第09章 疏水层析
疏水层析标准操作规程
疏水层析标准操作规程疏水层析是一种常用的色谱技术，广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
下面是疏水层析的标准操作规程，供参考：一、实验前的准备工作1. 根据实验目的，选择合适的疏水相和适宜的反相色谱柱，并进行校准。
2. 配制高纯度的溶剂，保证溶剂的质量，并按照方法要求调节溶剂的pH值。
3. 确保色谱仪及其相关设备准备就绪，包括流速泵、样品自动进样器、检测器等。
二、样品的处理1. 准备样品溶液，并通过过滤或离心将悬浮物去除，以保证样品的纯度。
2. 根据样品特性选择合适的提取方法，如溶剂萃取、固相萃取等。
3. 根据实验要求，进行必要的前处理，如稀释、酸化、碱化等。
三、系统的初始设置1. 对色谱系统进行初始设置，包括流速、检测器的温度、波长等。
2. 开始预洗柱，选择合适的洗柱溶剂，将样品进样口与引入口连接，设置洗柱时间。
四、方法的优化和验证1. 选择合适的进样量和洗柱时间，确定最佳的色谱条件。
2. 根据样品的复杂程度，适当调整固定相的选择和柱温。
3. 针对不同样品进行方法验证，包括线性度、准确度、精密度等指标的验证。
五、正式实验过程1. 将样品进样器与色谱仪连接，并设置好进样量和进样速度。
2. 开始注入样品，根据方法要求选择适当的流速，并同时进行监测。
3. 在实验过程中，密切注意流速、柱温和检测器的响应。
六、数据处理和结果分析1. 对实验结果进行数据处理，包括峰面积的计算、峰高的测量等。
2. 根据标准曲线或参考物质进行定量分析，计算样品中目标物质的含量。
3. 分析结果的统计学处理，包括平均值、相对标准偏差等指标的计算。
七、实验结束后的工作1. 关闭色谱仪及相关设备，清洁色谱柱和进样器，并存储在适当的环境中。
2. 处理实验废液和废物，保证环境安全和实验室的整洁。
3. 归档实验数据和结果，记录实验过程中的问题和改进方向。
疏水层析标准操作规程需要根据具体实验目的和方法要求进行调整，上述只是一个基本的操作指南，希望对您有所帮助。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析是指在一定容器中，注入一种聚合物（称为疏水层），使存在于容器中的大分子物质或小分子物质（即分子群）在这种聚合物中分离，利用多种技术获得分析结果。
这种实验具有快速、精确度高、能优化性能等优点，是许多研究领域中用于分子析的有效工具。
它的原理是：当疏水层溶液通道中注入溶液时，溶液中的成分根据大小、重量等不同的性质在聚合物中以不同的比例运行，并分别形成两个物质带来的极性差异，从而使它们在聚合物中分离，从而实现分子分析检测。
疏水相互作用层析
疏水相互作用层析
液体分子中存在着由疏水相互作用层（hydrophobic interactions）引起的吸引力或者排斥力，即在表面上构成一个光滑的膜状结构，从而使相邻的分子能够彼此吸引。
疏水相互作用可分为氢键形成的疏水相互作用（hydrogen bonding）和电位效应（ion-pairing）。
氢键形成的疏水相互作用主要是由液体分子中的氢原子及其离子之间，形成氢键来构成的，这个相互作用层相对稳定，能够加强其他分子的相互结合作用，使其保持在稳定的状态中。
电位效应（ion-pairing）主要是由中性分子中离子（并非完全离子化）之间形成，它们之间不受静电力的影响，构成一个轻微的膜状结构，从而使分子之间产生互相吸引和排斥的作用力。
生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析(19页)
生物大分子分离纯化技术
五、实验方法 1.胶的溶涨 用缓冲液或去离子水将凝胶清洗， 去除其中的有机溶剂。 2.装柱 疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高 度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。 3.平衡 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平 衡柱床。
生物大分子分离纯化技术
二、基本原理 疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如
水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然 趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸， 如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴 露于球形蛋白质表面的非极性氨基酸侧链可以 密集在一起形成疏水区域。
生物大分子分离纯化技术
疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面 疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶 联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋 白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类 生物大分子进行分离纯化。
生物大分子分离纯化技术
4.加样 上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层
析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前 不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH 值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应 去除，以防影响吸附。
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5.洗脱 疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度
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三、介质 在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由
载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。 其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为 大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对 疏水性物质有一定的吸附力。
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四、影响疏水性吸附的因素 1.配体的类型
疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密 度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢 链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏 水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏 水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。
疏水作用层析
疏水作用层析实验概要通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
实验原理疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow结构示意图如下。
主要试剂1. 疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow2. 溶液A：0.1M Na2HPO4, pH7.03. 溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO44. 蛋白质样品溶于溶液B主要设备层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计实验步骤1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
加入溶液A，溶液的体积约占总体积的1/4。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析是一种常用的色谱分析技术，其原理基于样品分离时固定相与移动相之间的亲疏水性差异。
疏水层析中，固定相通常是一种非极性材料，如疏水性树脂或疏水性硅胶。
移动相则是一种有机溶剂，如甲醇或乙腈，其疏水性介于固定相和要分离的样品之间。
在疏水层析柱中，样品溶液由于亲疏水性差异而与固定相发生不同程度的相互作用。
亲疏水性强的物质会与固定相发生较强的相互作用，停留时间相对较长，而亲疏水性弱的物质则会较快地通过固定相，停留时间较短。
疏水层析的分离原理可解释为两种相互竞争的作用力。
一方面，固定相表面具有较大的亲疏水性，使得亲疏水性强的物质更容易与其发生相互作用，并在固定相上停留。
另一方面，移动相中的有机溶剂对固定相表面也有一定的亲疏水性，这种亲疏水性决定了溶剂与固定相之间的相互作用力。
当亲疏水性强的物质进入移动相后，相互作用力较弱，从而更容易通过固定相。
在实际应用中，疏水层析常用于分离极性较强的化合物，如多肽、核苷酸、脂肪酸等。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
总而言之，疏水层析利用样品与固定相之间亲疏水性差异实现分离。
疏水性强的物质在固定相上停留时间较长，而疏水性弱的物质则更容易通过固定相。
通过调整移动相和固定相的亲疏水性，可以实现对不同化合物的选择性分离。
疏水作用层析
疏水作用层析1. 疏水层析的原理：疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
由于蛋白质是一类有序三维结构的活性大分子，但其空间排列很容易受到外界环境的影响，极易从有序的结构变成无序结构。
当立体结构发生变化时，常常失去原有的活性，即蛋白质的失活。
使用适度疏水性的分离介质，在含盐的水溶液体系中，借助于分离介质与蛋白质分子之间的疏水作用达到吸附活性蛋白分子的目的，这种层析技术称为疏水作用层析。
蛋白质的一级结构中有很多非极性氨基酸，这些氨基酸在三级结构上由于疏水相互作用会被尽量包在分子内部，但是仍不可避免地有一些非极性侧链暴露在表面，这些非极性的表面是它和疏水层析介质作用的结合部位。
因为蛋白质分子的疏水性不同，它们和疏水层析介质的作用力强弱也不同，所以非极性表面的大小和含量决定了蛋白质分子的疏水性强弱。
疏水层析就是利用各种蛋白质分子和疏水功能基团之间作用力的差异对蛋白质进行分离、纯化的一种技术。
蛋白质可以看成是一种有亲水性外壳包裹着疏水性核心的四级结构的复杂体系。
蛋白质表面存在一些非极性的疏水基团，这些基团多为非极性的氨基酸残基。
由于各种基团疏水性的差别、疏水基团暴露数量的不同、疏水区与亲水区在数量、大小和分布的不同等因素，使各种蛋白质之间存在较大的差异，同时，对于同一种蛋白质在不同的溶液中，使疏水基团暴露的程度也呈现出一定的差异。
由于这种差异，致使各种蛋白质分子与同一种分离介质疏水基团的相互作用不同，吸附能力不同，可以达到分离的目的。
如果在水溶液中加入中性盐，使溶液处于高盐浓度时，可以破坏蛋白质分子表面水分子的有序排列，使大分子与分离介质的功能基团之间产生疏水作用。
同时，由于高盐的存在，使蛋白质分子的疏水基团暴露增多，增加了大分子的疏水性，增强了蛋白质分子与分离介质功能基团之间的疏水作用，相互结合力增强。
丁基疏水层析
丁基疏水层析
丁基疏水层析是一种层析技术，常用于化学分离和纯化的过程中。
它基于化合物在不同疏水性条件下的亲/疏水性差异，通
过溶剂的选择和控制来实现分离。
丁基疏水层析的原理是基于多相液体的分配平衡。
样品在两种液体相（一般是水和有机溶剂）之间分配，并根据其相对亲/
疏水性来决定在哪个相中停留。
疏水性较弱的化合物更容易溶解在有机溶剂中，而亲水性较强的化合物则更容易溶解在水相中。
在丁基疏水层析中，通常使用一个丁基（C4）疏水基团作为
固定相。
这个疏水基团可以与样品中的疏水性化合物相互作用，从而实现分离。
在分离过程中，样品先通过预处理步骤将目标化合物固定在丁基固相上，然后使用适当的洗脱剂洗脱出目标化合物。
洗脱剂一般为疏水性较弱的有机溶剂，可以根据目标化合物的亲/疏水性来选择。
丁基疏水层析具有简单、快速和高效的特点，广泛应用于化学、生物和制药领域的分离和纯化过程中。
它可以用于分离和纯化天然产物、蛋白质、多肽、核酸和其他有机物等。
疏水层析和反相层析的原理及区别
疏水层析：
根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离蛋白，高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。
常用：苯基琼脂糖凝胶
反相层析:
在吸附层析中，高极性物质在层析柱上吸附较牢，洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。
如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。
则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。
这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相层析。
目前用HPLC做反相层析常用的ODS柱，即在支持物的表面上连接了C18H37Si—基团（C18柱）。
二者的区别：
疏水作用层析：溶液配置简单，性状温和，能保持蛋白活性，但操作复杂，分离效率低
反向液相层析：洗脱液要求高，蛋白变性，操作简单，分离效率高。
疏水层析名词解释
疏水层析名词解释
嘿，你知道啥是疏水层析不？疏水层析啊，就好比是一场特殊的“相亲大会”！那些具有疏水性质的分子们，就像是一群害羞的小伙子或者大姑娘，在这个特殊的场合里，寻找着自己的“另一半”。
比如说吧，蛋白质就是这场“相亲大会”里的主角之一。
它们有着不同的疏水区域，就像每个人都有自己独特的性格和魅力。
而疏水层析的柱子呢，就像是布置好的相亲场地，上面有着特定的疏水基团，专门吸引那些有疏水性质的分子。
想象一下，这些蛋白质分子在溶液中游走，当它们碰到疏水层析柱的时候，那些疏水区域就会被柱子上的疏水基团所吸引，就好像是两个人看对眼了一样，然后就结合在了一起。
而其他没有疏水性质或者疏水性质不强的分子呢，就像是那些没有找到合适对象的人，就继续在溶液中晃荡啦。
这时候呢，我们就可以通过改变一些条件，比如改变溶液的盐浓度或者酸碱度，来让结合在柱子上的蛋白质分子“松松手”，从柱子上下来。
这就好像是在“相亲大会”上，主持人稍微调整一下氛围，让那些已经结合的人也有机会重新考虑一下。
疏水层析在生物化学领域可是有着重要的作用呢！它可以帮助我们分离和纯化各种蛋白质、多肽等生物大分子。
哎呀呀，没有它可不行呢！
我觉得疏水层析就像是一个神奇的魔法棒，能把那些我们需要的分子从复杂的混合物中精准地挑出来，是不是超级厉害呀！它真的是生物化学研究中不可或缺的好帮手！。
第九章 疏水层析
疏水作用层析过程的参数 固定相类型：包括基质的类型、配基 的种类和取代程度 流动相组成：盐的种类和浓度、流动 相的pH、以及其他添加剂的影响 层析条件 ：温度、流速等
二、介质（基质+配基）
基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人 工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯 类。其中，半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用 最广泛的疏水介质。 近年来研制超大(superporous)琼脂糖， 在扩散孔的基础上增加了对流孔，在流速较 高的条件下获较好的分辨率。 壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定 性，近年来在疏水层析中也得到了应用
不同的介质对同一样品有不同的分离效果：
样品的准备
往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中 的盐浓度达到与流动相A中基本一致，并调 节样品溶液的pH使其满足吸附条件 HIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的 结合容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可 以直接加样
样品的加量问题
层析条件的优化
优化目标： 目标分子达所需纯度的基础上，获得尽 可能高的回收率，同时力求缩短分离所需时 间、降低分离成本 HIC中，层析条件包括流动相A，流动相B， 洗脱方式，层析柱的柱长，流速，温度等
目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化 方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、 受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚 至细胞等分离时的有效手段。
一、原理
高浓度盐与水分子发生强烈作用， 导致疏水分子周围形成空穴的水分子 减少，促进疏水性分子与介质的疏水 配基之间发生结合
蛋白质等生物大分子与HIC介质 的结合不仅取决于分子疏水性表面的 比例，还与疏水补丁的分布有关;
梯度洗脱和阶段洗脱
A
B
据试探性实验结果对洗脱进行优化 （A）采用复合梯度洗脱；（B）采用阶段洗脱
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析原理，也称为非极性层析原理，是一种分离和纯化化合物的常用方法。
该原理利用化合物在疏水性固定相（如疏水性硅胶）和溶剂中的亲水性差异来进行选择性分离。
在疏水层析中，化合物混合物首先通过一个填充有疏水性固定相的柱子（如硅胶柱）；然后用一个选择性的溶剂进行洗脱，使得各种化合物可以以不同的速度从柱中流出。
疏水性固定相作为分离介质，最主要的特点是表面疏水性强，与非极性或疏水性化合物具有较好的相互作用能力。
这种相互作用可以通过范德华力、氢键等进行，使得疏水性化合物被相互作用力留在柱上。
而亲水性化合物则更容易与溶剂发生作用而从柱中洗脱。
在进行疏水层析时，溶剂的选择是非常重要的。
选择的溶剂应该足够强大，可以与疏水性化合物发生相互作用，从而实现其分离。
常用的溶剂包括乙腈、甲酸乙酯、异丙醇等。
总之，疏水层析原理是通过利用化合物在疏水性固定相和溶剂中的亲水性差异，实现化合物的选择性分离。
这种方法在分析化学和生物化学等领域中广泛应用，能够有效地纯化和分离化合物。
疏 水 层 析
7、 柱子的预平衡：10倍床体积的层析缓冲液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸铵（这个浓度要你选择，50%还是30%？）），使其平衡。
8、 上样：当平衡层析缓冲液流至恰好与床面相切时，关闭出液口（有泵的话，把它一关就OK!），然后上样。注意：尽量小心，保持床面的平整性！打开出口，让样品缓缓进入柱床，再次相切时，加入少量（很少就可以，稍稍盖过床面就行！）层析缓冲液（20mM PBS, 50%硫酸铵）洗一下。
2、 柱子的装填：如果是预装柱，就不存在装柱的问题了。不是，则从头开始：首先，把柱子洗干净，一定要洗干净，不然会出现气泡。填料预先融涨（注意，进口一般已经是融涨好的，不必再做这一步），取一定的填料（例如：想装5.0ml的柱子，一般将瓶子里的填料（沉淀的填料：上清=1：1的话）取10.0ml出来）先脱一下气（请人帮忙，不然控制不好会暴沸出来！），然后缓缓装入柱子（柱子上下口一定不要搞错！！！），打开下口让水流出，最好一次性装完，等待其自然沉降，柱子就装好了。（实际上，因为疏水层析的原理与分子筛不同，所以其装柱远远没有分子筛的柱子那么严格，很容易的！放心好了！看着顺眼就应该差不多吧）
13、 好了，就这么多，有什么问题再讨论吧。或者到丁香园去问一下，chromatography很内行的！
疏 水 层 析
1、 疏水层析是根据不同蛋白质的疏水力强弱不同来分离的。在高盐离子强度的情况下，蛋白质的疏水基团充分暴露与填料的疏水介质相互作用，从而结合在柱子上。不同蛋白质的疏水性强弱不同从而导致其与柱子填料的结合力也不同。随后，逐渐降低洗脱缓冲液的盐离子强度就可以将不同的蛋白分布洗脱下来，形成一个个的蛋白质洗脱峰。
3、 注意：柱子装好之后，任何时间都不能让缓冲液流到柱面以下而干柱，切记！
疏水层析洗脱顺序
疏水层析洗脱顺序层析是一种分离、纯化化合物的技术，其中疏水层析是一种用于分离疏水化合物的特殊类型，由于订单的疏水性质，分离会比较困难，因此需要特殊处理。
疏水层析中，需要洗脱有机化合物。
正确的洗脱顺序对于获得高纯度化合物是非常重要的。
本文将探讨疏水层析洗脱顺序的问题。
疏水层析基本原理疏水层析是一种分离疏水化合物的方法，这些化合物分子通常有一个或多个疏水基团。
疏水基团是由一些由烃基组成的疏水区域，如甲基、叔丁基、苯基等构成的。
这些化合物通常被溶解在有机溶剂中。
在疏水层析中，样品进入固定相（对于疏水化合物来说是疏水性固定相），发生与载流体相互作用，以获得不同的留存时间。
当载流体流经填充柱时，疏水化合物可能会被暂时”憋”在柱中的疏水部分，这时它们不能跟着移动，因此就被分离了出来。
第一步：预洗预洗时使用载流体以洗去杂质，预洗通常不会把目标化合物和板栗相互作用更多。
预洗过程中，合适的载流体用量较大，通常在填充物高度的1~3倍之间。
然后用流量增加到洗体载流体的4~6倍。
洗脱过程需要反复多次直到目标化合物在废液中被清除。
第二步：盐度梯度洗脱盐度梯度洗脱进行的目的是使用含有不同盐的缓冲溶液来控制疏水份子与载流体之间的相对亲和力，这是一个常见的分离方法。
盐度梯度洗脱需要使用渐进式的盐度梯度，来引导目标化合物与载流体分离，在这一步中，某些化合物已经可以被分离出来，但也有可能发生重叠。
盐浓度的渐变通常选用10~20mM步幅。
缓冲溶液pH通常在7.4~8.6之间。
第三步：使用有机溶剂洗脱当目标化合物经过盐度梯度洗脱，仍未完全分离时，具有强极性的有机溶剂，如乙醇、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、DMSO等中一种或几种，可通过孔隙，在填充柱中的疏水区域和目标化合物之间进行相互作用，解决重叠问题，有机溶剂的相互作用力比水或缓冲溶液要强得多。
使用有机溶剂时，从较小的浓度逐步增加，到目标化合物几乎完全被洗脱。
一旦达到分离目的，最好立即停用有机溶剂，因为某些化合物可能已经出现沉淀。
疏水层析
蛋 白 质 结 合 容 量 （ mg/ ml 凝 胶 床）
洗脱的方式：
（1）采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱 （最常用） （2）通过往流动相中添加有机溶剂 ，如： 乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极 性的方式洗脱 （溶剂中稳定性良好的物质） （3）往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本 身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在 其上的目标组分置换下来 （分离膜蛋白）
温度升高会增加疏水作用，但注意蛋 白质等生物大分子在较高温度下会变性。 对特定的分离，操作温度需保持恒定，才 能确保层析结果具良好的重复性。
层析介质的再生、贮存
再生：常规用蒸馏水清洗，如有疏水性很强 的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质 上，则需合适的清洗剂进行清洗，NaOH溶 液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗层析 柱的同时还能使微生物钝化灭活起到消毒的 效果。此外，促溶盐类的水溶液也是良好的 清洗剂 贮存：一般悬浮在20%的乙醇中，如在水溶 液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂， 以防止微生物的生长
Hydrophobic Interaction Chromatography HIC
疏水作用层析
原理 介质 技术
概述
疏水层析分离的概念早在1948年由Tiselius 提出，真正发展是1970年开发出一系列适合 疏水层析的固定相以后； 疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或 凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经 常联合使用来分离复杂的生物样品；
一般来说每个分子被吸附的过程 都会有一个以上的配基参与，换句话 说，分子在介质上发生的结合是多点 结合.
疏水层析与反相层析的区别 ：
RPC介质上疏水配基的取代程度大 大高于HIC介质，RPC更适合在水-有机 溶剂体系中具有良好稳定性的肽和小分 子蛋白质的分离纯化； HIC过程洗脱条件温和，通常降低 洗脱剂的盐浓度就能达到目的，在蛋白 质的纯化中有较广泛的应用。
疏水层析洗脱条件
疏水层析洗脱条件
疏水层析是一种常用的分离和纯化技术，广泛应用于生物制药、食品工业、环境监测等领域。
在疏水层析过程中，洗脱条件的选择对于分离效果和纯化程
度至关重要。
以下是几个影响疏水层析洗脱条件的关键因素：
1.洗脱缓冲液的pH值：pH值对于洗脱物质的电荷状态和分配系数有着重
要影响。
根据目标物质的酸碱性质选择合适的洗脱缓冲液pH值，可以有
效地调节目标物质的亲和性。
2.洗脱缓冲液的离子浓度：离子浓度会影响洗脱物质与固定相之间的竞争
关系，进而影响洗脱效果。
根据目标物质的亲和性选择合适的离子浓度，
可以优化分离效果。
3.洗脱缓冲液的洗脱剂浓度：洗脱剂浓度高低直接影响洗脱效果。
过低的
洗脱剂浓度可能导致目标物质无法有效洗脱出来，而过高的浓度则可能
导致非特异性洗脱。
需要根据具体情况进行调节。
4.洗脱流速：洗脱流速对于洗脱效果和纯化程度也有一定影响。
过高的流
速可能导致目标物质被冲刷出来，而过低的流速则可能导致洗脱效果不
理想。
需要根据具体情况选择合适的洗脱流速。
综上所述，选择合适的疏水层析洗脱条件是确保分离效果和纯化程度的关键。
通过调节洗脱缓冲液的pH值、离子浓度、洗脱剂浓度以及洗脱流速，可以优化疏水层析的洗脱效果。
疏水作用层析法蛋白质纯化实验原理及步骤
疏水作用层析法(蛋白质纯化实验)原理及步骤原理在疏水层析的主要支持介质上含有大小不等的疏水侧链，烷基或芳香基，可是绝大多数情况起作用的是苯基或辛基。
当碳氢链长度增加，即变得更疏水时，疏水强的少量蛋白质被吸附。
这时疏水相互作用太强，需用极端方法洗脱，可能会导致蛋白质变性。
苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低，是疏水纯化中效果不错的常用介质，尤其是试用于纯化开始时。
疏水相互作用介质苯基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-C6H5辛基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-(CH2)7-CH3溶液盐浓度增加时疏水作用变得更强。
因此，大多数疏水层析程序都是高盐时上样，降低盐浓度时洗脱。
所以在硫酸镂沉淀或离子交换层析后可以方便地直接进行疏水层析纯化。
温和的洗脱条件及高蛋白质结合容置(10~100mg∕ml)使疏水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的方法，也是更换缓冲液的方法之一。
材料与仪器蛋白质样品液苯基琼脂糖CL-4BNaCl硫酸铉磷酸钠盐层析柱步骤下述方案设定样品是在75%硫酸镂沉淀后溶在50%硫酸镂溶液的情况。
1.装填5ml苯基琼脂糖CL-4B进入柱内；2.10倍柱床体积层析缓冲液(20mmol∕L,PH7.0磷酸钠盐，50%硫酸钱)洗柱；3.调整样品液符合要求，即在pH7.0磷酸钠缓冲液中含50%硫酸镂。
上样总蛋白量200-500mg；4.3倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至A280值回到基线；5.用分步梯度法洗脱。
每步依次分别采用两倍体积各含40%、30%、20%、10%或0%硫酸镂的pH7.0磷酸钠缓冲液洗脱；6.再依次用5倍体积水、5倍体积1mol/LNaCl和5倍体积水洗柱，使其获得再生。
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Non-bound proteins
Elution
1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Abs Conc. salt Target elutes
Elution
1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution Abs Conc. salt More strongly bound proteins
patch)；
令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴
露出掩藏于分子内的疏水性残基；
高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓
度下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏
水性固定相作用。
一般在lmol／L (NH4)2SO4 或 2mol／L NaCl 高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物 质，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏 水的固定相结合在一起。 然后通过降低流动相的离子强度，即可将 结合于固定相的物质，按其结合能力大小， 依次进行解吸附。
9.5、疏水层析的应用
1、多种生物大分子的分离纯化。
2、去除DNA。
在用基因工程生产的各种药物中,世界卫生组织 (WHO) 规定药物中DNA 的残留量应低于100pg/ml。 利用HIC纯化技术则可以有效地除去残留的DNA ,因 为在DNA的结构中几乎不存在疏水区域,因此难以和 疏水色谱填料结合而被除去。
加样
在进行任何疏水相互作用层析前， 需确定样品的“盐稳定范围”。比如， 加入逐步增加的盐至粗提物中，用来确 定蛋白沉淀发生的浓度。确认样品在上 样到柱子时低于该盐浓度，以避免沉淀。
样品制备：建立盐溶解性范围后，从最高的能够 保持生物学活力而不发生沉淀问题的盐浓度开始。
调节样品到起始缓冲液的盐浓度来促进疏水相互 作用。使用高浓度的储液调节盐浓度，以避免由 于加入固体盐时局部盐浓度过高而造成沉淀。直 接调节样品的pH。由于疏水相互作用对pH不是 非常敏感，不需要完全的缓冲液交换。
四、层析步骤
平衡 ↓ 上样 ↓ 平衡除杂 ↓ 洗脱
Equilibration
1. Equilibration
2. Sample application 3. Washing 4. Elution Water molecules
Gel matrix
Hydrophobic ligand
Equilibrate the column and adjust the sample to binding conditions
A)
B)
高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。 疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。 在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白 之间或蛋白自身的相互作用。盐能够增强疏水作用。
亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理
靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic
其分子中的疏水性残基数是从
外向内逐步增加的。
虽然疏水氨基酸大多被包
埋在球形蛋白内部，有些则暴
露在外，在蛋白质表面形成疏
疏水和亲水部件表面的溶菌酶。 最疏水部分是深红色,浅红色的更少的 疏水性。最亲水部分显示在深蓝色的, 更少的亲水部分是浅蓝色。
水区域，这部分暴露在外疏水
性基团称为疏水补丁。
9.2、疏水层析原理
生物活性分子的分离与表征
第二部分 分离技术
第3章、沉淀法 第4章、吸附层析 第5章、纸层析 第6章、凝胶过滤层析 第7章、离子交换层析 第8章、亲和层析
第9章、疏水层析
第9章
疏水层析
Hydrophobic Interaction Chromatography
9.1、概述 9.2、疏水层析原理 9.3、疏水层析介质 9.4、疏水层析实验技术 9.5、疏水层析的应用 9.6、反相层析
由于沉淀引起的产量丢失。
图23 起始溶液中的盐浓度影响选择性和分辨率。
三、缓冲液
对于疏水相互作用，选择缓冲液离子并不致
关重要。最经常使用磷酸缓冲液。
pH 的选择必须和蛋白稳定性和活力兼容。
然而，在疏水相互作用层析过程中，pH5-8.5
对于最终的选择性和分辨率的影响都非常小。
pH的增加减弱疏水相互作用，在pH高于8.5或
也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用
高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。当盐 溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后 被洗下来。（相同盐浓度下，疏水作用弱的物
质先被洗下来，疏水作用强的物质随后被洗下 来）
对于疏水性很强的物质，则需要在流动相添加
适量有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。
高浓度下，蛋白稳定性的问题可能会阻碍 它的应用。
图22 不同盐对选择性的影响：按顺序增大洗脱体积洗脱： 细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A、α-糜蛋白酶原。
如果目的分子洗脱得太晚或根本不洗脱，
或者不能更换到不同的填料，尝试使用50% 的盐浓度结合。
有些蛋白在高盐浓度下开始沉淀。起始缓 冲液中的盐浓度需要降低以避免在运行中 的沉淀。重复的以小量上样也能帮助避免
在实践中，钠、或铵的硫酸盐有效的促 进在疏水相互作用层析中配基-蛋白相互作用， 在蛋白质结构上有稳定作用。 因此，最常用的盐：Na2SO4、NaCl和 (NH4)2SO4 。
在给定的浓度下，和其它的盐相比，硫酸
铵能够给出最好的分辨率，但在pH高于8.0 的情况下不推荐使用。
硫酸钠是一种非常好的盐析试剂，但是在
层析介质最终的选择性、结合能力起到重要
的作用。
配基的种类和目的蛋白 的性质在确定疏水相互作用 层析的选择性方面是高度显 著的参数。最合适的配基必 须通过用目的蛋白进行筛选 试验来确定。 图21 在使用一种苯基配基、同样的运行条件下三种单克隆抗 体相互作用不同。
总的来说， 疏水相互作用填料可以根 据它们和样品组分的相互作用分为两类。 直链烷基（丁基，辛基，醚基，异丙基） 显示一个纯的疏水性质，而芳香基配基 （苯基）显示混合型性质，包括芳香性和 疏水性相互作用。 在进行常压疏水层析时，大多数是选 用苯基(或辛基)-Sepharose CL-4B吸附剂 作固定相。
克/毫升。
保证样品，柱子，起始和洗脱缓冲液都在同样 的温度。
大多数条件下，增高温度会增强疏水相互作用，所以 在更低的温度工作（通常低于10度）能够使由于疏水 相互作用而导致的样品组分间的聚集最小化。降低温 度可以作为通过加入去垢剂来提高可溶性的替代方案。
洗脱
（1）采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）。 （2）通过往流动相中添加有机溶剂，如：乙二醇、丙 醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱（溶剂 中稳定性良好的物质）。 （3）往流动相中添加去污剂等，去污剂本身能与介质 发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换 下来 （分离膜蛋白）。
疏水效应
疏水作用(hydrophobic interaction):
非极性分子进入水中，有
聚集在一起形成最小疏水 面积的趋势，保持这些非 极性分子聚集在一起的作 用则称为疏水作用。
对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包
埋在蛋白质内部。最终的结构是最适合周围溶液的
热动力学折衷的结果。
就球形蛋白质的结构而言，
在上样前用简单的步骤净化所有的样品，这样可
以避免堵柱子的风险，减少强力清洗步骤的需要， 避免柱子性能的破坏和柱压的增加。
黏度随着温度而变化，在高盐浓度下会增加。
样品的可溶性或黏度可能会影响柱子的上样量。 高样品黏度导致畸变的流速样式，最终导致变 宽的、破坏的峰和压力问题。
稀释粘稠的样品。如果不能稀释，用更低些的 盐浓度或具有更大颗粒大小的填料可能会帮助 克服黏度问题。样品浓度通常应该不超过50毫
9.1、概述
疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析，
是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与
流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合 而进行分离的层析技术。 从作用机制来看，它属于吸附层析。
非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解 度非常小，与水混合时会形成互不相溶的两相， 即非极性分子有离开水相进入非极性相的趋势， 即所谓的疏水性(Hydrophobicity)。 非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效 应(Hydrophobic effect) 。
二、盐的选择
在疏水相互作用层析中，结合过程比洗脱
过程更具有选择性。所以，优化起始缓冲 液的条件很重要。正确选择的盐种类和浓 度是影响载量和最终选择性的最重要参数。 往平衡的缓冲液和样品中加入一种盐析盐， 有利于固定化配基与蛋白质的相互作用。 随着盐浓度的提高，结合到固定化配基上 的蛋白质量也相应提高 。
偶联至基质的常见配基类型
（A）丁基
（B）辛基 （C）苯基 （D）新戊基
对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力 太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具 中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙三醇等) 不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。
常用商品化疏水层析介质
1. Butyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14， 工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml 50μmol 正丁烷基，疏水性最弱，适合含脂族配 体的生物分子。 2. Octyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作 的最大速度是600cm/h,配基结合量为每 ml50μmol正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋 白的分离和纯化。
低于5的时候，蛋白的存留会更加显著的改变。
添加剂可以用来改善选择性和分辨率。
例如，样品和疏水相互作用层析填料结合太紧
时。然而，如果在高浓度使用，就有使目的蛋