细胞生物学实验细胞凋亡观察

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细胞生物学中的细胞凋亡

细胞生物学中的细胞凋亡

细胞生物学中的细胞凋亡细胞凋亡,也被称为程序性细胞死亡,是细胞死亡的一种形式。

它是由许多信号通路和大量基因调控产生的复杂生物学过程。

与坏死不同,细胞凋亡是完全被控制的过程,可以避免由于某些异常信号或突变等导致的细胞死亡。

对细胞凋亡机制的深入研究,将使我们更好地理解生命和疾病的本质,有利于相关疾病的治疗和预防。

一、细胞凋亡的类型和作用细胞凋亡分为两种类型,即外部反应性细胞凋亡和内部响应性细胞凋亡。

前者通常由某些外部刺激引起,如细胞表面的特异性蛋白质受体受到相应的配体启动反应。

此时,信号通过复杂的蛋白激酶级联反应,激活凋亡相关蛋白(CASP),导致细胞凋亡。

后者通常是由于细胞自身一些内部问题引起,如DNA损伤、药物或毒素的作用等等。

在内部响应性细胞凋亡过程中,细胞凋亡是由肾上腺素和皮质荷尔蒙等激素调节,而不是由外部刺激疏导。

细胞凋亡是神经发育、免疫系统功能、免疫神经功能、细胞代谢和排泄等重要生理过程的基础。

无论是在动植物的生命早期阶段还是在成年后的生长和再生过程中,细胞凋亡都扮演着重要的角色。

细胞凋亡还是许多疾病的起始点,如癌症、自身免疫性疾病等,因此对细胞凋亡的控制和治疗具有重要意义。

二、细胞凋亡的信号通路细胞凋亡的信号通路涉及众多的分子,这些分子对于特定的细胞类型和信号通路而言,扮演着不同的角色。

就细胞凋亡信号通路而言,细胞自杀基因Bcl-2家族的成员起着重要的作用,它们是互相调节的,从而影响细胞凋亡。

如果Bcl-2的成员含量高,则凋亡会受到抑制;反之,则会受到激活。

另一个重要的分子就是CASP,CASP是一种特殊的囊泡状蛋白,能够在至少15种底物上起作用,将它们降解和分解,包括细胞的内膜、粘膜和一部分蛋白质。

CASP的调节是一种容许的过程,在复杂的机制和信号中,错误信号在该通路中被消灭或纠正,从而避免地触发细胞凋亡。

三、细胞凋亡的应用细胞凋亡的知识已经被广泛应用于医学和生物技术的领域,为许多不同的临床应用提供了基础。

细胞凋亡实验报告

细胞凋亡实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除细胞凋亡实验报告篇一:实验14细胞凋亡的诱导和检测实验14细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式:凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)。

细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡,坏死过程细胞膜通透性增高,细胞肿胀,核碎裂,继而溶酶体、细胞膜破坏,细胞内容物溢出,细胞坏死常引起炎症反应。

细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语,意思是花瓣或树叶凋落,意味着生命走到了尽头,细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。

凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。

凋亡时细胞皱缩,表面微绒毛消失,染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘,继而核裂解,由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面,最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。

凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整,不引起炎症反应。

细胞凋亡时的生化变化特征是核酸内切酶被激活,染色体DnA被降解,断裂为50~300kb长的DnA片段,再进一步断裂成180~200bp整倍数的寡核苷酸片断,在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DnALadder)。

细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。

1.细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征,据此可以鉴别细胞的死亡形式。

细胞凋亡的机制十分复杂,一般采用多种方法综合加以判断,同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同,方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的(表?)。

表凋亡的检测方法(引自DL斯佩克特等,20XX)形态学观察方法:利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征:(1)DApI时常用的一种与DnA结合的荧光染料。

借助于DApI染色,可以观察细胞核的形态变化。

(2)giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。

凋亡实验的结果解读

凋亡实验的结果解读

凋亡实验的结果解读
"凋亡实验"这个术语在生物学和医学领域中并没有一个明确的
定义。

通常情况下,凋亡是指细胞按照程序性死亡的一种形式。

如果你能提供更多上下文或者具体的实验条件和方法,我将更容易帮助你解读实验结果。

在细胞生物学中,凋亡是一种细胞自我毁灭的过程,通常发生在细胞受到损害、寿命到期、或者在发育和组织修复过程中。

实验可能会使用某些指标来检测凋亡,例如:
DNA断裂:凋亡细胞的DNA通常会出现断裂,这可以通过凝胶电泳等技术来观察。

磷脂外翻:在凋亡过程中,磷脂会从细胞内翻转到细胞外,可以通过荧光标记的磷脂来观察。

凋亡相关蛋白:比如凋亡酶千层饼(caspases)、Bcl-2家族等凋亡相关蛋白的表达水平。

在医学研究中,凋亡实验可能会涉及到疾病治疗、药物筛选等方面。

凋亡的增加或减少可能对疾病治疗有重要影响。

要解读凋亡实验的结果,你需要查看实验设计、使用的细胞类型、处理条件以及选择的观察指标。

例如,如果你使用了特定药物,你可
能会观察到药物引起了细胞的凋亡。

这种情况下,你可以评估药物对细胞的治疗效果。

总体而言,解读凋亡实验的结果需要综合考虑实验的多个方面,包括实验设计、技术手段和相关背景知识。

如果你有具体的实验结果或问题,欢迎提供更多信息,我将尽力帮助你解读。

08 细胞凋亡的诱导及观察

08 细胞凋亡的诱导及观察

山东大学实验报告2018年5月28日________________________________________ _________________________姓名:丁志康系年级:2016级组别:周一下午科目:细胞生物学实验题目:细胞凋亡的诱导及观察学号:201600140055一、实验目的1.学习细胞凋亡的简史、概念和原理。

2.了解细胞凋亡的检测方法。

3.掌握诱导和形态学观察动植物细胞凋亡的基本方法。

二、实验原理1.细胞凋亡细胞凋亡(apoptosis)指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡,也称细胞程序性死亡。

细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

2.细胞凋亡的生理意义1)维持生物体内环境的稳定;2)参与防御反应;3)胚胎发育过程中清除一些细胞。

3.细胞凋亡的检测方法●细胞凋亡的形态学检测●磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)●线粒体膜势能的(△Ψmt)检测●DNA片段化检测●TUNEL法●Caspase-3活性的检测●WB检测●凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析4.细胞凋亡的形态学检测未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。

凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜破裂、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

5.细胞凋亡的诱导因素➢物理因素:射线、热休克、冷激等。

➢化学因素:重金属离子、激素、毒素、活性氧、一氧化氮等。

➢生物因素:病毒、细菌、肿瘤坏死因子、抗肿瘤药物、DNA和蛋白质合成抑制剂等。

6.细胞坏死细胞坏死(necrosis)被认为是因病理而产生的被动死亡,如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。

《细胞生物学》实验指导书(不太全供参考).doc

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《细胞生物学》实验指导书(不太全供参考)适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称:《细胞生物学》实验计划学时:7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术;2.了解细胞融合的基本原理及应用;3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官(叶等)获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料,其优点是材料来源方便,供应及时,而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法,对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法,其原理基本相同,都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义:1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍,为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一,它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍,也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦,最终将野生种的远缘基因导入栽培种中,原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌;(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液:(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基:3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备:1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净,再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解:材料切成1mm宽细丝,加入适量酶液,置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下,酶解5〜7h.3.分离:用200目网过滤除去未完全消化的残渣,在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液,相同条件下离心2-5分钟,弃上清,留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出,轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液),在lOOOrpm条件下离心5-10分钟,由于密度梯度离心的作用,生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间,破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液),放入另一干净的离心管中,加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.(二)原生质体融合:1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿,静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液,静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液,但不能吸干,否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片,镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞,并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体,在实验中应注意那些问题?增多数量的方法:多取材且尽量切碎,增加酶浓度,提高酶解温度,延长酶解时间,操作轻柔,勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称:《细胞生物学》实验计划学时:4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程;2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步,该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂:(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死,放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔,辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏,放入灭菌的培养皿中,加入Hanks液清洗,然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件?实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称:《细胞生物学》实验计划学时:3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法;2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时,细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止,如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移,接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂:(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液,加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜),静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞,如果细胞变圆,相互之间不再连接成片,这时应立即在超净台中将消化液倒掉,加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右,加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液,盖好瓶塞,送回二氧化碳培养箱中,继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件?实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称:《细胞生物学》实验计划学时:3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构,根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持,细胞的生长、运动、分裂、分化,物质运输,能量转换,信息传递,基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时,可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提,但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存,经戊二醛固定,考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后,可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂:(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液,用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次,每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次,每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上,盖上盖玻片,在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称:《细胞生物学》实验计划学时:9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的,目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式,即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大,胞膜破裂,细胞内容物外溢,核变化较慢,DNA降解不充分,引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小,连接消失,与周围的细胞脱离,然后胞质密度增加, 核质浓缩,核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡,最终为为几个凋亡小体,无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应,凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂:生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯,姬姆萨染色剂,Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇,甲醇,蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)细胞凋亡的诱导:1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液(重复三次),制备红细胞悬液,然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管,各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质,实验时煮沸5 min使细胞坏死.(二)细胞凋亡的形态学观察:1.处理4h取样,用生理盐水稀释5倍,各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液,室温晾干,在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相,并对试验组细胞进行凋亡计数统计.(三)DNA梯状条带的检测:1.离心收集鸡血细胞,弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬,转入1.5ml离心管中,加入蛋白酶K (500ug/ml)20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min(也可转入37°C水浴12〜24h),间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇,倒转混匀后,可以看见丝状物,用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟,弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压,电泳45 min左右,8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解,取一个凝胶模子,两端用胶布封好,水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处,其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时,加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀,倒入模子,待冷却凝固后,取下梳子,撕去两端胶布,放入电泳槽中,使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。

细胞生物学实验汇总

细胞生物学实验汇总

细胞生物学实验汇总1.细胞培养实验:细胞培养是一种将细胞在人造环境下生长和繁殖的方法。

这种实验可以用来研究细胞的生长和增殖,观察细胞的形态变化,评估细胞的功能和活性等。

培养的细胞可以来自动物组织、植物组织或微生物等。

2.免疫荧光染色实验:这种实验可以用来观察细胞内特定的蛋白质、细胞器或DNA分布。

研究人员可以利用荧光染料或标记的抗体与目标分子结合,在显微镜下观察细胞瞬态或持久性标记。

这种实验可以帮助我们研究细胞的结构和功能,探索细胞中不同分子的相互作用。

3.转染实验:转染是将外源DNA或RNA引入细胞内的过程。

这种实验可以用来研究基因在细胞中的功能,或将外源基因导入到细胞中来改变其表达。

常见的转染方法包括酵母转染、细菌转染、质粒转染和病毒转染等。

转染实验可以帮助我们了解基因调控机制和研究细胞行为的变化。

4. 测定细胞增殖实验:这种实验可以用来测定细胞增殖速度和细胞生长的影响因素。

常见的细胞增殖实验包括MTT(3-(4,5-二甲基-2-苯唑基)-2,5-二苯基四氮唑)实验、BrdU(5-溴脱氧尿苷)实验等。

这些实验可以帮助我们了解细胞增殖的分子机制和影响细胞增殖的因素。

5.测定细胞凋亡实验:细胞凋亡是一种编程性死亡的过程,是维持细胞内稳态的重要机制。

测定细胞凋亡的实验可以帮助我们研究细胞死亡的调控机制,并评估不同因素对细胞凋亡的影响。

常见的细胞凋亡检测方法包括DNA损伤、细胞膜破裂和细胞色素释放等。

6.蛋白质分离和电泳实验:这种实验可以用来分离和鉴定细胞中的蛋白质。

常见的蛋白质分离方法包括凝胶电泳、二维凝胶电泳和西方印迹等。

这些实验可以帮助我们研究细胞中不同蛋白质的表达和功能,了解蛋白质调控的机制。

7. 实时荧光定量PCR(polymerase chain reaction)实验:PCR是一种在体外合成DNA的技术。

实时荧光定量PCR可以用来定量检测靶基因在细胞中的表达水平。

这种实验可以帮助我们研究细胞基因表达的调控机制和研究基因在不同生物学过程中的功能。

如何在组织中检测细胞增殖分化和凋亡

如何在组织中检测细胞增殖分化和凋亡

如何在组织中检测细胞增殖分化和凋亡在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡是研究细胞生物学、组织学和疾病发展的重要课题。

本文将介绍一些常用的方法和技术来检测这些细胞生理过程,包括免疫组化、细胞增殖标记、细胞凋亡检测和分化指标。

一、免疫组化方法免疫组化是一种常用的方法,可用于检测特定蛋白在组织中的表达。

该方法通过对细胞或组织片进行抗体染色,来检测目标蛋白的存在和定位。

在细胞增殖方面,可以使用细胞增殖标记抗体,如Ki-67和PCNA等,来标记正在活跃增殖的细胞。

对于分化指标,可以使用特定抗体来检测目标蛋白在细胞中的表达程度。

细胞凋亡方面,可通过检测凋亡标志蛋白,如Caspase家族成员和Bcl-2家族成员等,来确定凋亡的发生。

二、细胞增殖标记细胞增殖标记是一种直接或间接标记增殖细胞的方法。

直接标记方法包括DNA染料(如荧光素-丙酮酸乙酯和乙溴脱氧尿嘧啶等)、核素标记(如3H-thymidine)和基于蛋白的标记(如30-ku小鼠脾球蛋白)。

间接标记方法则是通过检测增殖相关蛋白,如PCNA等,来获得增殖细胞的信息。

这些方法可以通过显微镜、流式细胞术和放射自显影等技术来检测增殖细胞的数量和活性。

三、细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测是评估细胞凋亡程度和机制的关键方法。

一种常用的方法是荧光染料双染色,如使用荧光素-乙酸酯(FITC)标记的 Annexin V和 PI(碘化孟松多聚物)。

Annexin V 能够结合磷脂酰丝氨酸(PS),这是凋亡时胞膜翻转的产物,而PI则用于区分凋亡和坏死细胞。

通过流式细胞术或荧光显微镜观察染色的细胞,可以准确检测到凋亡细胞的存在。

四、分化指标检测细胞分化的评估可以使用特定的抗体或染料来检测分化标志物在细胞中的表达。

例如,对于神经元的分化,可以使用抗神经元特异性抗体,如βIII-Tubulin、Neurofilament和MAP2等。

对于其他类型的细胞,也可以使用相应的特异性抗体或染料来检测。

流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤

流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤

流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤流式细胞仪是一种用于检测和分析细胞的仪器,可以通过测量细胞的荧光和散射特性来了解细胞的生理状态和功能。

在细胞生物学研究中,流式细胞仪广泛应用于细胞凋亡实验。

细胞凋亡是一种重要的细胞程序性死亡方式,正常情况下是一种维持生态平衡的重要机制,而在疾病发生时,细胞凋亡的失控会导致一系列疾病的发生。

因此,对细胞凋亡的检测和研究具有重要意义。

本文将介绍流式细胞仪检测细胞凋亡的实验步骤。

实验材料和仪器流式细胞仪细胞培养物凋亡诱导剂PBS缓冲液1×绑定缓冲液1×洗涤缓冲液荧光标记的抗体PI(胰岛素脱羧酶)Annexin V-FITC套装实验步骤1.细胞处理首先,将培养好的细胞分到不同的培养皿中,添加凋亡诱导剂,以诱导细胞凋亡。

凋亡诱导剂的种类和浓度应根据实验的需要来确定。

通常可选择小分子化合物、放射线等方式来诱导细胞凋亡。

2.收集细胞处理好的细胞经过一定时间的培养后,使用离心机将细胞沉淀下来,并用PBS缓冲液洗涤细胞,以去除培养基和凋亡诱导剂等杂质。

然后使用1×绑定缓冲液将细胞重悬。

3.细胞计数将细胞悬液加入细胞计数板中,用显微镜或自动细胞计数器计算细胞密度,并将细胞密度调整到合适的浓度。

4.细胞染色将调整好浓度的细胞悬液分到不同的离心管中,添加荧光标记的抗体和PI荧光染料。

荧光标记的抗体通常选择Annexin V-FITC,它可以与凋亡细胞膜表面磷脂酰丝氨酸结合,从而可以用于检测凋亡细胞;PI荧光染料用于检测坏死细胞。

5.混匀和孵育将离心管中的细胞悬液混匀均匀,然后在室温下孵育一定时间,通常为15-30分钟。

期间可以轻轻摇晃管子以保证充分的染色反应。

6.流式细胞仪检测染色反应结束后,将细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中,通过流式细胞仪的激光和光电探测器,可以分辨出细胞的荧光和散射信号,从而获得细胞凋亡的信息。

使用流式细胞仪之前需要对仪器进行标定和调试,以确保获得准确和可靠的数据。

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源:易生物实验浏览次数:197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death ,PCD)是细胞的生命现象之一,它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关,自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死,它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变,包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

关键词:细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death ,PCD)是细胞的生命现象之一,它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关,自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死,它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变,包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

在正常的活细胞,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在凋亡的细胞,PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。

Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。

因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素(如FITC、PE)或生物素(Biotin)标记,以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

二、实验仪器和材料Annexin V-FITC(膜联蛋白-V-FITC)500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液(Binding Buffe)r 40/20 mlPBS(1×)60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片(用于荧光显微镜观察)盖玻片(用于荧光显微镜观察)去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1.凋亡细胞的制备:小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重,10h后解剖取胸腺,分离胸腺细胞。

细胞生物学中的细胞凋亡检测和分析技术

细胞生物学中的细胞凋亡检测和分析技术

细胞生物学中的细胞凋亡检测和分析技术细胞凋亡是细胞生物学中的一个重要概念,指的是受到外界刺激或内部因素导致细胞自我死亡的生理过程。

细胞凋亡检测和分析技术对于研究细胞生命周期、生物发育、癌症等多个领域都具有重要意义。

本文将介绍几种常见的细胞凋亡检测和分析技术。

1. 流式细胞术流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究的技术,可以同时分析大量细胞的生物学特性。

在细胞凋亡检测方面,流式细胞术可以通过荧光标记检测凋亡细胞的数量和活性。

常用的凋亡指示剂有ANNEXIN V和PI(Propidium Iodide)。

2. TUNEL(端粒末端脱氧核糖核酸酶介导的dUTP尾标记)法TUNEL法是一种能够直接检测细胞凋亡的技术。

该方法利用末端转移酶将dUTP标记于凋亡细胞的DNA断口上,并通过荧光标记展示凋亡细胞的数量和特性。

TUNEL法对于体外和组织切片等多种样品形式均适用。

3. DNA Ladder实验DNA Ladder实验是一种常用的凋亡分析方法,通过检测DNA断裂形成的DNA Ladder模式来确定细胞是否发生了凋亡。

这种方法可以通过电泳分析DNA和碱性磷酸酶染色来获得结果。

4. caspase活性检测caspase是一类重要的细胞凋亡启动酶,因此检测和分析caspase的活性是判断细胞是否凋亡的有效方法。

常见的检测方法包括荧光检测和免疫印迹法。

5. 神经胶质酸性成纤维细胞酶染色法(Nissl染色法)神经胶质酸性成纤维细胞酶(Nissl体)是神经细胞体内的一个特殊结构,被广泛应用于神经细胞凋亡检测。

Nissl染色法通过对组织切片进行染色,可以观察到凋亡细胞和正常细胞的差异。

综上所述,细胞凋亡检测和分析技术在细胞生物学的研究中具有重要地位。

不同的技术手段可以提供不同的信息,帮助研究人员深入了解细胞凋亡及其在生物体内的功能及机制。

未来随着技术的不断发展,相信细胞凋亡检测和分析技术将进一步发展和完善,为细胞生物学领域的研究提供更好的工具和方法。

细胞生物学及医学遗传学实验指导

细胞生物学及医学遗传学实验指导

细胞生物学及医学遗传学实验指导实验一:拔毛细胞的制备和观察实验目的:掌握拔毛细胞制备技术和显微镜观察方法,了解细胞形态和结构。

实验方法:1.取一只小鼠或大鼠,用消毒剂擦拭身体,用镊子夹住一根毛发,在其生长的初始位置拔下。

2.将拔下的毛发放入离心管中,用10%无菌牛血清(FCS)悬浮液离心10分钟,将上清液放入新的离心管中。

3.向上清液中加入PBS,离心5分钟,去掉上清液,留下沉淀。

6.视觉显微镜下观察细胞形态。

实验注意事项:1.任何时候要保持洁净操作,避免细菌、真菌污染。

2.镊子、离心管、试管等实验器材要事先消毒,并在操作过程中保持无菌状态。

3.离心速度、时间要准确掌握,避免将细胞过度打碎。

4.视觉显微镜观察时,要准备好适合的目镜、物镜和照明条件。

实验结果:拔下的毛发通过制备,可得到细胞悬液。

在显微镜下,观察到细胞的形态和结构,可以发现其形状不规则,细胞质浅染,细胞核染色体呈现边缘离散的状态。

实验二:细胞凋亡的检测实验目的:掌握细胞凋亡的信号转导机制和检测方法,了解其在细胞生命过程中的作用。

3.向沉淀中加入PBS,磨碎细胞,使细胞悬液更均匀。

4.加入Annexin V-fluorescein染色剂和PI(荧光素愈创木酸盐)染色剂,共同检测细胞凋亡。

5.在20-30分钟的暗室中保护细胞悬液充分染色。

6.在流式细胞仪下检测细胞凋亡情况。

1.试剂和仪器准备要充分,以保证实验的重复性和可靠性。

2.在实验操作过程中,要避免样品接触光线,影响检测结果。

3.试剂染色剂使用要防止交叉污染,减少假阳性率。

通过Annexin V-fluorescein和PI染色法,可以区分细胞凋亡和坏死。

在流式细胞仪下,可以检测到细胞凋亡和坏死的数量和比例,并得出相应的结果。

细胞凋亡的特征及其检测方法

细胞凋亡的特征及其检测方法

动物医学进展,2008,29(3):1062108Progress in Veterinary Medicine细胞凋亡的特征及其检测方法3刘海峰,孙文汇,高 洪3,严玉霖(云南农业大学动物科学学院,云南昆明650201) 摘 要:细胞凋亡是动物机体组织清除受损、衰老或多余细胞的一种自杀性过程,它对于保持机体各组织器官正常生长、发育、结构、功能动态平衡和维持内环境相对稳定等都具有重要意义。

发生凋亡的细胞大多数是生物个体中多余或老化的细胞,有些也是发生肿瘤时的细胞或受到病毒或细菌感染的细胞。

根据不同的检测方法来检测不同类型的细胞凋亡,进而来研究细胞凋亡的现象和发生机制,为揭示机体与细胞凋亡的关系和疾病与凋亡的关系提供理论依据。

文章对凋亡细胞的特征、细胞凋亡各种检测方法的检测原理和结构判定,分别进行了概述。

关键词:细胞凋亡;原理;检测中图分类号:S852.33文献标识码:B文章编号:100725038(2008)0320106203 细胞凋亡(apoptosis)或称程序性细胞死亡(programmed cell deat h,PCD),是指细胞本身在一定的生理或病理条件下,按照自身的程序主动性、生理性的死亡过程,它是一个多步骤,由基因调控的发生过程,涉及到一系列基因的激活、表达以及调控作用,这是个井然有序的过程,并不是病理条件下的损伤现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

早在100多年前,人们已发现细胞凋亡这种死亡形式,但是没有给其下定义。

在20世纪70年代,病理学家Kerr J F R等[1]发现在大鼠肝细胞局部缺血条件下,肝细胞连续不断地转化为小的圆形的细胞质团,后来经过深思熟虑,在1972年提出并命名为细胞凋亡。

随后的几十年里,对细胞凋亡的研究受到许多国家科学家的广泛重视。

进入20世纪90年代,对细胞凋亡的研究更是飞速发展,获得了重大突破,受到了生物学、医学各个领域的普遍关注和重视。

细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告(经典版)编制人:__________________审核人:__________________审批人:__________________编制单位:__________________编制时间:____年____月____日序言下载提示:该文档是本店铺精心编制而成的,希望大家下载后,能够帮助大家解决实际问题。

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细胞生物学实验实验报告

细胞生物学实验实验报告

细胞生物学实验实验报告nThis XXX。

cytochemistry。

XXX。

cell culture and analysis。

cell cycle analysis。

cell n and analysis。

XXX to study the structure。

n。

and us laws of life of animal and plant cells.Chapter 1 Overview1.1 XXXXXX and structure of cells。

study cell logical processes。

conduct cell culture and analysis。

and study cell XXX.Chapter 2 Experimental PrinciplesIn this experiment。

XXX cells。

XXX。

cytochemistry。

XXX。

cell culture and analysis。

cell cycle analysis。

cell n and analysis。

XXX processes。

cell culture and analysis。

and cell XXX.2.1 实验流程和应用实验方法在本研究中,我们使用了多种实验方法来研究细胞的生理和遗传学特性。

其中,细胞器活体染色和显微观察是我们最常用的方法之一。

我们使用荧光染料来标记不同的细胞器,如线粒体、内质网和高尔基体,并使用显微镜观察它们在细胞中的位置和分布。

此外,我们还观察了细胞骨架的形态和组成,并使用冷冻保存技术来保存细胞的样本。

2.2 细胞器活体染色与显微观察为了观察细胞器在活体细胞中的分布和位置,我们使用了多种荧光染料。

例如,我们使用MitoTracker Red来标记线粒体,使用ER-Tracker Green来标记内质网,使用BODIPY FL C5-ceramide来标记高尔基体。

细胞增殖凋亡检验方法

细胞增殖凋亡检验方法

细胞增殖凋亡检验方法细胞增殖和凋亡是细胞生物学中两个重要的过程,对于细胞生长、发育和疾病发展起着关键作用。

因此,研究细胞增殖和凋亡的检验方法对于揭示相关生物学过程以及发现新的治疗靶点具有重要意义。

本文将介绍几种常用的细胞增殖和凋亡检验方法。

一、细胞增殖检验方法1.MTT法MTT法(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物)是一种常见的细胞增殖检验法。

MTT可以在活细胞内还原生成紫色的福尔马因酸化物,通过测定细胞活性来评估细胞增殖情况。

该方法的优点是简便、快速、应用广泛,但只能评估细胞整体增殖情况。

2. Bromodeoxyuridine(BrdU)标记法BrdU标记法是一种侵入法,可以评估细胞的DNA合成和增殖。

细胞在培养基中加入BrdU,细胞会将其代入新合成的DNA链中。

然后,可以使用抗BrdU抗体来检测BrdU标记的细胞。

该方法对于细胞周期和增殖动力学的研究非常有用。

标记法EdU标记法是一种新兴的细胞增殖检验方法。

与BrdU类似,EdU也是一种DNA合成的标记物,但是与BrdU相比,EdU标记更加简单快速。

EdU可以通过与荧光染料的偶联来进行检测,对于多通道染色非常适用。

1. Annexin V-FITC/PI染色法Annexin V-FITC/PI染色法是一种常用的细胞凋亡检验方法。

Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂酰丝氨酸的结合蛋白,在凋亡过程中会在细胞表面表达。

PI是一种DNA染料,用于区分凋亡和坏死细胞。

该方法可以通过流式细胞术或荧光显微镜来评估细胞的凋亡程度。

2. DNA Laddering检测法DNA Laddering检测法是一种检测凋亡的传统方法。

在细胞凋亡过程中,核酸会被酶切为200-300bp的碎片,形成明显的DNA阶梯状图案。

该方法通过DNA琼脂糖凝胶电泳来检测DNA断裂情况。

3.TUNEL法TUNEL法(dUTP尾部标记法)是一种直接检测DNA断裂的方法。

样本细胞凋亡实验报告(3篇)

样本细胞凋亡实验报告(3篇)

第1篇一、实验背景细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程,是生物体内重要的细胞生物学现象之一。

细胞凋亡在维持生物体内细胞数量的动态平衡、清除异常细胞以及抵御病原体入侵等方面发挥着至关重要的作用。

本研究旨在通过实验方法检测细胞凋亡的发生,探讨细胞凋亡在特定条件下的生物学意义。

二、实验目的1. 探讨细胞凋亡在特定条件下的发生机制。

2. 检测细胞凋亡的发生,并分析其与细胞增殖的关系。

3. 研究细胞凋亡在生物体内的生理和病理作用。

三、实验材料与仪器1. 实验材料:细胞培养液、细胞裂解液、Annexin V-FITC/PI染色试剂盒、流式细胞仪等。

2. 实验仪器:细胞培养箱、显微镜、离心机、流式细胞仪等。

四、实验方法1. 细胞培养:将细胞接种于细胞培养瓶中,置于细胞培养箱中培养至对数生长期。

2. 处理细胞:将细胞分为实验组和对照组,实验组给予特定处理,对照组不做处理。

3. 细胞裂解:将细胞用细胞裂解液裂解,收集细胞裂解液。

4. Annexin V-FITC/PI染色:将细胞裂解液与Annexin V-FITC/PI染色试剂盒混合,室温避光孵育。

5. 流式细胞术检测:将染色后的细胞用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

五、实验结果1. 实验组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05),表明特定处理可以诱导细胞凋亡。

2. Annexin V-FITC染色结果显示,实验组细胞膜上磷脂酰丝氨酸(PS)外翻,表明细胞凋亡早期发生。

3. PI染色结果显示,实验组细胞核DNA降解,形成DNA ladder,表明细胞凋亡晚期发生。

六、实验讨论1. 本实验结果表明,特定处理可以诱导细胞凋亡,提示细胞凋亡在特定条件下受到严格调控。

2. Annexin V-FITC染色和PI染色结果显示,细胞凋亡过程分为早期和晚期两个阶段。

早期阶段,细胞膜上PS外翻,细胞膜完整;晚期阶段,细胞核DNA降解,细胞膜通透性增加。

3. 细胞凋亡在生物体内具有重要作用。

细胞凋亡 凋亡小体检测

细胞凋亡 凋亡小体检测

细胞凋亡凋亡小体检测细胞凋亡:凋亡小体检测细胞凋亡(apoptosis)是一种程序性细胞死亡形式,它在维持机体正常发育、维护组织稳态以及免疫应答等过程中起到重要作用。

凋亡小体(apoptotic bodies)是细胞凋亡的标志物之一,其检测是研究细胞凋亡机制的重要手段。

一、凋亡小体的形成过程细胞凋亡是一个高度规范化的过程,可分为三个主要阶段:收缩期、核碎裂期和凝固期。

在收缩期,细胞体积缩小、细胞核发生凝缩和DNA切割。

在核碎裂期,细胞核DNA发生断裂,形成典型的DNA断裂片段。

在凝固期,细胞表面形成凋亡小体,包括孔洞结构和细胞膜残骸。

二、凋亡小体检测方法1. 相差干涉显微镜观察可以通过相差干涉显微镜观察凋亡小体的形态特点。

凋亡小体通常呈圆形或椭圆形,内部结构明显可见。

2. 荧光显微镜观察荧光染色技术是广泛应用的凋亡小体检测方法之一。

利用DNA结合染料,如荧光素磷酸酯(fluorescein isothiocyanate,FITC)或乳香红酸盐(propidium iodide,PI)等,可对凋亡小体进行染色,观察其形态和分布情况。

3. 流式细胞术检测流式细胞术是一种高通量的细胞分析技术,可用于凋亡小体检测。

在流式细胞仪中,通过染色标记,利用细胞大小和复杂度参数识别凋亡小体,进一步进行数量和形态分析。

4. 电子显微镜观察电子显微镜是一种高分辨率的显微镜技术,可直接观察细胞中的凋亡小体。

通过电镜技术,可以观察到凋亡小体的细胞器残留结构和表面形态。

5. 其他检测方法除了上述几种常用的凋亡小体检测方法外,还有一些其他技术可以用于凋亡小体的检测。

如DNA断裂末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)可以标记DNA断裂片段;凋亡小体标记法(apoptotic bodies labeling)可以利用特定抗体对凋亡小体进行标记,进而进行分析。

细胞凋亡实验报告

细胞凋亡实验报告

实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测一、实验目的学习细胞凋亡诱导及检测。

二、实验原理1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程,是细胞衰老自然死亡的主要方式之一,是一种自然的生理学过程。

与细胞坏死不同,不会引起炎症反应,不释放细胞内容物。

2.DAPI是一种荧光染料,它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用,从而与DNA紧密结合,可在紫外下激发蓝光。

三、实验材料8.8mol/L的H2O2溶液,甲醇,PBS溶液,10μg/mL的DAPI染液四、实验步骤1.细胞传代(上一次实验完成)2.凋亡诱导1)取做H.E染色的小皿,加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。

3. 染色1)收集细胞,观察,贴壁细胞较多,直接用PBS溶液洗2)吸出洗液,加入500μL甲醇,室温固定10min3)倒掉甲醇,PBS洗净,加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液,于37℃染色10min4)倒掉染液,用PBS洗净(注意避光),加入500μLPBS溶液,倒置荧光显微镜下观察并拍照。

五、实验结果与分析1.观察:实验开始前镜检:细胞贴壁较多,细胞有的仍呈不规则状,有的细胞已皱缩,还有一些细胞呈圆形浮在培养基中,核质分界不明显。

可以看到有的细胞处于裂解状态。

染色后:由于DAPI染料只对核进行染色,所以在紫外下只可见核的结构。

视野里最多的是正常细胞,其特点是染色质均一且核表面光滑,说明凋亡是不同步的。

凋亡各时期的细胞也都可见,其主要特点是染色不均一。

凋亡前期和中期的细胞较多。

很少看到凋亡末期的细胞,除了这个时期细胞较少外,还可能因为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。

而且有的细胞在正常光下观察是明显的裂解状态,但是到紫外光路下就变得很不明显了。

另外,可以看到很多分裂期的细胞,其特点为染色深,细胞核染色质浓缩,但是看起来较均一,往往有对称性,特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在一起。

生物实验 主要研究内容及方法

生物实验 主要研究内容及方法

生物实验主要研究内容及方法生物实验是生物学研究的重要手段之一,通过实验可以深入了解生物体的结构、功能、生理和生态等方面的特点。

本文将重点介绍生物实验的主要研究内容和方法。

一、研究内容生物实验的研究内容涉及生物体的各个方面,主要包括以下几个方面:1. 细胞生物学研究:通过观察和实验,研究细胞的结构、功能、分裂、凋亡等过程。

例如,通过显微镜观察细胞的形态变化,利用细胞培养技术观察细胞的分裂过程。

2. 分子生物学研究:通过实验手段研究生物分子的结构、功能和相互作用。

例如,利用PCR技术扩增和分析DNA片段,利用蛋白质电泳技术分离和鉴定蛋白质。

3. 遗传学研究:通过实验方法研究基因的遗传规律和遗传变异。

例如,利用杂交实验研究基因的遗传模式,利用基因工程技术构建转基因生物体。

4. 生理学研究:通过实验手段研究生物体的生理功能和调节机制。

例如,通过实验观察动植物对环境的适应性和反应性,研究生物体的呼吸、消化、循环等生理过程。

5. 生态学研究:通过实验手段研究生物体与环境的相互关系和生态系统的结构和功能。

例如,通过实验观察生物体在不同环境条件下的适应性和相互作用。

二、研究方法生物实验的研究方法多种多样,根据研究内容和目的的不同,可以选择合适的方法进行实验。

下面介绍几种常用的生物实验方法:1. 显微镜观察:利用光学显微镜、电子显微镜等观察生物体的形态、结构和细胞组织的特点。

通过显微镜观察,可以揭示生物体的微观结构和细胞器的功能。

2. 细胞培养:将细胞分离培养在含有适当营养物质的培养基中,观察和研究细胞的生长和分裂过程。

细胞培养技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学和病理学等领域的研究。

3. PCR技术:聚合酶链反应(PCR)是一种基于DNA复制的技术,可以迅速扩增特定的DNA片段。

通过PCR技术,可以分析DNA 序列的变异和遗传信息,应用于基因组学、遗传学、分子进化等领域的研究。

4. 蛋白质电泳:利用电泳技术对蛋白质进行分离和鉴定。

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实验目的:1.了解凋亡细胞的形态学特征,加深对于细胞凋亡现象及本质的理解。

2.了解并掌握细胞凋亡检测的方法和基本原理。

实验原理:细胞凋亡时,出现一系列形态学变化,包括凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状,染色质的DNA出现缺口甚至断裂,出现DNA碎片,并逐渐形成凋亡小体等,经相应的染色后可以在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察到这些变化。

从而把凋亡的细胞和正常的细胞区分开来。

细胞凋亡是指细胞对环境的生理、病理性刺激信号、环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。

细胞凋亡是一个主动过程,涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下的自体损伤,而是为更好地适应生存环境的一种死亡过程。

1.细胞凋亡与细胞程序性死亡:细胞程序性死亡的概念是指一个多细胞生物体中某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的,并受到严格程序控制的正常组成部分。

例如蝌蚪变成青蛙,其变态过程中尾部的消失伴随大量细胞死亡,高等哺乳类动物指间蹼的消失、颚融合、视网膜发育以及免疫系统的正常发育都必须有细胞死亡的参与。

这些形形色色的在机体发育过程中出现的细胞死亡有一个共同特征:即散在的、逐个地从正常组织中死亡和消失,机体没有炎症反应,而且这种死亡对整个机体的发育是有利和必须的。

因此认为动物发育过程中存在的细胞程序性死亡是一个发育学概念,而细胞凋亡则是一个形态学的概念,但是一般认为这两个概念可以交互使用,具有同等意义。

2.细胞凋亡与坏死的区别:虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似,但它们的过程与表现却有很大差别。

坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。

表现为细胞胀大、胞膜破裂、细胞内容物外溢、核变化较慢、DNA降解不充分、有局部严重的炎症反应。

坏死是一个被动的过程,其细胞及组织的变化与凋亡有明显的不同。

细胞凋亡的生物学特征:形态学变化形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的,细胞凋亡往往涉及单个细胞,即便是一小部分细胞也是非同步发生的。

首先出现的是核糖体、线粒体等聚集,细胞体积缩小,细胞间连接消失,与周围的细胞脱离,然后是细胞质密度增加,线粒体膜电位消失,通透性改变,释放细胞色素C到胞浆,染色质逐渐凝聚成新月状附于核膜周边,嗜碱性增强。

细胞核固缩呈均一的致密物,进而断裂为大小不一的片段,核膜核仁破碎,DNA降解成约180bp-200bp的小片段,胞膜有小泡状形成,膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面,胞膜结构仍然完整,最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个由胞膜包裹的凋亡小体,因为细胞膜保持完整,没有细胞内容物的外溢,因此不引起周围的炎症反应,凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。

细胞凋亡的生物学特征:生物化学变化1、DNA的片段化细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解,这是一个较普遍的现象。

这种降解特异并有规律,所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数,而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度,提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断,产生不同长度的寡聚核小体片段,实验证明这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死则为弥漫的连续图谱。

2、大分子合成细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解,在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。

如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中,加入RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。

细胞凋亡的过程:接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→进入连续反应过程。

1、凋亡的启动阶段:细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭,目前比较清楚的通路主要有:1)细胞凋亡的膜受体通路2)细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经2、凋亡的执行:尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚,但是已经确定Caspase(半胱天冬蛋白酶)在凋亡过程中是起着必不可少的作用,细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程(激活特定的核酸酶、破坏细胞结构、促使调节蛋白丧失功能)。

保留的细胞不健康的细胞细胞开始收缩细胞崩溃分解成碎片不健康的细胞已被除去,组织内附近的细胞进行有丝分裂,合上缺口细胞凋亡的诱导试剂:名称工作浓度溶剂Actinomycin D 500ng/ml 甲醇Aphidocolin2ug/ml 二甲亚砜A23187 10uM 二甲亚砜Caffeine 16mM 沸水Camptothecin4ug/ml 二甲亚砜Cycloheximide100ug/ml 水Dexamethasone1uM 乙醇Doxorubicin0.2ug/ml 水5‐Fluorouracil 25ug/ml 二甲亚砜,热水Hydroxyurea500nM 水Paclitaxel100‐580nM 二甲亚砜Staurosporine500nM 二甲亚砜Thymidine2mM 磷酸盐缓冲液Vinblastine60nM 甲醇细胞凋亡的检测方法:1.根据细胞凋亡的形态变化(如凋亡小体的出现、染色质浓缩)2.根据细胞核DNA变化(如测定高低分子质量DNA的变化、梯状条带)3.根据细胞膜通透性改变(如测定标记蛋白、标记酶的释放)4.根据细胞膜成分外露(如测定磷脂酰丝氨酸)细胞凋亡的检测方法:1、形态学观察方法:①Gimsa染色:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象,晚期凋亡细胞可见凋亡小体。

②台盼蓝染色:台盼蓝染料可以进入细胞膜不完整、破裂的坏死细胞。

③Hoechst染色:细胞核为蓝色。

凋亡细胞的染色质凝聚且边缘化,可见DNA碎片。

④PI(碘化丙啶)染色:正常细胞的细胞核呈红色;早期凋亡细胞胞核浓缩,染色加深,或核染色质聚集于核膜一边,呈新月状;晚期凋亡细胞胞核碎裂成大小不等的原形小体,并被细胞膜所包绕,即凋亡小体。

⑤AO(吖啶橙)和EB(溴化乙锭)双染色:AO可以透过细胞膜完整的细胞而嵌入核DNA呈绿色,EB只能透过细胞膜破损的细胞而嵌入核DNA呈红色。

显微镜下观察,活细胞为荧光深浅不一的结构样特征,核染色质为绿色;凋亡细胞染色强,亮度高,核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体或均匀一致的圆状或固缩团状结构。

⑥透射电镜观察:凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”,同时可以观察到凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬。

细胞凋亡的检测方法:2、DNA凝胶电泳:细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。

但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别:正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状条带;坏死细胞DNA电泳为连续性条带。

3、磷脂酰丝氨酸外翻分析法(凋亡早期):磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。

Annexin-V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。

将Annexin-V进行荧光素标记后作为荧光探针,结合荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

细胞凋亡的检测方法:4、线粒体膜电位变化的检测(凋亡早期):线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前。

可以导致膜通透性的改变。

MitoSensor TM为一个阳离子性的染色剂,对此线粒体跨膜电位改变非常敏感,呈现出不同的荧光染色。

正常细胞中,它在线粒体中形成聚集体,发出强烈的红色荧光。

凋亡细胞中,因线粒体穿膜电位的改变,它以单体形式存在于细胞液中,发出绿色荧光。

用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。

5、Caspase-3活性的检测(凋亡早期):Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中Caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。

Caspase-3正常以酶原(32kD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17kD)和两个小亚基(12kD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。

但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,Caspase-3的活性明显下降。

细胞凋亡的检测方法:5、TUNEL法(凋亡晚期):细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3’-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal–deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL)。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色。

TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

6、凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析(凋亡不同时期)实验器材:普通光学显微镜、荧光显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、注射器、滤纸、胶头吸管、细胞计数板、移液器、移液管、24孔板、烧杯、容量瓶、酒精灯。

实验试剂:1.293Cell、DMEM、FBS、H2O2、PBS、乙醇。

2.Gimsa染液:0.5g Gimsa溶于50ml甲醇中,在研钵中充分研磨,溶解后加入50ml甘油,混合均匀后至于37℃恒温箱中放置10小时,用棕色瓶密封保存备用。

3.Hoechst33258染液:超纯水溶解Hoechst33258至终浓度为1mg/ml,在4℃长期保存。

PI(碘化丙啶)染液:PI溶于含0.1%TritionX-100的PBS中,终浓度为50μg/ml,含RNase100μg/ml,避光保存。

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