各种酶固定方法
酶固定化方法及载体特性
酶固定化一般方法及载体特性酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。
但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。
1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。
固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。
1酶固定化的传统方法关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进，酶载体推荐创科催化酶载体树脂。
1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。
显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。
但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。
1.2包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。
这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。
1)网格型将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。
也称为凝胶包埋法。
2)微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。
由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
1.3结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。
酶的固定化方法
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酶的固定化方法
酶的固定化方法不下百种，归纳起来大致可以分为三类，即载体结合法、交联法和包埋法。
载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。
根据固定方式的不同，这种方法又可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。
物理吸附法是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。
离子结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法，载体有离子交换树脂等。
共价结合法是指酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。
交联法是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。
交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。
包埋法是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。
前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。
清华同方教育技术研究院。
固定化酶的化学制备方法
固定化酶的化学制备方法固定化酶是指将酶在一定条件下固定在某种多肽或多糖材料中，使其具有较高的稳定性和重复使用性。
固定化酶制备方法有很多种，下面就简单介绍一下常用的几种方法。
第一种是物理固定化法。
这种方法是通过将酶分子与载体材料表面的静电作用、氢键作用等力量结合在一起，从而实现酶的固定化。
常用的物理固定化方法包括吸附、沉淀、共价键等把酶与载体结合在一起。
吸附法是一种较简便、经济的酶固定化方法，但稳定性较差，适用于临时使用。
沉淀法是一种先定制载体材料，再将酶溶液与载体材料混合沉淀制成的固定化方法，能增强酶的稳定性。
共价键法则通过选择适当的交联剂将酶与载体基质之间形成强化学键，形成高度稳定的固定化酶。
第二种是化学固定化法。
这种方法是以某种化学反应方式将酶与载体结合，常见的方法有选择性基团反应和交联剂交联反应两种方法。
选择性基团反应是先在载体表面引入一些特定的官能团，再通过这些官能团再将酶基质固定在载体上，这种方式可以提高酶的活性和稳定性。
交联剂交联反应则是将酶与载体结合的过程中，通过交联剂，形成交联的结构，这种方法稳定性较高、经济实用，但固定化酶的活性较低，不适用于活性较高的酶。
第三种是生物固定化法。
生物固定化法是通过生物体系的作用将酶基质固定在载体材料上，这种方式主要适用于多肽、多糖等含有复杂生物结构的材料。
这种方法优点是酶的活性和特异性较高，但固定化酶的稳定性一般较差。
以上三种方法都可以用来制备固定化酶，不同的固定化方法适用于不同的酶类型、活性、载体材料等。
在实际制备过程中，需要根据实际情况选取相应的方法，以获得稳定和活性高的固定化酶。
酶的固定化技术
R-O-CH2 –CON3 +E-NH2 R-O-CH2 –CONH-E R-O-CH2 –CON3 +E-OH R-O-CH2 –CO-O-E R-O-CH2 –CON3 +E-SH R-O-CH2 –CO-S-E
定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶的固定化技术
三、固定化酶的制备原则
✓ 必须注意维持酶的催化活性及专一性 ✓ 固定化应该有利于生产自动化、连续化 ✓ 固定化酶应该有最小的空间位阻 ✓ 酶与载体必须结合牢固 ✓ 固定化酶应有最大的稳定性 ✓ 固定化酶成本要低
酶的固定化技术
（2）界面聚合法： 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原
理包埋酶。 例：将酶和已二胺的水溶液与葵二酰氯的甲苯溶
液混合，再加SPAN乳化已二胺和葵二酰氯，在水相和 有机相的界面聚合形成包埋酶的颗粒。
酶的固定化技术
（三）结合法
1、离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素。
酶的固定化技术
四、固定化酶的优缺点
优点
➢ 固定化酶可以重复，使用效率高，成本低 ➢ 极易将固定化酶与底物、产物分开； ➢ 在大多数情况下，能提高酶的稳定性； ➢ 具有一定的机械强度可以在较长时间内进行反
复分批反应和装柱连续反应； ➢ 酶反应过程能够加以控制； ➢ 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； ➢ 较游离酶更适合多酶反应； ➢ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ➢ 酶的使用效率提高，成本降低。
固定化酶的方法
固定化酶的方法
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶，具有高效、稳定、重复使用等优点。
下面是一种常用的固定化酶方法。
材料：
- 酶
- 载体（如聚丙烯脂、硅胶、玻璃等）
- 活性剂（如戊二醛、双醛、聚乙二醇等）
- 缓冲液（如PBS缓冲液）
- 洗涤液（如去离子水或PBS缓冲液）
步骤：
1. 制备载体：将载体清洗干净并消毒，然后在室温下干燥或烘干。
2. 固定化酶：将制备好的载体浸泡在含有活性剂的缓冲液中，搅拌均匀。
然后加入适量的酶，搅拌均匀并放置一段时间（根据不同的活性剂和载体类型，时间不同）。
最后用洗涤液洗净固定化酶。
3. 检测固定化酶活性：采用适当的方法检测固定化酶的活性，如比色法、荧光法等。
4. 贮存固定化酶：将固定化酶保存在干燥、阴凉、密闭的容器中，避免受潮和受热。
注意事项：
1. 活性剂的选择应根据酶的特性和载体的特点进行选择。
2. 固定化酶活性与载体、活性剂、酶的比例等因素有关，需要进行优化实验。
3. 贮存时要避免温度过高或过低，否则会影响固定化酶的稳定性和活性。
以上是一种常用的固定化酶方法，具体操作时应根据实验要求和条件进行调整。
固定化酶的方法和应用
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶催化系统的过程。
通过固定化，可使酶的活性和稳定性得到提高，并能够重复使用。
常用的固定化酶方法包括吸附法、共价连接法、包埋法和交联法等。
1. 吸附法：利用载体表面与酶相互吸附的原理将酶固定在载体表面。
常用的载体包括硅胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
2. 共价连接法：通过将酶分子与载体分子之间的化学键共价连接，在载体表面上固定酶。
常用的共价连接剂包括辛二酸二酐、戊二酸二酐等。
3. 包埋法：将酶包裹在聚合物中，在聚合物内部形成微观环境，保护酶免受外界环境的影响。
常用的包埋材料包括明胶、蛋白质和聚乙烯醇等。
4. 交联法：将酶和载体分子之间形成交联结构，将酶牢固地固定在载体表面上。
常用的交联剂包括戊二醛、葡萄糖等。
固定化酶在生物技术、食品工业、医药工业等领域有着广泛的应用。
其中，利用固定化酶在生物技术领域中最为突出。
例如，固定化酶可以应用于产生大量纯度高的特定酶，用于DNA重组、制备抗体和识别特定分子等。
此外，在医药工业中也广泛使用固定化酶，如利用固定化酶制备药物、检测生物标志物等方面。
在食品工业中，固定化酶可用于生产乳制品、果汁、啤酒等食品中。
总之，固定化酶是一种重要的生物技术手段，具有广泛应用前景，可推动生物技术、食品工业、医药工业等领域的发展。
酶与细胞固定化的方法
酶与细胞固定化的方法酶呀，就像是细胞世界里的小精灵，它们有着神奇的魔力，可以加速各种化学反应的进行。
那怎么才能把这些小精灵更好地利用起来呢？这就涉及到细胞固定化啦！细胞固定化，简单来说，就是给酶找个安稳的“家”，让它们能老老实实地在那里发挥作用。
那都有哪些方法呢？有一种方法就像是给酶盖房子，这就是吸附法。
就好像磁铁能吸住铁钉一样，一些具有吸附能力的材料可以把酶吸附住。
这些材料就像是酶的小窝，让酶舒舒服服地待在里面。
这种方法简单又方便，不需要太复杂的操作。
还有包埋法，这就好像把酶包在一个小口袋里。
用一些特殊的材料形成一个小网格，把酶困在里面。
酶在这个小口袋里依然可以自由活动，发挥它们的本领。
交联法呢，就像是给酶之间拉起很多“绳子”，让它们彼此连接固定起来。
就像小朋友们手牵手一样，这样酶就不容易乱跑啦。
这些方法各有各的特点和适用情况呢。
比如说吸附法，操作简单，但是可能不太牢固，酶容易跑掉。
包埋法呢，能很好地保护酶，但有时候可能会影响酶的活性。
交联法比较牢固，但操作起来可能稍微麻烦一点。
那我们为什么要费这么大劲去固定化酶呢？这好处可多啦！固定化后的酶可以重复使用呀，就像我们的工具一样，用了一次还能再用，多划算！而且它们的稳定性也提高了，不会轻易被破坏。
这就好比一个娇弱的小公主变成了坚强的女战士。
想象一下，如果没有这些细胞固定化的方法，我们的很多生产过程会变得多么麻烦呀！酶就像一群调皮的小孩子，到处乱跑，不好管理。
但是有了这些方法，它们就变得乖乖的，为我们的生活和生产带来了很多便利。
在实际应用中，我们要根据具体的情况选择合适的方法。
就像我们穿衣服一样，不同的场合要穿不同的衣服。
我们要让酶在最合适的环境中发挥最大的作用。
总之，酶与细胞固定化的方法是非常重要的，它们就像是打开生物技术大门的钥匙。
让我们更好地利用这些神奇的酶，为我们的生活创造更多的美好和可能吧！难道不是吗？。
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
酶的固定化
3、结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
1) 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。
常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
2) 共价键结合法载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：(1 )天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；(2)有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等(3 )无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。
用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：Asp Glu 侧链的一COOH、C-末端的一COOH ; Tyr 的苯酚基；Cys 的一SH; Lys 的&NH2、N-末端一NH2；Thr、Ser 的一OH ; His 的咪唑基。
在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。
载体活化方法：(1 )重氮化法(2)叠氮法(3 )溴基化法(4)烷基化法等。
4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。
常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。
其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个一NH2,戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。
交联酶法借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
可视为一种无载体的固定化方法。
如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2〜7.2, 0C下交联24h，可制成固定化酶。
共交联法共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。
通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。
酶的固定化技术
（3）溴化氰法
对于带-OH的载体如葡萄糖、纤维素、琼脂 糖来说是最常用的反应。在碱性条件下载体 -OH和BrCN反应生成极活泼的亚氨基碳酸酯 衍生物，它们在碱性条件下可与酶的氨基进 行共价偶联反应。
OH CNBr（ 碱 性 ）
R OH
碱性
O
R O
NH +ENZ
N
O R
水
OH
O R
OH O
R O
O R
五、如何进行酶固定化
吸附法、包埋法、结合法、交联法
固定化酶的模式图
（一）吸附法
定义；利用各种固体吸附剂将酶或含酶细胞 吸附在其表面上而使酶固定的方法称为物理吸
附法，简称吸附法。
常用的吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻土、 多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
▪优点：操作简便、条件温和、不易变性失活、 载体廉价、可反复使用。 ▪缺点：酶与载体结合不牢固，易脱落。
R-O-CH2 –CONH2-NH2 +HNO2 R-O-CH2 –CON3 +H2O
R-O-CH2 –CON3 +E-NH2 R-O-CH2 –CON3 +E-OH R-O-CH2 –CON3 +E-SH
R-O-CH2 –CONH-E R-O-CH2 –CO-O-E R-O-CH2 –CO-S-E
优点 条件温和、操作简便、活力损失少。 缺点 酶与载体结合不牢固，使用时需严格控
酶的固定化技术
5.固定化酶的米氏常数(km)的变化
固定化酶的表观米氏常数km随载体的 带电性能变化。 当酶结合于电中性载体时，由于扩散限 制造成表观米氏常数km上升。 若载体与底物带有相反电荷，固定化酶 的表观米氏常数km低于游离酶的km。 若载体与底物电荷相同时，就会造成固 定化酶的表观米氏常数km显著增加。
作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物
特异性没有明显变化。
如：氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构 酶。
可作用于大分子底物，又可作用于低分子底
物的酶，固定化酶的底物特异性往往会发生变 化。
如：以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸 酶，当以核糖核酸为底物时，催化速度仅为游离酶的 2%左右，而以环化鸟苷酸为底物时，催化速度可达 游离酶的50%~60%。
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
交联反应可以发生在酶分子间也可以发生在酶分子内。 在低酶浓度下一般形成分子内交联，交联后的酶通常保 持溶解状态。在酶浓度升高情况下分子间交联比例上升。 形成的固定化酶通常为不溶解状态。 酶50-200mg/ml，戊二醛0.3-0.6%时，固定化酶活性高。 一般主张交联剂和酶最适合比例为1：10（W/W）。采 用的pH值一般与被交联的酶的等电点相同。
（二）包埋法
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载 体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
根据包埋的材料和包埋方法的不同，可分 为：凝胶包埋法和半透膜包埋法两类。
1、凝胶包埋法
将酶分子包埋在凝胶格子里。
凝胶包埋法用得最多、最有效，但不适用于底物或产
物分子很大的酶类的固定化。
条件温和，操作简便，对酶活 影响小，但强度差。
e.g.
Cl Cl
N
酶的固定化方法及优缺点
酶的固定化方法及优缺点以酶的固定化方法及优缺点为标题，本文将详细介绍酶的固定化方法以及各种方法的优缺点。
一、酶的固定化方法1. 物理吸附法：将酶直接吸附在固体载体表面，如活性炭、硅胶等。
这种方法简单易行，不需要化学反应，但酶容易失活和流失。
2. 共价键结合法：通过化学手段将酶共价键结合在载体表面，常用的方法包括交联、酯化、酰胺化等。
这种方法能够稳定地固定酶，但可能会影响酶的活性和稳定性。
3. 包埋法：将酶包裹在多孔载体中，如凝胶、微胶囊等。
这种方法能够保护酶免受外界环境的影响，但可能会降低酶的反应速率。
4. 共聚物法：利用聚合物将酶固定在载体上，如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇等。
这种方法可以提高酶的稳定性和反应速率，但可能会影响酶的活性。
二、各种固定化方法的优缺点1. 物理吸附法的优点是操作简单、成本低廉，但缺点是酶容易失活和流失，固定效果不稳定。
2. 共价键结合法的优点是能够稳定地固定酶，固定效果较好，但缺点是可能会影响酶的活性和稳定性。
3. 包埋法的优点是能够保护酶免受外界环境的影响，固定效果较稳定，但缺点是可能会降低酶的反应速率。
4. 共聚物法的优点是可以提高酶的稳定性和反应速率，固定效果较好，但缺点是可能会影响酶的活性。
在实际应用中，选择适合的固定化方法需要考虑多个因素，如酶的特性、反应条件、载体的稳定性和成本等。
不同的固定化方法适用于不同的酶和反应条件。
例如，对于温度敏感的酶，可以选择物理吸附法或包埋法；对于活性较强的酶，可以选择共价键结合法或共聚物法。
总结起来，酶的固定化方法有物理吸附法、共价键结合法、包埋法和共聚物法等。
每种方法都有其优缺点，选择适合的固定化方法需要综合考虑多个因素。
通过固定化方法，可以提高酶的稳定性、反应速率和重复使用性，从而在酶工业和生物催化领域具有广泛的应用前景。
酶的固定化方案
酶的固定化的方案一、材料和方法1.实验材料及试剂酶，25%戊二醛溶液，带氨基的载体，考马斯亮蓝，牛血清白蛋白。
2. 主要实验仪器紫外可见光分光光度计Uv-1800，THZ一C恒温振荡器，MD200一3型电子天平PHS一3C酸度计3.酶的固定化方法1）载体的活化a 对所得的载体表面带有大量的氨基，对其进行活化处理可用于酶蛋白的共价结合。
采用戊二醛为活化试剂，使凝胶表面连接上游离的醛基。
具体方法为:将lg带氨基的载体颗粒臵于3ml、10%的戊二醛溶液中振荡24h，然后真空过滤。
所得固体用去离子水洗涤多次，干燥后即为戊二醛活化的树脂颗粒。
b大孔树脂预处理方法：称取10g树脂于锥形瓶中，用95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤，用1L蒸馏水冲洗。
树脂依次用25mL的5%HCl和5%NaOH溶液浸泡4h后抽滤，用蒸馏水洗至中性。
抽滤后臵于4℃冰箱中干燥4h，室温保存备用。
举例：称取适量经预处理的大孔树脂于50mL锥形瓶中，加入适量磷酸缓冲液（pH7.5，0.05mol/L）和适量的酶，臵于恒温水浴振荡器中吸附一定时间后（37℃，150r/min）真空抽滤，并用100mL缓冲液冲洗载体，抽干后臵于4℃冰箱中干燥4h，并于4℃冰箱中密封保存。
2）固定化方法a 共价结合法准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。
然后于冰浴中缓慢振荡24h。
之后离心收集固体，用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。
b 酶聚集体包被法准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。
然后于冰浴中缓慢振荡24h。
之后向混合液中加入0.5ml、2%的戊二醛溶液，继续振荡10h，离心收集固体。
最后用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。
c.酶活性的测定d. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度固定化时溶液中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定：考马斯亮蓝试剂的配制：将考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至 1000mL。
酶固定化方法
酶固定化方法酶是一种生物催化剂，能够在生物体内促进化学反应的发生，并具有选择性、高效率等特点，被广泛应用于药物合成、化妆品生产、食品加工、农业等领域。
然而，酶在生产过程中易受到环境条件、物质浓度、PH值等因素的影响，其失活速度也较快，因此需要采用酶固定化方法来提高酶的稳定性和重复使用性。
酶固定化是指将酶分子固定在一定的载体上，形成酶固定化催化剂，以提高酶的稳定性、活性和寿命，并使其能够重复使用。
酶固定化的优点在于可以有效地降低生产成本，提高产品的纯度和产量，减少废物的生成，并且有利于环境保护。
常见的酶固定化方法有物理吸附法、化学共价键结合法、交联共价键结合法、磁性分子筛固定法等。
1.物理吸附法物理吸附法是一种简单易行的酶固定化方法，主要是利用载体表面的物理吸附力将酶固定在载体上。
常用的载体有纤维素、硅胶、氧化铝、纳米颗粒等。
物理吸附法具有操作简单、成本低、不影响酶的活性、经济实用等优点，但固定效果不够稳定，易受到温度、PH值、离子浓度等因素的影响，且固定效率较低。
2.化学共价键结合法化学共价键结合法是将酶固定于载体表面通过共价键（如酯键、硫醇键、胺键等）连接，酶与载体结合更牢固。
此方法的固定效果稳定，易于操作，但可能影响酶的活性，且固定剂的使用可能会增加成本。
交联共价键结合法是一种主要针对大分子酶的固定化方法，其原理是将酶分子与载体交联，形成较牢固的内部网络结构，通过物理和化学交联结合将酶固定在载体上。
该方法具有较好的固定效果和稳定性，并且可以在不影响酶的活性的情况下实现酶的固定化。
4.磁性分子筛固定法磁性分子筛固定法是一种新型的酶固定化方法，利用磁性颗粒作为载体，采用超声波或磁力场等手段使酶分子与磁性颗粒产生交互作用，从而固定酶分子。
此方法具有简单易行、操作方便、固定效果好等优点，适用于固定化小分子酶和大分子酶。
第三节酶的固定化
第三节酶的固定化随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。
将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。
一、固定化酶的制备方法制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等（图2-3）。
1．包埋法将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。
凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。
最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。
微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。
常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。
2．吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。
吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。
吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。
但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱落。
3．共价偶联法利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。
这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。
缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。
共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。
4．交联法交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。
其中应用最广泛的是戊二醛。
用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。
第十三章 酶固定化
烷基化法
含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化， 然后与酶分子上的氨基、巯基、羟基发生烷基化反应， 制备固定化酶
共价结合法
特点：
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连
续使用。
缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而
影响酶的催化活性。
4、交联法
定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间进行交 联反应，制备固定化酶的方法。 常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等双功能试剂。 特点：
喷雾干燥 淀粉 淀粉酶 液化液 糖化酶 糖化液 结晶 异构酶 结晶葡萄糖 果糖42% 葡萄糖55% 低聚糖 高果糖浆 果糖浆 果糖80-90% 果糖55% 葡萄糖39% 低聚糖 氢化还原 粉状葡萄糖 山梨醇
果葡糖浆 混合
分离
天门冬氨酸酶 青霉素酰化酶 延胡索酸酶 β-半乳糖苷酶 天门冬氨酸-β-脱羧酶 脂肪酶
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法
结合法 共价键结合法 离子键结合法 制备难易 难 易 包埋 法 吸附法 交联 法
较难
易
较难
结合程度
活力回收 再生 费用 底物专一性
强
低 不能 高 可变
中等
高 可能 低 不变
强
高 不能 低 不变
弱
高， 酶易流失 可能 低 不变
强
中等 不能 中等 可变
三、固定化酶的性质 1、酶的稳定性。
第十三章 酶固定化
第一节 酶的固定化
酶的固定化方法
固定化酶的性质 固定化酶的应用
为什么要将酶固定化？
游离酶在应用中的不足
稳定性较差； 难于回收重复利用；
给后续分离纯化增加困难。
酶固定方法
酶固定方法嘿，咱今儿个就来唠唠酶固定方法这档子事儿！你说酶这玩意儿多神奇呀，就像个小魔法师，在各种化学反应里大显身手。
那要怎么把它好好地固定住呢？先来说说吸附法吧！这就好比是给酶找个舒服的小窝，让它能安安稳稳地待着。
就像你找到一个特别合心意的座位，舒舒服服地坐着不想起来。
通过一些有吸附能力的材料，把酶吸附在上面，让它乖乖地发挥作用。
这种方法简单又直接，是不是挺有意思？再讲讲包埋法呀，这就好像给酶穿上了一层保护衣。
把酶包裹在一个小小的空间里，让它既能活动，又不会乱跑。
就像给小宝贝裹上温暖的小毯子，既安全又舒适。
这样酶就能在它的小天地里好好工作啦。
还有共价结合法呢！这就像是给酶和载体之间系上了一条牢固的绳子，把它们紧紧地绑在一起。
它们就成了亲密无间的伙伴，一起面对各种挑战。
这种结合可是很牢固的哟，酶也能更稳定地发挥作用啦。
交联法也不能落下呀！这就好像把好多酶聚集在一起，形成一个强大的团队。
它们相互支持，共同努力，让反应进行得更顺利。
是不是感觉很厉害？每种方法都有它的特点和优势呢！就像不同的工具，在不同的场合都能发挥大作用。
咱在选择的时候可得好好琢磨琢磨，根据具体的情况来决定用哪种方法最合适。
比如说，如果咱想要操作简单方便，那吸附法可能就是个不错的选择；要是想要更稳定更长久的效果，共价结合法或者交联法也许更合适。
这就跟咱挑鞋子一样，得根据要去的地方、要做的事情来选合适的那双。
而且呀，在实际应用中，还可能会把这些方法结合起来用呢！就像咱做饭的时候，会把各种调料搭配起来，让味道更美味。
这样能让酶固定得更好，发挥出更大的作用。
总之呢，酶固定方法可真是个有趣又重要的领域。
它就像一把钥匙，能打开很多神奇的大门，让酶在各种领域大显身手。
咱可得好好研究研究，让这些小魔法师更好地为我们服务呀！怎么样，现在对酶固定方法是不是有了更清楚的认识啦？。
酶的固定方法
酶的固定方法
1. 包埋法！就像给酶穿上一件温暖的保护衣，把它包裹起来。
比如说做豆腐，那凝固剂不就把豆浆里的蛋白给固定住啦！
2. 吸附法呀，这就好像磁铁吸住铁钉一样，让酶稳稳地待在那里。
想想活性炭吸附异味，不就是这样嘛！
3. 交联法呢，这不就是把酶像系鞋带一样给交联起来嘛。
好比用绳子把好多东西绑在一起，变得更牢固。
比如做手工的时候用线把一些小零件绑紧。
4. 共价结合法，哎呀，就像是两个好朋友紧紧拉着手不分开。
就像粘东西用强力胶一样，特别牢固，比如粘鞋子的时候。
5. 离子结合法，这不就有点类似电荷相互吸引嘛。
就如同带相反电荷的小球会吸到一起，像电池的正负极呀。
6. 微囊化法哟，就像给酶造了一个小小的家。
好比把珍贵的东西放在一个精致的小盒子里保护起来，比如放首饰的小盒子。
7. 薄膜法，这就如同给酶盖上了一层薄薄的被子。
就像手机贴膜一样，好好地保护着。
8. 亲和层析法，哇哦，这简直就是酶的专属“相亲会”呀。
就好像找对象一样，找到最合适的那个，比如配对钥匙和锁。
9. 自组装法，嘿，这不就是它们自己就很有默契地组合起来了嘛。
像拼图一样，自己就找到了合适的位置，比如玩拼图的时候。
我的观点结论就是：这些酶的固定方法都各有特点和用处，都很神奇很有趣呀，能让酶更好地为我们服务呢！。
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一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶1、固定化载体的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。
2、载体选择取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。
分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。
根据其酶活和得率进行筛选。
３、固定化条件的优化取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。
处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。
4、蛋白质含量测定采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。
5、酶活收率指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。
6、酶活测定以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。
在60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。
以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。
二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶1、固定化载体及其预处理选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。
其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
大孔吸附树脂: 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用; 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 2%-4% NaOH 浸泡4-8h 后用水洗至中性,再用 5%盐酸浸泡 4-8h,用水洗至 pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 5%盐酸浸泡 4-8h 后,用水洗至 pH=6,再用 2%~4%NaOH 浸泡 4~8h,用水洗至 pH 7-9,待用。
2、脂肪酶的固定化采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH 环境和反应时间等条件的优化试验。
称取一定量脂肪酶粉溶解于 100 mL 设定 pH 值的磷酸缓冲液中,并倒入 250 mL 具塞三角烧瓶中, 再加入设定量的载体,在 5 °C-8 °C 低温冷却液循环泵中,搅拌器搅拌反应 24h。
过滤,测定上清液的蛋白质含量。
抽滤分离固体和上清液,并用同种缓冲液清洗该固定化酶,自然风干,收集后保存待用。
三、D380树脂固定果糖基转移酶1、树脂的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸榴水交替处理，最后用蒸惰水冲洗至中性备用;离子交换树脂先用蒸馆水浸泡胀润、去杂，然后用 4% HCl 、4% NaOH 交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性，置于 4°C 冰箱保存备用。
2、游离果糖转移酶提取方法黑曲霉 AS0023细胞的制备见参考文献 [12J 。
称取一定量黑曲霉细胞放入烧杯中，加入适量的 0.05moI/ L ， pH5.0 的拧棱酸一磷酸缓冲液，在冰浴环境中用超声坡细胞破碎仪处理一定时间后，于 4°C 下冷冻离心( 10000 * g) 20min ，收集上清液在 4°C 条件下进行超滤以提高单位酶活，压力 0.15MPa ，截留相对分子质量 10000 ，粗酶提取液放入冰箱保藏备用。
3、果糖转移酶的固定化方法用滤纸吸干温树脂表面的水后称取 0.5g 于三角瓶中，加入一定量的酶液，在所需的 pH 下在恒温水浴振荡器中缓慢振荡吸附一定时间后，加入一定量的戊二醒进行交联。
交联完成后，弃去上清，用缓冲洛液冲洗戊二醒残留及未固定上的游离酶，所得固定化酶用缓冲液漫泡待用。
4、酶活测定方法游离果糖基转移酶活测定:一定体积底物浓度为 10% (w/v )0.05moI/ L 、 pH5.0 的拧穰酸-磷酸缓冲液于直径 50mm ， 100mL 的恒温夹套酶反应器中， 50°C下恒温搅拌反应 1 h ，于 1弗水中煮沸lO min 终止反应。
5、惰组分测定方法采用 HPLC( 高效液相色谱)法。
HPLC , Waters 209 系列，配有R401 示差折光检测器和M740 数据处理器;色谱柱: Hewlett Packard 公司 APS Hypersil 4.6 * 100mm 填料密度5μm; 流动相:乙睛/水 75/25 ，流速 1mLl min; 强度28 ℃;进样量 :10μL 。
6、酶活力定义每分钟产生 1μmol 在果三糖( 1-kestose )为一个酶活力单位。
酶用量为 2U/g 蔗糖。
固定化酶活测定方法同游离果糖基转移酶活的测定方法。
固定化酶活回收率:酶活回收率定义为固定化酶活与所添加的总酶活的比值。
四、Burkholderic cepecia 1003 产海因酶固定1、海因酶的制备将由本实验室的一株 Burkholderic c叩ecia 10.03 菌株发酵产酶经过细胞破碎、硫酸镣沉淀、疏水层析和离子交换层析等步骤后得到经初步纯化的海因酶酶液。
蛋白质量浓度为1. 2 mg/ mL ，于- 2.0°C下保存备用。
2、 Eupergit C 和 Eupergit C250L的氨基化分别称取 5 g Eupergit C 和 Eupergit C250L干树脂，于密闭容器内，45 °C下分别用 4.0 mL 2.5% 的NH3• H20 浸泡.48 h ，以去离子水反复淋洗至中性。
以 pH 6.5 , 0.1 mol/L 的磷酸缓冲平衡氨基化后的树脂，于4 °C下保存备用。
3、 EDC 溶液的配置称取0.785 g EDC( 碳化二亚胶 (N 一( dimethyl-aminopropyl) - N’- ethylcarbodiimide) ) ，加入 5 mL MnC1 2 水溶液 (1 mmol/L) 中，用 1%HCl 调节 pH 值至 5.0，定容至 12 mL 。
4、环氧基载体上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出2mL分别加人0.2 g 的环氧基载体 Eupergit C 和Eupergit C250L 湿树脂。
4°C 下水平轻微振荡后，用pH 8.5 , 0.1 mol/L 的 Tris - HCl 缓冲滤洗，4°C下至少保存48 h后方可使用。
5、氨基载体上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出 2 mL 分别加入0.2 g 的氨基载体 Eupergit C ( -NH2) 和Eupergit C250L( -NH2 )湿树脂，冰浴条件下手动振荡滴加 EDC 溶液， 4 °C下悬空振荡。
反应结束后，需用含0. 5 mol/L NaCl 的 pH 8.5 , 0.1 mol/L 的Tris - HCl 缓冲反复淋洗 3 次，最后用pH 8. 5 , 0.1 moVL 的 Tris - HCl 缓冲滤洗后 4°C保存。
五、黑曲霉果胶酯酶固定化1、游离酶活力的测定J 用 pH - stat 法(Z. 1. Kerte钮， 1937 )测定果胶醋酶的活力。
取100mL 质量分数为 0.5% 的柑桶果胶溶液于 40 °C下恒温，用O.lmol/L 的 NaOH 将 pH 调到 4 .4，加入lmL 酶液(稀释 10 倍) ，同时开始记时。
果胶醋酶催化果胶水解，使体系的 pH 不断下降，利用自动滴定仪不断滴人 O.lmol/L 的 NaOH ，使体系 pH 始终保持在4 .4。
每隔 lmin 记 1 次 NaOH 的消耗量，反应5min ，以加人的NaOH 的微摩尔数一反应时间作图，由所得直线的斜率计算果胶醋酶的活力。
1 个酶活单位 :40 °C下，每分钟生成的酸的微摩尔数，即PE 活力单位是μmol/min 。
2、固定化酶活力的测定J 用 pH - stat 法(Z. 1. Kertesz , 1937) 测定果胶醋酶的活力。
取100mL 质量分数为 0.5% 的柑情果胶溶液于 45 °C下恒温，用O.lmol/L 的 NaOH 将 pH 调到固定化果胶醋酶的最适 pH( 明胶固定化果胶醋酶为 4.0 、蛋壳固定化果胶醋酶为 4.2) ，加人一定量的固定化果胶醋酶(明胶固定化果胶醋酶为 8g 、蛋壳固定化果胶醋酶为 1g) ，同时开始记时，果胶醋酶催化果胶水解，使体系的 pH 不断下降，利用自动滴定仪不断滴人O.lmol/L 的 NaOH ，使体系 pH 始终保持在固定化果胶醋酶的最适 pH 。
每隔 lmin 记 1 次 NaOH 的消耗量，反应 5min ，以加人的 NaOH 的微摩尔数反应时间作图，由所得直线的斜率计算果胶醋酶的活力。
1个酶活单位: 45 °C下，每分钟生成的酸的微摩尔数，即 PE 活力单位是μmol/min。
3、固定化酶的制作方法蛋壳固定化酶的制作方法蛋壳的预处理取用水浸泡了一段时间的蛋壳，揭除内层薄膜，研成小片。
用去离子水彻底清洗后，用蒸馆水洗涤，再用丙酣溶液洗涤，所得蛋壳碎片于干燥箱内 60 °C干燥数小时，研成小颗粒，待用。
蛋壳的酸处理称取与预处理好的蛋壳于100mL 烧杯中，向其中缓慢加人 50mL pH = 1. 0 的拧攘酸，以缓解蛋壳的强碱性质，拧攘酸处理 24h ，最终pH =4 。
固定化酶的制备称取 1g 酸处理后干燥的蛋壳，加入 9mL 乙酸-乙酸铀 (pH = 4.5) 缓冲液，再加入稀释 10 倍的黑由霉果胶醋酶 lmL( 酶活力60U) ，在 4°C (冰水温合物中)搅拌 2-3 h，使其充分吸附在蛋壳上。
之后对其进行离心 (4 °C , 5000*g , 20min) ，得到的离心沉淀产物即为固定化果胶醋酶，用乙酸一乙酸铀 (pH4.5 )缓冲液洗涤数次，放在冰箱中 (4 °C)保存备用。