
水洗反复几次，洗净。
酶解2%纤维素酶+2%果胶酶混合（1∶1），28℃下处理3小时左右。
NOTE：酶解是最至关重要的一步，首先是酶的质量，很多酶都可导致分裂相少，以SERV A公司的果胶酶为最好，根据材料不同，酶解时间会有所变化。
洗载片载片一定要干净，以防材料脱落和保持清洁的背景。
洗片步骤：1）IN HCl中3min以上2）自来水洗（每片单独漂洗）接着用双蒸水洗3）95%酒精浸泡30min以上（每片单独放入）制片小心吸去酶液，水洗几次，吸取1-2个根尖于干净的干载玻片上，滴半滴固定液，用镊子敲至浆状，滴2-3滴固定液使材料分散，火烤至着火。
原位杂交步骤整理
1.石蜡切片：每组一个蜡块，切片厚度5-6μm
2.脱蜡入水
3.DEPC水洗5min*2（1500ul/1500ml）
4.蛋白酶K消化，37℃，10-15min，DEPC水洗5min。
5.2×SSC平衡20min*1,DEPC 5min*2
6.42℃预杂交2h，切片上每个组织50μl，湿盒内（至少30min）(冰柜里面放的白色的液体就是预杂交液，标的H的）
7.沸水中变性探针，5min，立即冰浴（防止探针复性），放冰盒内（用预杂交液稀释）
8.稀释探针浓度为1-8ng/μl，(3ng/ul左右)切片上每个组织30μl，42℃过夜，湿盒内A:56ng/ul
9. 2×SSC洗两次，每次 5min
10.0.5×SSC洗两次，每次15min
11.马来酸洗一次，5min。
12.封闭液（由TBS溶解粉剂至1%）孵育60min，不洗。
（用马来酸稀释封闭液1:9）100/900(冰柜黄色液体)
13.用封闭液稀释生物素化抗地高辛抗体：混匀后50μL/片加至标本片上。
置样品于湿盒中，37℃反应120分钟。
0.5/500(上面稀释好的)
14.马来酸洗10分钟×3次。
15.detection buffer 5min*1
16.nbip 显色1ml加20μl（用detection buffer 稀释）时间3个小时以上。
（避光）
17.苏木素轻度复染。
蒸馏水洗。
脱水，透明，封片。
原位杂交（整理）
原位杂交（整理）Double color ISH protocol for medaka fish使用DNA或者RNA针来探检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。
ReagentsFor fixation:固定吐温PTW: 1x PBS (DEPC treated, or autoclaved 1hr), pH 7.5, add Tween20 to 0.1% and sterile filter (0.2 μm, nitrocellulose).多聚甲醛焦碳酸二乙酯4% PFA: dissolve 4% paraformaldehyde in PBS (DEPC treated) by stirring and heating to 65°C, add dropwise 1 M NaOH until the solution gets clear (check pH ≈ 7.5, important), cool to room tem perature and store at 4°C (for up to 4 weeks, or -20?C for months(For embryos: after 2 days fixation, stored in 50% Formalmide/PBS -20?C till dechroined) ProceduresSample preparation1) Fresh tissues (2mm thick slices) are taken out, punctuate with needle or take off the membrane,2) fix in 4% PFA (DEPC PBS, pH 7.5) overnight3) 25% methanol 10-20 min4) 50% methanol 10-20 min5) 75% methanol 10-20 min6) 100% methanol 120 min或store at -20度for several months7）75% methanol 10-20 min8）50% methanol 10-20 min9）25% methanol 10-20 min10）PBS 2X10 min11）30% sucrose (DEPC-treated PBS) overnight12) OCT over 120 min13) 4-5 um for testis, 8-10 um for ovary14）incubate at 37 度4h or overnight15) store at -80度1. RNA probe preparation1)linearize 10 μg of template (0.5-1kb better) with a suitable enzyme allowing as transcription(blunt or 5-prime overhang should be preferred to avoid snap back effects, Xho1, BamH1, Not1, EcoR1 can be used, SacII and sac1 should be avoided)2)Control for a complete digest on an agarose gel.3)Purifying template from enzyme and digestion buffer by phenol（苯酚）: chloroform（氯仿）extraction,2-propanol precipitation（异丙醇沉淀）, dissolved in DEPC treated H2O.4)Add in the following order to a total volume of 20 μl (10μl is Ok and template can bedoubled, which can produce more probe! If use PCR products, 200 ng is ok)linearized template（PCR products）1 μg（1μl）10 m M NTP with Dig-UTP/Fluorescein-UTP 2 μl10xTranscriptionbuffer 2 μlDEPC H2O ad 13 μlRNA-Polymerase 2 μl（Enzyme Mix ：Buffered 50% glycerol containing RNA polymerase, RNase Inhibitor, and other components ）NOTE：（1）模板和Transcriptionbuffer先混匀后再加RNA-Polymerase（2）RNA-Polymerase中已经含有T7和Rnasin，所以不需再加Rnasin5) Incubate for 2 hrs at 37°C and check by electrophesis （电泳可不做）(If 10 ul then add 10ul DEPC H2O and 1ul for checking)6) Add 1ul mRNA transcription buffer (or not) and 1ul Turbo RNase-free DNase, incubate at37 C for 15 minutes7) Purify the probe by LiCl methods according to the manual of the Ambion mRNA Kit: Stop the reaction and precipitate the RNA by adding 30 μL Nuclease-free Water（or not）and30 μL LiCl Precipitation Solution, incubated at -20℃at least 2hrs(overnight). Centrifugeat 4°C for 15 min at maximum speed to pellet the RNA.Carefully remove the supernatant.Wash twice with 500 ul-1ml 70% ETOH removal of unincorporated nucleotides. Add 30-50 μL Nuclease-free Water, dilute the probe in Nuclease-free Water to a final concentration of 200ng/ul.8) dilute the probe in deionized formamide to a final concentration of 100ng/ul and store at–80°C.2. HybridizationReagents:Heparin（肝素）: make a stock of 50 mg/ml in H2O, store at -20°C (0.5g,10ml) Hybridization Mix: 50% deionized formamide, 5xSSC, 50 μg/ml heparin, 0.1%Tween20, 500μg /ml torula RNA, store at -20°C, 0.5M Citric Ac id(0.96g,10ml,相对分子质量192). For 50 ml of Hyb-Mix:stock Hyb-mixDeionized Formamide 100 % 25 mlSSC 20 x 12.5 mlHeparin solid 2.5 mg(50μl)Torula-RNA (Sigma) solid 25mg(0.025g)Tween20 100% 50μlCitric Acid 0.5M 900μl(Then no need to adjust the pH and it is about 6.3)H2O(DEPC) ad 11.5 mlpH 6.0-6.5 (important)PREHYBRIDIZATIO N（预杂交）1) incubate at 37 度to dry the slides2) 3X10 min DEPC-PBS（TSA protocal，need 0.3%-3%H2O2 treatment10-60min）3) 10μg/ml Proteinase K ,37 ℃3-5min (20mg/ml Proteinase K to 10μg/ml,1mlDEPC+0.5μl 20mg/ml Proteinase K)4) 4% PFA,4℃,5min5) 3X10min DEPC-PBS6）2X5 min TEA+AA (536 ul TEA(三乙醇胺)+ 160 ul HCl + 100 ul AA（乙酸苷）in 40 ml PBS, fresh prepared)7）2XPBST,5min8) Incubate >1hr at 65o in HYB- (DO THE HYB- AND HYB+ AT 55o IF YOU ARE ALSO DOING THE ANTIBODY PROTOCOL).（or at 68o if the background is high）HYBRIDIZATION（杂交）1) Take off all but not dry the sample2) Add HYB+ (HYB- plus Dig- and Fluorescein –labeled probes) to the samples (30-50 ul/slides, 1ng/ul for CISH, or 0.1-0.2ng/ul for TSA) ,已加甲酰胺至探针终浓度为100ng/μl3) Put a coverslip（盖玻片）to the sample carefully.4) Incubate overnight at 65oC,水浴(or 55o if with antibodyprotocol)Note: It is better to optimize the probe concentration with BCIP/NBT before doing TSA, and as usual, the probe for BCIP/NBT can be diluted into 1/5~1/10 for TSA.3. WashesReagents:4xSSCT: dilute 20xSSC to 4xSSC and add Tween20 to 0.1% （50ml 4X SSCT,10ml 20X SSC+40ml DEPC+50μl Tween）all steps are performed in a water bath, all wash solutions are prewarmed（预热）t o 65°C 1) wash section 2 x 30 min in 2 ml 50% formamide（甲酰胺）/2xSSCT at 65°C(10mlformamide+10ml 4X SSCT)2) wash section 15 min in 2 ml 2xSSCT at 65°C(50ml 2X SSCT,25ml 4X SSCT+25mlDEPC)3) wash sections 2 x each 30 min in 2 ml 0.2xSSCT at 65°C(50ml 0.2x SSCT,2.5ml4XSSCT+47.5ml DEPC)4. Detection（检测）Cool down the sample and rinse（漂洗）with 1xPBST 2-3 times 5min and maleic acid buffer 2 times 5min before blocking.Detection of DIG probe:1)Block for at least 1 hour at RT with 150mM maleic acid, 100mM NaC1 (pH 7.5) plus blocking reagent (2% Roche Blocking Reagent) + 2% BSA. (5-10% Roche Blocking Reagent stored at -20度，aliquot)2)2)Add anti-DIG AP as supplied by Boehringer at a 1:2000 dilution in 1% Roche Blocking Reagent3) Incubate 4h @ RT or 4oO/N （if overnight, decrease to 1:3000 or 4000) ）4)Wash 4 x 20’ in 1x maleic acid buffer (optional) and 1 x 10’ with Tris buffer (Shaking) (0.1 M Tris-Hcl, pH9.5, 100 mM NaCl)5)Incubate IN NBT/BCIP (200 ul stock solution in 10 ml Tris buffer at 4 度overnight or for one week （for some low level expression genes）6) stop color reaction ( 10 mM Tris-HCl, 1 mMEDTA)7) PBS washDAPI/PT STAINING AND MOUNTING1) Wash 2 x 5 min with PBS2) Add 1-5 uL 1mg/ml DAPI/PI to 1xPBS 1000uL and stain for 5-10 min3) Wash 5x 1’ 1 x PBS at RT4) Mounting with anti fade reagent（防褪色剂）(glycol（乙二醇）: antifade=1:1better )(Invitrogen and keep at-20℃ for 1 month but never leave it at 4℃ too long)Detection of DIG probe:1) Block for at least 1 hour at RT with 150mM maleic acid, 100mM NaC1 (pH 7.5) plus blocking reagent (2% Roche Blocking Reagent) + 2% BSA.2) Add anti-DIG POD as supplied by Boehringer at a 1:2000 dilution in above Solution3) Incubate 4h @ RT or 4oO/N4)Wash 4 x 20’ in 1x maleic acid buffer (optional) and 3 x 10’ with PBST and 3x 10’ withPBS (Shaking)5)Discarding the PBS and Incubate 45'-60’ in TSA plus Tetramethylrhodamine Solution(Spin down TSA substrate before making staining solution.For the reaction, dilute tyramide reagent 1:50 in amplif. diluent buffer)6)Wash 3 x 10’with PBST or drop in 1xPBS 4℃O/N.Note: the FITC should be detected first for H2O2 will not affect fluorescein and Alexa-647).DAPI STAINING AND MOUNTING1)Wash 2 x 5 min with PBS2) Add 1-5 uL 1mg/ml DAPI to 1xPBS 1000uL and stain for 5-10 min3) Wash 5x 1’ 1 x PBS at RT4) Mounting with anti fade reagent (Invitrogen and keep at-20℃ for 1 month but never leave it at 4℃ too long)。
原位杂交技术（insituhybridization,ISH）
原位杂交技术（insituhybridization,ISH）我们常说，科学家也是艺术家，在明确真理探索科学的道路上，往往会创造出很多极具美感的艺术作品，比如下面的这些实验结果图，美吧~---Olson, B. D. and Downes, G. B.---in situ Hybridization of wild type Drosophila embryos所以今天小笔为大家介绍的就是能做出这种美美图的新技能，原位杂交实验~基本原理简单点说就是碱基互补配对原则。
官方来讲的话，就是我们将外源核酸（也就是常说的分子探针）与组织、细胞上待检测的DNA或RNA进行配对，形成核酸杂交分子，再经过一定手段将这个杂交分子的位置显示出来。
实验技术的更新是很快的，在明确了该技术的可行性后，科学家进一步改进并进行分类，主要有以下几类：荧光原位杂交技术：DNA分子原位杂交技术；在原技术手段上增加了荧光元素，技术手段较为先进，易掌握，运用广泛，一会儿小编会着重介绍哦~毕竟，能够在我们自己的实验中运用上，才是我们的最终目标嘛。
多彩色荧光原位杂交技术：显而易见，是荧光原位杂交的升级版，采用多个荧光来检测，目前的发展及运用也是较多的。
原位PCR：将原位杂交结合PCR技术发展起来的实验方法。
说实话，了解的比较少，我就不班门弄斧了，呵呵。
基因组原位杂交技术：该技术在我们的领域可能运用的毕竟少，主要是根据物种DNA同源性差异实现，在农作物等的杂交育种上运用较广，我就不详细介绍啦~明确了以上的分类及原理后，接下来小编主要讲讲在我们的领域中运用较广的荧光原位杂交方法。
结合示意图可以更好的理解哦~实验材料（重要的，基础材料不赘述）1. 4%多聚甲醛（1x PBS配置）：固定剂2. 蛋白激酶K：使得靶核酸暴露，增加探针和靶核酸结合。
3. 杂交缓冲溶液实验步骤取材：动物组织取材（小鼠采用心脏灌流法）后在4%的多聚甲醛中固定4小时左右， 1x PBS洗5次，每次30分钟，用25%蔗糖脱水过夜（均在4°进行）。
原位杂交步骤自己整理的精讲
荧光原位杂交试剂及其配制方法（以下试剂均需用RNase-free水配制）：1×PBS：NaCl 8g∕L、KCl 0.2 g∕L、Na2HPO4 1.44 g∕L、KH2PO4 0.24 g∕L，溶于DEPC处理的去离子水中，用pH 计测其pH，再用NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加入千分之一的DEPC，37℃，12h放置，高温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r∕m）上，待其全部溶解后，用棕色瓶分装成小体积包装，保存于－20℃。
（注：本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采用上述方法使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因，除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过一定量的纯水（或双蒸水）中，测定其pH(放置一段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值至7.4，定容至所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的水其pH会下降，故本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将无水甲醇按75%（V／V）比例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将无水甲醇按50%（V／V）比例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将无水甲醇按25%（V／V）比例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free水（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸水，用浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使用前加入0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需高温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
原位杂交方法
原位杂交方法
1. 原位杂交方法啊，那可真是个神奇的技术呢！就好比我们在一个大迷宫里找特定的宝藏，原位杂交就是我们的寻宝地图啊！比如说在研究细胞的基因表达时，原位杂交能精准定位那些特别的基因，厉害吧！
2. 嘿，原位杂交方法呀，不得了哦！这就像是你有了一双超级眼睛，能清楚看到细胞里那些隐藏的秘密！像是在寻找特定疾病的基因标记，原位杂交一下就给你找出来啦，神不神奇？
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4. 哇哦，原位杂交方法啊，这可不简单！就好像是有个魔法棒，能在细胞里施魔法找到关键信息！在研究癌症的成因时，原位杂交能帮我们发现那些捣蛋的基因，是不是很厉害呀！
5. 原位杂交方法，这可真是个厉害的家伙！跟侦探在破案一样，能从细胞中找到关键线索！像是要弄清楚一个基因的具体位置，原位杂交就能大显身手啦，真棒棒哒！
6. 嘿呀，原位杂交方法，那绝对是牛哄哄的！就像给细胞做了个特别标记，一下子就能找到我们要的东西！比如探寻某种遗传病的起源，原位杂交就能发挥大作用，太赞了吧！
7. 原位杂交方法啊，真的太神奇啦！可以类比成在细胞的宇宙中精确航行呀！当想揭示某个基因的功能时，原位杂交就好比是引航员，超强的呢！
8. 原位杂交方法简直太重要啦！它就像是打开细胞奥秘大门的钥匙，能让我们深入了解细胞的世界。
可以说，没有原位杂交方法，很多细胞领域的研究都难以开展呀！在我看来，原位杂交方法是现代生物学不可或缺的强大工具！。
原位杂交步骤自己整理的精讲
荧光原位杂交试剂及其配制方法（以下试剂均需用RNase-free水配制）：1×PBS：NaCl 8g∕L、KCl 0.2 g∕L、Na2HPO4 1.44 g∕L、KH2PO4 0.24 g∕L，溶于DEPC处理的去离子水中，用pH 计测其pH，再用NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加入千分之一的DEPC，37℃，12h放置，高温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r∕m）上，待其全部溶解后，用棕色瓶分装成小体积包装，保存于－20℃。
（注：本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采用上述方法使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因，除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过一定量的纯水（或双蒸水）中，测定其pH(放置一段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值至7.4，定容至所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的水其pH会下降，故本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将无水甲醇按75%（V／V）比例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将无水甲醇按50%（V／V）比例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将无水甲醇按25%（V／V）比例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free水（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸水，用浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使用前加入0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需高温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
原位杂交-DIG要点
原位核酸分子杂交技术原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。
这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。
可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。
原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。
临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。
随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。
第一节原位核酸分子杂交技术的发展原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。
与此同时，Buongiorno Nardelli 和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。
Orth(1970)3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等特点，因此研究用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交，引起了许多学者的重视和探索。
原位杂交
• 标记碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶显色
• 优点：完全、方便、省时，敏感性和质 量控制较好，可检测人基因组DNA的单拷 贝基因，背景反差好。
发展简史
• 1991 年 Couton 建立将非放射性标记技 术 更 新 为 亲 和 复 合 物 标 记 技 术 （ Affinity-complex Labelled Probes ， ACLP）。
• 发展趋势：实验室常规技术和临床日常 应用的诊断技术。
原位杂交的基本原理
以DNA分子复制原理为基础。
两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形 成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子，应用带有 标记的（放射性同位素，如 3H 、 35S 、 32P，荧光素生物素、 地高辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与 组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交， 然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察 目的 mRNA或DNA 的存在并定位； 应用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白 质的基因表达。
2.核酸分子的长度：核酸探针的长度控制在50～300bp 3.温度：适宜的复性温度是较Tm值低25℃。 4.离子强度：离子强度过低，不利于复性。 5.核酸分子的复杂性。
RNA原位杂交特点
(1) 使用的探针不同： RNA 原位杂交中多采用 RNA 或寡核苷酸 探针，避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之 间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。cRNA-RNA杂交体比 DNA-DNA 、 cDNA-RNA 杂交体性能稳定，在杂交反应后可用 RNA酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。 (2) 检测的目的不同： RNA 原位杂交检测和分析的主要为内源 性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。以正确 反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发 病机理、观察治疗的疗效和评估疾病的预后等。其次为对外源 性基因检测，以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。而DNA原 位杂交主要为外源性基因检测。 (3)有较高的灵敏度：在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时， RNA原位杂交能获得较好定位。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交实验原理与方法一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。
了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。
原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。
目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。
同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。
非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。
探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。
cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。
原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。
将NDA烘干固定于膜上与32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。
原位杂交技术
原位杂交技术核酸分子杂交技术分子杂交是利用某些分子与另外的一些分子特异结合而形成结合体的过程，狭义指核酸分子杂交即具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。
根据杂交对象位置的不同可分为：固相杂交,液相杂交,原位杂交。
1、固相杂交固相杂交即先将待测单链核酸样品结合到支持物（常用有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然后与溶液中的已知序列的标记探针进行杂交。
固相杂交的特点：固相杂交后，未杂交的游离片段易除去，从而使膜上留下的杂交分子较易检测，并可有效避免靶DNA自我复性。
故固相杂交技术最为常用。
常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。
2、液相杂交液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针于待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。
液相杂交是研究最早的杂交类型，但应用的普遍程度较固相杂交为低。
液相杂交的特点：无需支持物。
待测核酸分子不用固定在支持物上。
其弊端是由于杂交后过量的未杂交探针存在于溶液中，在已有杂交结合物检测水平条件下检测误差较高。
故液相杂交在过去较少应用。
近年来由于杂交检测技术的不断进步，商业检测试剂盒的开发等液相杂交技术得到了迅速发展。
常用的液相杂交类型有：吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交、复性速率液相分子杂交等。
3、原位分子杂交原位分子杂交实际上是固相杂交中的一种形式，杂交过程中待测DNA处于未经抽提的染色体之上，并在原位置上被变性成单链，与探针进行分子杂交。
原位分子杂交与其他杂交技术主要区别在于待测碱基序列位于染色体上。
其主要特点是可以准确定位目的DNA在染色体上的位置。
因此在分子遗传学研究、癌基因定位、遗传性疾病临床诊断方面具有重要而广泛应用。
下面做下具体介绍：1、菌落原位杂交●基本原理：菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。
第七章 原位杂交
原位杂交组织化学
原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry，ISHH）是应用已知碱基 顺序并带有标记物的核酸按碱基配对的原 则进行特异性结合，形成杂交体，然后再 应用与标记物相应的检测系统通过组织化 学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行 细胞内定位。
三、探针的长度 探针的最佳长度应在30～100碱基之 间。探针短，易于进入细胞，杂交率高 ，杂交时间短。 四、探针的浓度 探针的浓度远比组织中靶核酸的浓 度要高。一般为0.5～5.0µ g/ml，通常建议 放射性同位素探针浓度为0.5µ g/ml，非放 射性探针为2µ g/ml。
过量的杂交液含核酸探针浓度过 高，反而导致高背景染色等不良反应。 五、杂交温度和时间 杂交温度应低于杂交体的融解或 解链温度（Tm）20～30℃,大约在30 ～60℃之间,因为在这一温度条件下 进行杂交反应,杂交率最高。一般常 用的杂交温度为42℃左右。
第六节 对照试验 一般应在下述几种对照试验中 选择3～4种以证实杂交结果的可靠 性。 一、 组织对照
（一）Southern或Northern印迹反应
（二）免疫组织化学 如果能获得靶基因产物的抗体 ，可结合免疫组织化学和原位杂交 ，从蛋白质（或多肽）水平和转录 水平在相邻切片或同一切片中证明 蛋白质（或多肽）和相应的mRNA 共存于同一细胞中。
如果细胞直接生长在载玻 片或盖玻片上，则可将长有细 胞的载玻片或盖玻片直接固定， 再按上述方法漂洗、干燥、储 存。
第二节 杂交前处理
杂交前处理主要包括增强组织的通透 性、减低背景染色两个方面。 一、增强组织的通透性和核酸探针的通 透性 增强组织通透性常用去污剂或某些消 化酶处理，通过这种处理，可广泛地去除 蛋白质而增强组织的通透性和探针的穿透 性。
原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制
原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制一、杂交前准备（一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。
DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。
原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。
方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）。
有些试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%～0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀释。
此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。
注意：DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。
②含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。
（二）载玻片的处理组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。
处理方法如下：（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗2～3次，置160℃以上烤箱中烧烤4h以上，或经15磅高压灭菌20mi n。
经以上处理可清除载片上的核酸酶。
（2）HCl处理法试剂: 1M HCL, DEPC 水, 95%乙醇步骤: a. 玻片在室温下于1M HCL中浸泡30分钟b. DEPC水中洗片c. 95%乙醇中洗片d. 空气中干燥e. 重复一遍 a—d.f. 铝箔包好备用.（三）硅化【方法１】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20mi n,等其冷却后,倒掉盐酸。
（2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。
（3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsila ne,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。
原位杂交过程
原位杂交过程
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲原位杂交这档子事儿。
原位杂交啊，就好比是一场细胞世界里的奇妙寻宝游戏。
你想啊，细胞就像是一个藏着无数秘密的大宝藏，而我们要找的特定基因或者核酸
序列呢，就是那宝贝啦！
咱先得准备好各种工具，这就像你去寻宝得带上地图、铲子啥的。
在原位杂交里，我们要有合适的探针，这探针就像是我们的寻宝神器，专
门去识别那些我们要找的宝贝。
然后呢，就是让细胞乖乖躺好，给它们来点儿处理，让它们舒舒服服地等着我们去探索。
这时候，我们就把探针送进去啦！就好像我们拿着
神器在宝藏里这儿找找，那儿探探。
哎呀，你说这细胞里面弯弯绕绕的，找个东西可不容易呢！但咱的探针厉害呀，一旦碰到目标，就像磁铁一样紧紧吸住。
接着，我们得想办法让这个结合变得可视化，这就好比是给找到的宝贝打上高光，让我们一眼就能瞧见。
这整个过程啊，可不能马虎。
每一步都得小心翼翼，就跟走钢丝似的，稍不注意可能就前功尽弃啦！你说这原位杂交是不是挺神奇，挺有意思的？
咱再想想，要是没有原位杂交，我们怎么能知道细胞里那些隐藏的秘密呢？怎么能搞清楚那些基因在里面捣鼓啥呢？这就像你不知道宝藏在
哪里，那不是瞎转悠嘛！
所以啊，原位杂交可是个宝贝技术，能帮我们解开好多细胞的谜团。
咱搞科研的，可离不开它哟！
它就像是一把钥匙，能打开细胞世界的大门，让我们看到里面的精彩。
总之呢，原位杂交这玩意儿，真的是很重要很有趣！大家可得好好了解了解，说不定以后自己也能玩得转呢！。
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一、DEPC水是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水。
经检测不含杂质RNA、DNA和蛋白质。
物理性质分子式：C6H10O5 分子量：162.1 外观：无色液体折射率：1.398（20°C）密度：1.12g/ml 摩尔浓度：6.9M DEPC气味芳香浓烈，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作。
化学性质DEPC对湿气和酸碱敏感，在乙醇和二氧化碳的水溶液中缓慢分解，在155°C自行分解。
DEPC 在氨水中特别不稳定，生成一种致癌的聚氨酯胶的物质。
DEPC对核酸酶有积极地抑制作用。
（主要是对含有-NH，-SH，-OH活性部位的酶起作用）。
使用要点：DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无RNase、DNase和proteinase的反应体系。
通常使用0.1%的DEPC水溶液使Rnase 失活，即1ml DEPC溶于1L纯净水中。
溶解时，DEPC不会很快溶解，开始时以小球的形式存在于溶液中，因此要在搅拌器中搅动直到小球消失为止。
DEPC自行分解成乙醇和二氧化碳很慢，可以通过高压灭菌处理破坏DEPC或水溶液中煮沸15分钟以上。
注意事项保存：避光干燥密闭容器于2-8°C 注：使用时要戴乳胶手套和口罩。
如果不慎溅到皮肤或眼睛，应立即用大量清水冲洗，如果感到不适，就医。
二、DEPC处理枪头：
1、用去离子水配制0.1%的DEPC，避光;
2、将枪头和EP管放入0.1%的DEPC内，保证枪头和EP管内都充满0.1%的DEPC（看自己的操作习惯了，本人是用左手拿住镊子夹住枪头或者EP管，右手使用移液器吸取0.1%的DEPC，将枪头或者EP管内充满0.1%的DEPC）；
3、避光、静置、过夜
4、装枪头和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，将枪头或者EP管内的DEPC水大致去除干净后，装起，包好
5、121摄氏度，30min
6、180摄氏度，干燥数个钟头（三个左右吧，这个时间具体记得不是很清楚了），用前拿出来
注意：处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩！
三、
使用甲酰胺和二甲亚砜（DMSO）一般不会导致高背景。
在杂交液中加入30%二甲亚砜可使T2噬菌体DNA的Tm值比原先降低14℃，而使用酰胺甚至可使DNA在室温下变性和
复性。
有报道反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。
但是不同的实验条件与实验室需要确定自己的杂交条件。
四、Dextran sulfate
DSS Dextran sulfate sodium salt 葡聚糖硫酸钠盐MW：36000-50000
物理性质：白色或灰白色粉末
描述：硫酸葡聚糖是葡聚糖的聚阴离子衍生物，由葡聚糖和氯磺酸的酯化反应形成。
其中含硫量约为17%，相当于葡聚糖分子的每个葡萄糖残糖中平均含1.9个硫酸基团。
重要用途：
·提高核酸杂交率-溶液中含10%的硫酸葡聚糖，DNA链的再退火率约增加10倍，这一现象进一步扩大了单链或双链的探针与固定在膜上的DNA/RNA的杂交率。
不仅如此，添加10%硫酸葡聚糖也许会增加随机切割的双链DNA探针与固定化核酸的杂交率，高达100倍。
·显示免疫相关的活动：
（1）体液免疫的增强和抑制。
（2）B淋巴细胞的多克隆活化作用，甚至可以刺激未成熟的B细胞。
（3）胸腺细胞反应中，促使转化成凝集素。
（4）抑制血液凝固和血小板聚集。
（5）增强血纤维蛋白溶解活性。
（6）增强/抑制细胞介导的免疫应答。
·沉淀低密度（LDL）和极低密度（VDLD）脂蛋白- Mg2+存在的条件下，硫酸葡聚糖沉淀人血清中的低密度脂蛋白，上清液中留下高密度脂蛋白。
利用硫酸葡聚糖的沉淀作用去除脂蛋白这一功能同样可以用来纯化其他材料，如β-2-糖蛋白。
·作为佐剂发挥作用；
溶解度：
溶于水（100mg/ml - 澄清或者轻微模糊的黄色溶液，高分子量的产品在水中的溶解度没有低分子量强）。
灭菌前水溶液应配成缓冲体系（如碳酸氢钠），防止降解。
MP产品价格：
贮藏条件：25℃
五、Tris-HCl
三羟甲基氨基甲烷。
外观：白色结晶水溶性：无色，澄清
毒性：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。
Tris被用于不同pH 条件下的蛋白质晶体生长。
Tris缓冲液的低离子强度特点可用于线虫（C. elegans）核纤层蛋白（lamin）的中间纤维的形成。
Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一，其在电泳缓冲液中与甘氨酸构成缓冲体系，稳定电泳过程中的PH。
此外，Tris还是制备表面活性剂、硫化促进剂和一些药物的中间物。
Tris也被用作滴定标准物。
作为蛋白缓冲液时，若后续工作需要质谱，则不适宜用Tris，最好换成其他质谱仪可耐受的缓冲液。
六、EDTA
乙二胺四乙酸。
EDTA 是一种重要的络合剂。
EDTA是螯合剂的代表性物质。
能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性配合物。
在分子生物学实验中：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。
危险性：作为广泛应用于洗护产品中的EDTA，其刺激皮肤，黏膜，引起哮喘，皮肤发疹的负面作用正在凸现，是一种可能引起过敏的物质，通过丙二醇等透皮吸收剂被摄取后会引起钙缺乏症，血压降低，肾脏障碍，染色体异常和原生变异等一系列有害作用。
储存方法：
1. 禁止阳光直接照射及避免接近热源。
2. 开盖使用后请即刻拧紧瓶盖。
3. 使用时请倒入干燥及干净的器皿中，切勿直接用移液管从瓶中取液。
4. 请于规定有效期内使用。
5. 该产品可于室温保存。
6. 禁止与具有挥发性物质存放在一起。
七、柠檬酸钠：
柠檬酸三钠一般指柠檬酸钠。
二水柠檬酸钠：分子量294.1。