HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化实验一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈）①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。
将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。
）①脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。
使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡①1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡①中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。
①包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡①倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。
），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。
石蜡切片免疫组化步骤.
石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml)5. PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。
肝组织过氧化物酶含量高。
需增加浓度或增长时间。
蒸馏水洗2minx3次8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。
（pv法不需要）9.滴加一抗4℃过夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室温或37℃孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行：二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。
石蜡切片免疫组化操作步骤
石蜡切片免疫组织化学操作流程一、组织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例）1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为350mg/kg动物体重，常用麻醉药物浓度为5%、6%、7%、10%（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率相应较高，本人使用7%浓度，若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）；动物麻醉后，将其固定于灌流操作平台，仰卧位；2.动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）；固定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意）3.动物灌流：C57小鼠25-30g左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液流出：吊瓶灌流——以生理盐水50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min（时间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%多聚甲醛进行灌流，约100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——生理盐水50ml快速推注，后换用4%多聚甲醛50ml缓慢推注。
灌流成功的标志——灌流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；换用4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。
4.开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况）5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分）6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜二、组织石蜡包埋7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片）本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下：自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min →95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备合适体积的石蜡液体，以组织块完全浸没其中为宜）；将透明完成的组织块，尽量沥干多余二甲苯，迅速转入1号烧杯的石蜡液体内（避免包埋窗内产生气泡，气泡若围绕组织块会影响浸蜡过程），依次将所有组织块迅速转入其中，要求组织块要全部浸没在石蜡中，流程如下：1号石蜡2h→2号石蜡2h→3号石蜡2h在每个阶段的浸蜡过程中，可根据时间安排适量的延长浸蜡时间，但尽量不要减少时间9.组织块包埋：包埋前，准备沸水备用；清理干净包埋槽备用；包埋开始时，将装有组织块的烧杯浸入沸水中，防止在包埋过程中，烧杯中的石蜡凝固，具体操作如下：1）用镊子夹取包埋槽在酒精灯预温，控制包埋槽的温度不要过高；2）将烧杯内的石蜡倒入包埋槽内，液面高度刚好没过包埋槽两侧平台3）取出浸泡的组织块，用小镊子过火后夹取组织块放置在包埋槽的凹陷处中心部位，根据切片要求摆放位置，注意在放置过程中避免组织块下面接触包埋槽底部的位置产生气泡，通常在放置前，可将组织块浸没在凹槽内的石蜡中翻滚，使其各面均匀接触石蜡液体，然后放置在正确的位置（此时假如包埋槽预温过高，则会导致组织块在接触槽底面后异常干燥，在整个蜡块凝固后会在干燥处出现凹洞，不利于石蜡块的长期保存）；4）将包埋窗轻轻放置在包埋槽的平台上面，尽量保证两侧高度相同，此时槽内之前的石蜡会浸没部分包埋窗的格栏，静置1-2min（避免倒入热的液体石蜡后，石蜡从包埋窗的边缘流出）；5）静置后，石蜡表面会出现凝固表层，此时再用烧杯中的石蜡填充包埋窗的凹陷处以及靠近边缘的条状凹洞，液面稍高于包埋窗边缘（靠近边缘的条状凹洞一定注意填充石蜡，关乎整个蜡块凝固后与包埋窗结合的紧密程度；石蜡凝固后体积会缩小，避免因液面过低导致的后期包埋窗内部支撑不够）6）静置至少30min，可将包埋后的蜡块从包埋槽内分离（注意分离时，应先清理包埋槽四周的多余石蜡，露出包埋窗与包埋槽接触的边缘，然后从一个角将蜡块撬离包埋槽）三、石蜡切片10.准备工作：蜡块的修整——将组织周边的石蜡在保留操作位置的情况下尽量去除（1-减少石蜡块切面与刀片的接触面积，便于受力均匀，易切出完整切片；2-石蜡切面与刀片接触面积小，会减少刀片接触到蜡块中坚硬杂质的几率，增加刀片的使用寿命；3-接触长度减少，可增加刀片使用次数，通常情况下至少多使用1次）准备器材：40度恒温水浴（温度控制在40-42之间的恒温状态，此温度可使蜡片较长时间保持切片形态，温度较低切片不易展开，温度较高，切片会在短时间内融化，易造成组织变形）切片刀片、包被载玻片、弯镊、毛刷、铅笔、切片盒冰盒（通常情况不需要，在组织脱水透明严重，切片呈粉末状态时，可用冰块冰敷石蜡切面，在短时间内可改善切片表面状态，能够帮助切出3-5片完整切片，只有在前期处理出问题时才使用进行一定程度挽救）切片大致流程：1）安装刀片；将蜡块固定于切片机上，调整蜡块表面与刀片距离，矫正蜡块表面与刀片切线平行；2）调整切片模式为trim-10um进行表面找平，并观察切片状态，调整蜡块角度，使切片左右对称，同时注意观察目标区域出现位置；3）切片调平，并出现合适目标区域，调整切片模式为sect-5um进行切片，获取所需组织切片样本；4）将完整合适的切片，夹取至水浴锅内摊平，左手持载玻片，右手持弯镊辅助，将切片贴于载玻片中，放置在水浴锅边缘进行干燥并做好相应标记；5）将干燥完成切片，按照样本分类放置在一起收于切片盒中备用6）切片完成，清理清片机；剩余组织蜡块，需要在切面表面均匀涂抹融化的石蜡，避免组织块直接与空气接触（不进行封闭，会使组织块在长期的暴露过程中，含水量发生变化，易于与支撑蜡块分离，造成后续再次切片困难）7）切片盒中切片，干燥后可在室温下长期放置，推荐切片完成后及时进行后期组织染色或组织免疫化学孵育。
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。
免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。
HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。
下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。
1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。
4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。
修复液的选择和具体实验要求有关。
5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。
根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。
7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。
8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。
常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。
9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。
HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。
4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。
5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。
石蜡切片制备基本步骤(附HE染色步骤)
石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。
（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml）1000 200 100重铬酸钾（mg）63 120 100蒸馏水（ml）200 200 1000重铬酸钾1200g蒸馏水2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林100ml蒸馏水900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液10ml蒸馏水90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。
滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。
石蜡切片(paraffin sections)免疫组化染色步骤
石蜡切片(paraffin sections)免疫组化染色步骤1、载玻片的处理：抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。
这里选用ZLI-9001 APES、ZLI- 9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。
具体方法如下：（1）APES：现用现配。
将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES 中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。
用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
（2）HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogr ip液中，停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。
（3）Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。
装盒备用。
试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化：（1）胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~4 0分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
（2）胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
（3）皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。
3、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。
抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。
枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其 pH值在6.0±0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
石蜡切片免疫组化染色步骤 -回复
石蜡切片免疫组化染色步骤-回复石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中特定蛋白质的表达和定位。
通过特定抗体的结合，可以在组织切片上形成可见的染色反应，从而了解细胞分布、形态和功能。
本文将一步一步介绍石蜡切片免疫组化染色的详细步骤。
第一步：取材固定首先，需要取得要进行免疫组化染色的组织样本。
可以是新鲜组织，也可以是经过福尔马林或其他适当的固定剂固定后的组织。
固定的目的是固定细胞内蛋白质的结构，以保持其形态和抗原性。
固定过程中要避免产生过度固定，否则可能会破坏细胞结构和抗原的特异性。
第二步：组织脱水和浸渍将固定好的组织样本进行脱水和浸渍。
脱水的目的是去除组织中的水分，使其能够与石蜡充分相溶。
浸渍的目的是使组织均匀地吸收石蜡，以便切片时组织能够坚固并保持形态。
一般的脱水和浸渍步骤包括用不同浓度的酒精进行脱水，然后使用清洁剂和石蜡浸渍组织。
第三步：包埋和切片经过浸渍的组织样本需要进行包埋，以保持其形态和结构。
将组织样本放置在浸渍好的石蜡中，使其充分浸透，然后将其放置在冰上使石蜡固化。
固化后的组织样本可以用切片机切成非常薄的切片，通常是4-6μm。
切片质量对于后续的免疫组化染色非常重要，所以要确保切片的平整和完整。
第四步：切片除蜡和重现组织抗原切片除蜡是为了去除包埋后留在组织切片上的石蜡，以便进行后续的染色。
一般使用酮或甲醇进行除蜡，然后通过多次水洗将组织切片充分清洗。
重现组织抗原则是为了使切片上的抗原能够被抗体检测到。
根据抗原的性质和检测的目的，可以选择适当的方法进行重现组织抗原，如酶解、蛋白酶解或热诱导抗原修复等。
第五步：抗体孵育将免疫组化染色所需的一抗加在切片上，与切片中的特定抗原发生特异性结合。
孵育时间和温度根据抗体的性质和抗原的稳定性来确定，一般在室温下孵育数小时或过夜。
抗体孵育结束后，使用缓冲液或PBS洗涤切片，以去除未结合的抗体。
第六步：二抗孵育和信号检测在一抗的基础上，可以使用与一抗来源不同物种的二抗来进行信号放大。
HE染色加免疫组化方法
组织块石蜡包埋的步骤：1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）*1.0cm*(0.2-0.3cm)2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。
固定时间以12-24h为宜。
（4℃冰箱可放置1-3个月）3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min, 无水乙醇Ⅱ30min。
可将组织放于70%酒精中过夜。
5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。
6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。
先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。
（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。
7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。
（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。
一般切片厚度为4-6μm。
贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。
做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。
HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制：1.Harris苏木精的配制苏木精 1g硫酸铝钾 15g无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
石蜡切片的制作及免疫组织化学标准化操作流程
石蜡切片的制作标准化操作流程1.取材固定1)取材必须新鲜，组织离体后迅速割取组织块，并随即投入固定剂福尔马林中。
切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。
2)固定完毕，用水冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。
2.脱水脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水，各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。
需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。
3.二甲苯透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。
透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。
将组织块先放入纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，。
透明时间一般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。
4.透蜡和包埋包埋用的石蜡，熔点在60℃左右。
透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。
纯石蜡应处理2-3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15-30min。
透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。
包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。
具体做法是；先准备好纸盒，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。
5.切片方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。
石蜡切片和免疫组化 步骤整理
一：步骤石蜡切片（骨组织）1：PFA固定，4℃冰箱过夜后，用10%的EDTA脱钙，时间3-5周，鉴定脱钙完成的标志是：用细针可以刺进骨头。
脱钙完成后开始做实验前需要把骨头放到70%的酒精24h。
2：脱水：70％酒精（1h）→ 80％酒精（30min）→ 95％酒精Ⅰ（20min）→无水乙醇Ⅰ（15min）→无水乙醇Ⅱ（15min）。
3：透明：二甲苯（15min）（如果组织小（例如小鼠和大鼠的组织）就15min，如果透明时间过长组织易脆，如果组织大（例如兔子、人、狗等)时间就可以稍微长一些。
4：浸蜡：恒温56℃～58℃（不超过60℃）。
→石蜡Ⅰ（1-2h）→石蜡Ⅱ（1-2h）。
（如果组织大浸蜡时间可以延长，可以达6-8h。
）5：包埋：待石蜡稍微凝固以后放到4℃冰箱过夜。
6：切片与展片：切片的时候要保持包埋好的蜡块的硬度，如果蜡块软的话切片的时候组织就会碎，所以要把蜡块放在冰上。
在42℃温水中展片（如果组织太脆，就先把组织浸泡在甘油中，几分钟？后在把组织放在冰块上，一段时间后再取出来重新切片。
）7：捞片：捞片时，载玻片45°倾斜，然后将片置于载玻片2/3处。
8：收片子，37℃保存。
HE染色1：脱蜡和脱水：二甲苯，10min×3（不常换，脱蜡用），酒精5min（100%Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ；95%；70%），蒸馏水Ⅰ，Ⅱ5min（如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。
如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长）2：染色：苏木精-2-3min3：蒸馏水冲洗（起反蓝的作用）：大概1h-2h4：伊红染色-2min4:脱水 70%→80%→95%Ⅰ→100%ⅠⅡ、Ⅲ酒精各一分钟5：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3min（脱水用，最好是用一次换一次，脱水用的二甲苯要透明干净，质量才好）6：封片用树胶∶二甲苯=3:1（1∶1，3∶2）{现配现用}，树胶多一些，用铅笔或者其他工具赶气泡。
免疫组织化学及相关技术之石蜡切片技术及HE染色
10 ′ 30 ′（返蓝）
5′ 5′ 5′
HE染色流程
3. 脱水，透明，封片
95％酒精Ⅰ、Ⅱ 100％酒精Ⅰ、Ⅱ 二甲苯Ⅰ、Ⅱ 中性树胶封片 显微镜观察
各2 ′ 各2 ′ 各2 ′
30min 30min
40min 40min 40min
四、包埋（示教）
取固脱透浸包切 材定水明蜡埋片
五、HE染色原理
苏木精（Hematoxylin） 伊红（Eosin）
碱性染料
酸性染料
胞核中染色质和胞质 胞质中的膜性结构（线粒体、溶
中的核糖体等
酶体、滑面内质网和细胞外基质
紫蓝色 嗜碱性 basophilia
2．保存细胞内特殊的成分，使其沉淀或凝固， 并定位在细胞内的原有部位，尽量保持其自 然完整状态。
二、固定
作用
3．组织细胞内的不同物质经固定后可以产生 不同的折光率，对染料也产生不同的亲和力， 造成光学上的差异，使得在生活情况下原来 看不清楚的结构变得清晰起来，并使得细胞 各部分容易着色，有利于区别不同的组织成 分。
丙酮 4%多聚甲醛√
灌注固定
75ml 25ml 5ml
三、脱水、透明及浸蜡
1. 脱水流程：
70%酒精 6h 80%酒精 6h 95%酒精Ⅰ 1h 95%酒精Ⅱ 1h 100%酒精Ⅰ 1h 100%酒精Ⅱ 1h
三、脱水、透明及浸蜡
2.透明： 二甲苯Ⅰ 二甲苯Ⅱ 3.浸蜡： 石蜡Ⅰ 石蜡Ⅱ 石蜡Ⅲ
4．固定剂的硬化作用：增加组织的硬度，使 组织不易变形，有利于固定后的处理。
固定的注意事项
1．组织及固定液必须新鲜 2．固定液的用量一般为组织块体积的
15～20倍 3．固定的时间视组织块的种类、性质、
石蜡切片、HE、免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化实验一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈）①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。
将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。
）②脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。
使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡Ⅰ1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡Ⅱ中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。
③包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡Ⅱ倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。
），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。
HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤
HE染色1．取材切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6m M 6m M 5mm为宜。
注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。
2．固定将切好的组织用生理盐水组织洗3 次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36 小时。
注意事项：（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30 倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2 次新液。
（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。
标签上注明固定液、材料来源、日期等。
标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
脱钙72 小时中间不换液是样本30 倍中杉金桥（进口脱钙液）镊子触质粒由硬变韧性为准。
（xx）：固定3-5 天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。
3. 洗涤材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。
（20, 30, 30, 60）（xx）：流水冲洗约4 小时4. 脱水材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水,各30min注意事项：（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。
（2）在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。
（3）在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。
（4）在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。
（5）如需过夜,应停留在80%酒精中。
实验时间石蜡切片免疫组化实验（含详细步骤）
实验时间石蜡切片免疫组化实验（含详细步骤）
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
其中前三种最常用。
实验原理
根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔 IgG 分子结合在多聚酶上形成多聚物分子，其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。
实验步骤
1. 石蜡切片置于67 ℃ 烘箱中，烘片 2 小时，脱蜡至水，用 pH 7.4 的 PBS 冲洗三次，每次 3 分钟（3 × 3'）。
2. 取一定量 pH = 6.0 柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理 10 分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用 PBS 冲洗2 × 3'（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）。
He染色切片制作（各动物、全过程、操作要点、注意事项）
He染色切片制作（各动物、全过程、操作要点、注意事项）石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。
（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml） 1000 200 100重铬酸钾（mg） 63 120 100蒸馏水（ml） 200 200 1000重铬酸钾1200g蒸馏水 2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林 100ml蒸馏水 900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液 10ml蒸馏水 90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水 100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。
石蜡切片和免疫组化方法
石蜡切片步骤取材：将目标组织样按要求修剪至一定大小。
固定：用10%的福尔马林溶液固定组织样4-6h。
脱水：梯度酒精50% 2h70% 2h80% 2h95% 2h95% 2h100% 40min100% 40min透明：二甲苯Ⅰ 8min二甲苯Ⅱ 5min （观察组织，透明度较好为宜）浸蜡：（蜡温保持在60℃）软蜡Ⅰ 50min软蜡Ⅱ 50min硬蜡Ⅰ 50min硬蜡Ⅱ 50min硬蜡包埋切片：组织化学切片 4μm常规切片 5μm烘片：65℃脱蜡至水：二甲苯Ⅱ 5min二甲苯Ⅰ 5min梯度酒精至水100% 3min100% 3min95% 3min95% 3min80% 3min70% 3min50% 3min染色：1.常规HE染色苏木素 10min自来水洗 5min盐酸酒精分化 10s自来水洗返蓝 10min伊红 1min自来水洗 5mins蒸馏水 1mins2.免疫组织化学染色1.抗原的修复：柠檬酸缓冲液95℃。
time2.消除内源性过氧化物酶：3%的H2O2的甲醇溶液孵育3min。
PBS（10mM磷酸钠，150mM 的氯化钠，pH7.4）洗涤3*3min3.封闭：5%BSA封闭30min。
洗涤3*3min4.加生物素标记的凝集素：用生物素标记的凝集素溶在大约2-20μg/ml（梯度稀释的以找到最合适的浓度）的PBS中，加在切片上然后在室温下孵育30min。
TPBS 洗涤3*3min。
1h混合ABC5.ABC试剂孵育30min。
（现配）TPBS洗涤3*3min。
6.加辣根过氧化物酶标的亲和素：加在切片上后在室温下孵育30min。
TPBS洗涤3*3min。
7.显色DAB：含3%的H2O2的DAB显色10min。
TPBS洗涤3*3min。
结合镜下观终止反应，蒸馏水冲洗。
苏木精衬染 10min蒸馏水洗涤5min盐酸酒精分化10s（视颜色而定）自来水返蓝4min梯度酒精脱二甲苯水透明封片光镜下染色计数，清洁，封片。
免疫组化HE染色步骤
骨组织石蜡切片制作步骤：1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h。
2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。
4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。
5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。
6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。
7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。
免疫组化检测步骤：1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1（10min）二甲苯2（10min）。
2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min)。
3.PBS冲洗3次，每次5min.。
4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸15min,自然冷却至室温。
5.PBS冲洗3次，每次5min。
6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性。
7.PBS冲洗3次，每次5min。
8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜）9.PBS冲洗3次，每次5min。
10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。
11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。
12.DAB显色5min。
13.自来水冲洗10min。
14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。
15.自来水冲洗10min。
16.常规脱水，透明，封片，镜检。
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HE染色1．取材切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。
注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。
2．固定将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。
注意事项：（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。
（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。
标签上注明固定液、材料来源、日期等。
标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液）镊子触质粒由硬变韧性为准。
（美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。
3. 洗涤材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。
（20，30，30，60）（美）：流水冲洗约4小时4. 脱水材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水，各30min注意事项：（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。
（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
（3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。
（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象（美）：80％的酒精×2小时95％的酒精×2小时100％的酒精×2小时×2100％的酒精×1小时或者更长时间5．透明（环保透明脱蜡液）中杉金桥纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明为止）。
由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。
当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
透明注意事项（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。
（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。
（3）在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。
（美）：二甲苯 2小时二甲苯 2小时二甲苯 2小时6．透蜡放入二甲苯和石蜡各半的混合液60min，再放入石蜡Ⅰ60分钟、石蜡Ⅱ透蜡30分钟。
透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。
透蜡时间根据组织大小而定。
透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55-60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。
一般置于恒温箱0.5h。
透蜡注意事项（1）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；（3）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。
（美）：石蜡 2小时石蜡 2小时石蜡 2小时7. 包埋包埋时，用镊子夹取石蜡模子（金属质地）在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。
再将镊子稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。
再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。
8. 切片①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。
②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。
③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。
④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。
⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米。
⑥一切调整好后主可以开始切片。
此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min。
⑦切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。
⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。
⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。
9. 展片、贴片打开水浴锅，使水温维持在40-45℃，另准备30%乙醇溶液。
②切片时，将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。
②用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在乙醇溶液的水面上，使切片展开。
（可省）③小镊子轻轻地将连在一起的切片分开，用一个载玻片将切片完整，已展开的切片捞至温水中，使之充分展开。
④另取洁净的载玻片，捞起展开的切片，使其位于切片1/3处，另一端（磨边，粗糙的一端）磨面上标记或贴上标签，放于切片架上。
10. 脱蜡复水将温箱温度调至65℃，待温度控制在60℃时，将切片连同切片架放入干燥的温箱内3-5小时至蜡熔化。
之后，石蜡切片经脱蜡透明Ⅰ、Ⅱ脱蜡各20min，勿动（防治组织掉）此步为关键步，请轻拿轻放。
然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各5min，再放入蒸馏水中3min。
11．染色切片放入苏木精中染色约10-30min。
染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。
室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。
12．水洗用自来水流水冲洗约15min。
使切片颜色变蓝（或放入碱性水中也可），但要注意流水不能过大，以防切片脱落。
13．分化将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，约2秒至数十秒钟。
见切片变红，颜色较浅即可。
14．漂洗（反蓝）切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。
15．脱水Ⅰ切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各5min。
（没放50）16、复染用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。
伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。
反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。
可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。
17．脱水Ⅱ将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。
最后用吸水纸吸干多余的乙醇。
18．透明切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5min。
二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。
切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。
19．封藏：中性树胶封存因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。
封藏的方法：封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。
材料透明后，在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。
如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。
如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。
染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。
免疫组化染色1. 石蜡切片，步骤同前。
切片经贴片后，60℃烤片30min使蜡熔化，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min,脱蜡。
然后，将切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min，再放入蒸馏水中3min，水化。
2．脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4，具体看所用抗体及染色试剂说明)冲洗3次，每次3分钟。
洗瓶冲洗。
3. 根据抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
可选步骤，具体见抗体说明书。
4.每张切片加1滴或50μl 3%过氧化氢，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗3次，每次3分钟。
此步骤是对内源性过氧化物酶含量高的组织而言。
4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体，室温下孵育60分钟或4℃过夜，具体参见每种抗体的说明书。
PBS冲洗3次，每次3分钟。
5. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl 即用型MaxVisionTM 试剂或SP试剂，室温下孵育10-15分钟。
PBS冲洗3次，每次3分钟。
6. 除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-5分钟（DAB）或37℃环境下10-30分钟(AEC)。
7. 自来水冲洗，苏木素复染10分钟，PBS或自来水冲洗返蓝。
如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，步骤同H-E染色，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。