反转录PCR模板
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2）Oligo(dT)：是一种仅对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。
3）特异性引物：最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
做Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。
引物设计的要求：①Tm=55-65℃②GC=30-80%③PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。
④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。
PCR检测技术(一) 模板
3.DNA聚合酶
目前PCR扩增中最常用的DNA聚合酶是TagDNA聚合酶，它是由水生栖热菌(Ther-masaquaticus)产生，热稳定性好，可耐94℃高温，在此温度下短时光内对活力无多大影响。最适反应温度为72℃,70℃催化核酸链延伸的速度是2800核苷酸/min，在100uL反应体系中普通用2单位，它的用量多少对PCR扩增效率及特异性有一定影响。除了TagDNA聚合酶外，近年来耐热的pfuDNA聚合酶也被广泛地用于PCR反应，此酶是山极端嗜热的激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)产生的DNA聚合酶，是迄今发觉的掺人错误率最低的耐热DNA聚合酶，但其延长速度比TagDNA聚合酶低550核苷酸/min；另外得到应用的还有一种rTthDNA聚合酶，因为PCR反应以DNA模板举行扩增反应，而rTthDNA聚合酶可将反转录和聚合作用融合在一起，挺直由其将RICA反转录后扩增出大量的DNA片段，因而可大大简化操作程序，提高效率。
TagDNA聚合酶往往会在DNA链3'末端加上非模板互补核苷酸，从而产生不易克隆的PCR产物。通过用其他DNA聚合酶(如T4DNA聚合酶)处理扩增产物，补平或除去突出末端可解决这一问题。
4．反应缓冲液
PCR反应中常用的反应缓冲液含10～50mmol/L(pH8.3～8.8)的Tris-HCl,50mmol/LKCl和1.5mmol/LMgCl2。反应缓冲液的pH至关重要，假如KCl浓度过高，则会抑制酶的活性。在反应中存在适当浓度的Mg2+至关重要，它是TagDNA聚合酶活力所必须的，并可影响PCR产物的特异性和产量、引物退火的程度、模板与PCR产物链的解离温度、引物的特异性、引物二聚体的形成以及酶的活性和精确性等。因为EDTA或磷酸根能影响Mg2+的浓度，所以应注重模板DNA溶液中的EDTA浓度和PCR反应中所加模板和引物的量以及dNTP浓度(dNTP可提供磷酸基团，从而影响Mg2+浓度)。要获得最佳反应结果，必需挑选合适的Mg2+浓度，普通为2～5mmol/L。
反转录pcr名词解释
反转录pcr名词解释
反转录PCR是一种分子生物学技术，也被称为RT-PCR。
它结合了两种技术，聚合酶链式反应（PCR）和反转录（RT）。
这项技术主要用于从RNA模板合成DNA，然后利用PCR技术扩增DNA。
首先，反转录酶（RT酶）将RNA模板转录成互补的DNA链，这个过程称为反转录。
接着，PCR技术被用来扩增这些DNA片段，使其数量呈指数增长。
这使得科学家们能够从极少量的RNA样本中获得足够的DNA，以便进行后续的分子分析，比如基因表达分析或病毒检测。
反转录PCR在许多领域都有重要的应用，特别是在病毒学和基因表达研究中。
例如，它被用于检测病毒感染，如HIV、流感病毒等。
此外，它也被用于研究基因表达在不同条件下的变化，以及在研究中广泛用于克隆和定量分析特定的RNA。
这项技术的发展对于我们理解疾病的发病机制以及基因表达调控等方面具有重要意义。
反转录说明书
整引物浓度。
*2 ROX Reference Dye II（50×）比 ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用 7500 Real-Time
PCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye II（50×）。
*2：制作标准曲线时梯度稀释 cDNA 或 RNA 标准品的稀释液。模板 DNA 或 RNA 如果用水或 TE
Buffer 稀释时，由于受 Microtube 吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验
结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围
内获得准确定量的标准曲线。本制品不影响反转录和 PCR 反应，用其稀释后的样品可直接使
1×
*
RNase Free dH2O
up to 10 μl
* 反应体系可按需求相应放大，10 μl 反应体系可最大使用 500 ng 的 Total RNA。
2. 轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下: 37℃ 15 min（反转录反应） 85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应） 4℃ 注意：得到的 RT 反应液加入到下一步的 Real Time PCR 反应体系中，其加入量不要超过 Real Time PCR 反应体积的 1/10（V/V）量。
-1-
● 使用注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。 1． 5×PrimeScript RT Master Mix 在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于 5×PrimeScript RT
Master Mix 粘度高，用移液枪慢慢反复吸打充分混匀后使用。 2． 分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。 3． 本制品中已经加入了反转录 Primer（Oligo dT Primer 和 Random 6 mers），如果要使用 Gene Specific
反转录pcr操作步骤
反转录pcr操作步骤嘿，朋友们！今天咱就来讲讲反转录 PCR 操作步骤。
这可是个很厉害的技术呢！首先呢，你得把要研究的 RNA 样本准备好。
这就好比要烹饪一道美味佳肴，食材可得精挑细选呀！然后把 RNA 模板、反转录酶、引物、dNTP 等这些家伙都按比例放在一起。
这就像是把各种调料恰到好处地混合在一起，才能做出完美的味道。
接下来，把它们放在一个合适的温度下，让反转录酶这个小能手开始工作啦！它就像一个勤劳的小蜜蜂，努力地把RNA 反转录成cDNA。
你想想，这是不是很神奇呀！等反转录完成后，就要进入PCR 阶段啦。
把cDNA、DNA 聚合酶、引物、dNTP 等再次聚在一起，然后设置好温度循环。
这就像一场热闹的舞会，各种分子在不同的温度下欢快地跳动。
在 PCR 过程中，温度的变化可重要啦！就像跳舞的节奏，一会儿高一会儿低。
高温让 DNA 变性，就像把扭在一起的绳子解开；低温让引物结合，就像找到了合适的伙伴牵手；适中的温度让 DNA 聚合酶发挥作用，把新的核苷酸连接上去，就像盖房子一样，一砖一瓦地搭建起来。
每一轮循环结束后，cDNA 的数量就会翻倍呢！就像滚雪球一样，越来越多。
最后呀，等 PCR 反应结束，就可以检测产物啦。
看看我们努力的成果是不是符合预期。
哎呀，反转录 PCR 是不是很有趣呀！它能帮助我们了解那些看不见摸不着的基因信息呢！虽然过程有点复杂，但只要我们认真对待，就一定能掌握好这个技术。
就像学骑自行车一样，一开始可能会摇摇晃晃，但多练习几次就会稳稳当当啦！大家加油哦，相信你们一定能在反转录 PCR 的世界里畅游无阻！。
RT-PCR百度百科
概念RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-P CR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。
）RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。
为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative P CR)。
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内D NA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”[编辑本段]PCR技术相关试剂A液：变性液B液：醋酸钠溶液C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1）D液：异丙醇E液：75％乙醇F液：DEPC处理的灭菌去离子水G液：RNA酶抑制剂H液：反转录反应液I液：反转录酶J液：PCR反应液K液：Taq DNA聚合酶(0.5u／µl)L液：矿物油M液：50倍TAE电泳缓冲液N液：溴化乙锭溶液0液：上样缓冲液[编辑本段]PCR各步骤的目的（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
RNA提取-反转录-半定量PCR
RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA,作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a） TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。
RNA存在于水样层中。
收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75%乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：Phase lock Gel TM Henny 配合Trizol A+提总RNA 操作）实验流程图细胞细胞选择冷贴壁细胞斗悬浮细胞pHS.71.匀浆处理（*打开离心机，降温）a） -80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。
用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10% （注：先加7003 Trizol A+,再加3003，防止外溢；一般匀浆1.5~2min,可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3. 将Phase lock Gel TM（PLG）置于离心机中，15000Xg 离心30s离心到底部，不让贴壁4.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。
一步法或两步法反转录cDNA文库的PCR实验原理和流程,gi
一步法或两步法反转录cDNA文库的PCR实验原理和流程,gi逆转录PCR逆转录是指以RNA为模板合成与其互补的cDNA的过程。
逆转录PCR是将RNA的逆转录(reverse transcription) 和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术，故逆转录称为RT-PCR或反转录PCR。
逆转录PCR实验原理是，提取组织或细胞中的总RNA，以RNA为模板，利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA链为模板进行PCR扩增，从而获得大量拷贝。
逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
逆转录PCR应用逆转录PCR的用途广泛，可用于分析基因的转录产物、检测细胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探针、直接克隆特定基因的cDNA序列等。
如在临床上RT-PCR可以用于遗传病诊断、癌症检测、检测病人标本中的RNA病毒，如HAV、HCR、HIV等。
在植物方面RT-PCR常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。
使用RT-PCR检测分析RNA 转录产物具有以下突出的优点：理论上可以检测几乎任何基因的转录产物；可以实现极为微量RNA样品（ng级别）的检测；样品耐受性好，未经纯化的粗制生物样品也可以用于检测；模板逆转录PCR的模板是RNA，可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，都需确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
RNA提取可以利用试剂盒从细胞（或组织）中提取得到RNA。
模板RNA的纯度和完整性对于扩增的结果有很大影响，从细胞中分离RNA应注意尽量减少RNA酶的污染（RNA酶分布广泛，除细胞内源性RNA酶外环境中也存在大量RNA酶），在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境：避免RNA酶污染包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂抑制内源性RNA酶。
反转录PCR原理步骤小结
反转录PCR原理步骤小结反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）是一种将RNA转录成DNA并进行扩增的技术。
它可以用于检测和量化RNA，以及研究基因表达和调控等生物学过程。
下面是RT-PCR的原理和步骤的详细介绍。
一、反转录（Reverse Transcription）反转录是将RNA模板转录成相应的DNA。
在RT-PCR中，一个逆转录酶（Reverse Transcriptase）会被加入到已经提取出的RNA样本中，与RNA模板反应，合成相应的cDNA。
逆转录酶主要包括逆转录病毒逆转录酶（如Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase，M-MLV RT）和热稳定的逆转录酶（如Thermus thermophilus Reverse Transcriptase，Tth RT）等。
反转录步骤：1. 准备反应体系：将RNA样本、逆转录酶和逆转录引物（一般为Oligo(dT)或随机引物）混合。
2.反转录反应：将反应体系加热至逆转录酶适宜的工作温度（一般在37-55°C），进行反应。
反转录反应时间和温度取决于所用的逆转录酶和引物。
二、热变性（Denaturation）热变性步骤是将反转录反应产生的cDNA与RNA酶降解，以保证后续PCR扩增的特异性。
加热会使cDNA和RNA解开双链结构，而RNA酶被失活。
热变性步骤：1.准备反应体系：将热变性缓冲液和反转录反应产物混合。
2.热变性反应：将反应体系加热至95°C，保持一段时间（一般为2-5分钟）。
三、PCR扩增（Polymerase Chain Reaction）PCR扩增是将cDNA模板通过DNA聚合酶（DNA Polymerase）进行连续的循环扩增，以产生大量的DNA。
PCR包含三个关键步骤：变性、退火和扩增。
RT-PCR方法
半定量RT-PCR 方法一反转录—第一链cDNA 的合成参照Promega RT-PCR试剂盒说明书进行。
取2 μg植物total RNA，与Oligo （dT）引物以0.5 ug primer/ug total RNA 的比例混合，体积不超过11 μL，70℃ 5 min，冰上冷却。
加入各种反转录试剂混合：10× reverse transcript buffer 2.5 μL；RNase Inhibitor 0.5 μL；dNTP Mixture 2.0 μL；Reverse Transcriptase 1.0 μL；RNase free Water 补足25 μL；混匀后，42℃ 1 h；75℃10 min。
PCR 合成第二链取第一链产物0.5 μL为模板，按常规PCR程序进行PCR扩增。
以拟南芥Actin7基因为反应的内标对照。
方法二反转录-聚合酶链反应（RT-PCR扩cDNA）第一步：1.0 μg拟南芥总RNA和1.0 μL oligo(dT) 引物，用水稀释到总体积5.0 μL的体系，70℃加热5 min后，迅速置冰上。
第二步：在反转录作用下由随机引物引导反转录成cDNA第一条链。
反应体系如下：表1 RT-PCR反应体系Table 1 The reaction system of RT-PCRMgCl2（25mM）5×Rxn BufferdNTP Mixture（25mM）rRNasin Ribonuclease inhibitor Reverse Transcriptase总RNA 2.0 μL 4.0 μL 1.0 μL0.5 μL1.0 μL 1.0 μgRNAtal 25.0 μL反转录反应先在25℃下进行5 min，然后在42 ℃条件下进行50 min。
转录反应物在70℃加热15 min后置于冰上，取反转录反应物的0.5 μL为模板，用如下的特异引物进行PCR反应。
rt q pcr过程当中要进行五模板对照
rt q pcr过程当中要进行五模板对照
1. 逆转录酶
目前市场上有两种不同的逆转录酶，一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV) ，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNA酶H 活性，它最适温度是42 ℃，最适pH 8.3。
但是高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。
另一种来源于鼠白血病病毒(Mo-MLV) 的逆转录酶，是单肽链的，有RNA 聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性，最适温度37 ℃，最适pH 7.6，较弱的RNA酶H活性，可扩增2-3 kb的cDNA。
2. 单价阳离子
离子条件基本上影响各种模板的转录效率。
K +的转录产物⽐Na +较长。
对于cDNA 长度的最适K+浓度为140-150 mM 。
3. 二价阳离子
对于反转录酶活性来说，二价阳离子也是必需的。
产生全长cDNA 产物的最适浓度是6-10 mM。
4.dNTP
四种脱氧核苷三磷酸(dNTP) 的浓度，对于有效合成cDNA是至关重要的。
如果其中只有一种的浓度⽐于10-50 µM，cDNA的产量将明显下降。
常用的dNTP的浓度为200-500 µM 。
5. 引物的选择
逆转录引物一般包含三种：oligo dT，Random Primer Mix和特异性引物。
客户可以根据个人需求进行选择。
反转录PCR操作方法
RT-PCR反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。
其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo (dt)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
实验中各步所需的药品如下：1. RNA提取：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水2. cDNA第一链的合成: DEPC 水、引物、10×PCR buffer、 MgCl2、dNTP mix、 0.1M DTT(硫苏糖醇) 、SuperscriptⅡ、 RNase H 13. PCR 扩增：第一链cDNA 、上游引物、下游引物、 dNTP Mix、10×PCR buffer、 Tag 酶、琼脂糖凝胶电泳（TAE试剂、琼脂糖、溴酚蓝或二甲苯、）主要过程：(一)反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mg2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
（二）合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
反转录的步骤及原理
反转录的步骤及原理反转录（Reverse Transcription）是一种在实验室中将RNA转录成DNA的过程。
下面是反转录的步骤及原理：步骤：1. RNA模板合成：将RNA样本与逆转录酶（reverse transcriptase）和适当的引物（primer）混合，反应体系提供了逆转录所需的核苷酸（dNTPs）和缓冲液。
2. 反转录：逆转录酶使用RNA模板和引物进行DNA链合成，合成的DNA链与RNA模板互补。
3. RNA降解：通过加入RNase H，将RNA降解，只保留DNA。
4. 第二链合成：加入DNA合成酶、适当的引物和dNTPs，进行反应，合成第二条DNA链。
5. 酶处理：加入核酸酶，处理并去除引物。
6. PCR扩增：使用合成的DNA作为模板进行PCR扩增，以获得足够多的目标DNA。
原理：反转录的原理是利用逆转录酶，它是一种RNA依赖性DNA聚合酶。
逆转录酶能够将RNA转录成互补的DNA链。
具体过程如下：1. 引物结合：在反转录过程中，引物（primer）与RNA模板特异性结合。
引物一般是寡聚核苷酸，能与RNA模板的互补序列结合。
引物结合的位置决定了反转录开始位置。
2. 反转录酶合成DNA：逆转录酶使用引物作为起始点，从引物的3'端向5'端合成互补的DNA链。
逆转录酶的活性包括RNA依赖性DNA聚合酶活性和RNA酶H活性。
RNA依赖性DNA聚合酶能够在RNA模板上合成互补链，而RNA酶H能够降解RNA，消除RNA模板的影响。
3. RNA降解：通过加入RNase H，还原转录过程中RNA模板的降解。
RNase H是一种特异性地降解RNA-DNA杂交链的酶。
4. 第二链合成：在RNA降解后，可以通过加入DNA合成酶、适当的引物和dNTPs合成第二条DNA链。
这个过程类似于常规的PCR扩增的第二链合成。
5. 酶处理：通过加入核酸酶，可以处理并去除引物。
核酸酶能够识别并消除在引物结合位点之外的序列。
反转录及荧光定量步骤
反转录及荧光定量步骤反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和测量特定的RNA分子在生物样品中的相对表达水平。
RT-PCR的步骤主要包括反转录（RT）和荧光定量（PCR）两个主要阶段。
一、反转录步骤反转录是将目标RNA转录为相应的DNA模板的过程。
该步骤通常用于鉴定和定量RNA分子的相对表达水平。
1. RNA提取和纯化：首先需要提取细胞或组织中的总RNA。
目前常用的方法是使用TRIzol试剂将RNA从样品中提取出来，并使用纯化试剂将RNA从其他杂质中纯化出来。
2. 反转录酶的选择：选择适合反转录的酶，如逆转录酶（Reverse Transcriptase）。
逆转录酶是一种能够在RNA模板上合成DNA的酶，如M-MLV逆转录酶和Superscript III逆转录酶。
酶的选择应基于实验的需求和特定的RNA样本。
3. 反转录反应体系：反转录反应需要适当的缓冲液、酶、反转录引物（primers）和RNA模板。
引物是一种寡聚核苷酸序列，它们在反转录反应中提供一个起始点供DNA合成酶进行延伸。
引物的设计应基于目标RNA的序列和实验设计。
4.反转录反应条件：反转录反应一般需要在适当的温度和时间下进行。
常见的反应条件包括：37-42°C的温度，60分钟至120分钟的反应时间，以及常规的反应缓冲液。
5.反转录反应停止：反转录反应通常通过加热或其他方法停止。
加热反应体系可以选择不同温度和时间进行优化。
荧光定量PCR是一种用于定量测量PCR产物数量的方法。
它利用荧光标记的引物和探针来监测PCR反应过程中的DNA合成。
1.PCR体系的组装：PCR体系包括适当的缓冲液、DNA模板、引物、酶和荧光探针。
引物是用于引导DNA合成的寡聚核苷酸序列，探针是一种含有一个荧光标记和一个荧光猝灭剂的寡聚核苷酸序列。
2.PCR反应条件：荧光定量PCR反应需要在适当的温度和时间下进行。
一般反应条件包括：95°C的初始变性步骤，95°C变性反应30秒，50-68°C的退火温度/延伸温度，延伸时间根据引物的大小而定。
反转录RT-PCR的内参如何选择？
反转录RT—PCR的内参如何选择？RT—PCR就是将RNA先反转录为cDNA，再将转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应扩增目标片段。
用于反转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异引物的一种。
对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA三种都可。
1）随机引物：适用于长的具有发卡结构的RNA。
适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的转录反应。
主要用于单一模板的RT-PCR反应。
2）Oligo dT:适用于具有PolyA尾巴的RNA.（原核生物的RNA、真核生物的Oligo dT rRNA 和tRNA不具有PolyA尾巴。
）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少.oligo(dT) capture多聚胸腺嘧啶-核苷酸捕捉实际上指的是用Oligo（dT）特异结合到mRNA上PolyA尾端的技术，以此技术可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来，通常用于mRNA的反转录3) 基因特异引物：与模板序列互补,适用于目的序列已知的情况.实时PCR也就是qPCR，它的基本原理与PCR也是一样的，只是在体系中加入荧光指示，可以对PCR的模板进行定量。
一种是加入荧光染料SYBR Green，SYBR Green会嵌入双链DNA的小沟,且只有在嵌入小沟时才会发出荧光，荧光定量PCR没进行一个循环就会对产物进行一次检测，通过检测每个循环后荧光强度(间接得知DNA的量）从而检测整个PCR的过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
SYBR Green不具有特异性，对结果稍有影响。
另一种是加入荧光探针T aq man，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，T aqman探针在PCR体系中会与目标片段杂交，而在PCR的Extension阶段Taq酶以一条链为模板合成目标片段，此时T aq酶的5'－3’外切酶活性将结合在模板上的探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
PCR反应体系包括哪些成分组成
PCR反应体系包括哪些成分组成引言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种重要的分子生物学技术，可用于放大DNA序列片段。
PCR在生物医学研究、遗传学分析、病毒检测、法医学等领域具有广泛的应用。
了解PCR反应体系的成分组成对于正确使用和优化PCR实验至关重要。
PCR反应体系成分组成PCR反应体系由若干关键成分组成，包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs （脱氧核苷酸三磷酸盐）、缓冲液以及水。
下面将逐个介绍这些组成成分。
DNA模板DNA模板是PCR反应的起始物质，它含有待扩增的目标DNA序列。
DNA模板可以是基因组DNA、cDNA（反转录合成的DNA）或已知DNA序列等。
PCR反应通过保温循环中的高温和低温步骤来模拟DNA复制过程，从而使DNA模板得以扩增。
引物引物是PCR反应中的两个短链DNA分子，它们与目标DNA序列的两端互补结合。
引物提供了扩增反应的起始位点，使聚合酶能够在该位点上开始合成DNA链。
引物的选择非常关键，它们的长度、碱基组成和互补性需要经过仔细设计和优化。
DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应中的关键酶，它能够在合适的反应条件下，以DNA模板为引导，在引物的作用下合成新的DNA链。
常用的DNA聚合酶包括热稳定聚合酶（如Taq聚合酶）和高保真度聚合酶（如Pfu聚合酶）。
这些聚合酶具有耐高温的特性，从而使PCR反应的扩增步骤在高温条件下进行。
dNTPsdNTPs是PCR反应中DNA合成的原料，它们是脱氧核苷酸的三磷酸盐。
dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP，它们在PCR反应中与DNA聚合酶一起合成新的DNA 链。
dNTPs在PCR过程中为新合成的DNA提供了所需的碱基。
缓冲液缓冲液是PCR反应中的重要成分，它用于调节PCR反应体系的pH值，维持酶的活性，提供适宜的离子环境和缓冲性能。
常用的PCR缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、KCl缓冲液等。
RT-PCR
通用RT-PCR试剂盒本试剂盒适用于以RNA为模板合成第一链cDNA的反转录，以及后续的PCR扩增实验。
本试剂盒选用优异的M-MLV RT酶，可以合成大于5kb的第一链cDNA；反转录过程中的特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。
反转录反应1、每次RT反应中，按下表加入各组分：RNA模板0.5-2μgOligo(dT)15 1μlRNase-free H2O 补齐至10 μl2、70℃放置5分钟，然后迅速置于冰上5分钟。
3、顺次加入如下组分：M-MLV 5×Buffer 4μldNTPs(10mM) 1μlRNase Inhibitor 0.5μlM-MLV RT 1μlRNase-free H2O 3.5μl4、37℃反应1小时。
5、75℃孵育15分钟终止反应，保存于-20℃或直接用于下游实验。
RNase Inhibitor(Ribonuclease Inhibitor) 即RNases抑制剂，是一种大肠杆菌表达的重组蛋白，可以通过非竞争性方式按1:1比例和RNase A、RNase B或RNase C结合，并抑制这三种酶的活性，保护RNA不被这三种酶降解。
但本RNase Inhibitor不能抑制RNase I、T1、T2、H、U1、U2和CL3的酶活性。
Oligo(dT) 生化术语，是指多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链。
因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。
因绝大多数真核细胞mRNA 3’端具有Poly(A)尾，Oligo(dT)与其配对，仅mRNA可被反转录。
PCR反应1、取上述产物1μl作为50μl PCR反应体系模板；若待测基因丰度高，可适当稀释模板。
10×Taq Buffer 5μlDNA模板1μldNTPs(10mM) 1μlPrimer ⅠPrimer ⅡTaq酶1μlH2O 补齐至50μl2、PCR程序：95℃3分钟95℃30秒退火温度45秒72℃根据所扩增片段大小调整（1kb/分钟）(以上三步循环30次)72℃ 10分钟3、所得产物可直接用于下游分子生物学实验或冻存于-20℃保存。
反转录引物的选择与Real-TimePCR引物设计的要求
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2）Oligo(dT)：是一种仅对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。
3）特异性引物：最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
做 Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。
引物设计的要求：① Tm=55-65℃② GC=30-80%③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。
④ 引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。
反转录PCR实验报告
反转录PCR实验报告引言反转录PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于检测RNA分子的存在和表达水平。
本实验旨在通过反转录PCR技术分析特定基因的mRNA表达情况，并验证RNA样本的质量。
实验材料和方法材料•高纯度聚合酶（Reverse Transcriptase）•反转录PCR引物（Primers）•dNTPs（四个脱氧核苷酸）•RNA模板样本•RNase-free水•Buffer方法1.提取RNA样本并进行浓度、纯度检测。
2.根据反转录PCR引物序列设计相应的引物。
3.准备反转录PCR反应体系，包括RNA样本、反转录酶、反转录引物、反转录缓冲液和dNTPs等组分。
4.在适当的温度和时间下进行反应，首先将RNA与反转录酶和反转录缓冲液混合，然后在37°C下进行反转录反应。
5.停止反转录反应，并进行热变性以使RNA降解，得到cDNA（差异转录DNA）模板。
6.准备PCR反应体系，包括cDNA模板、DNA聚合酶、PCR引物和dNTPs等组分。
7.设置合适的PCR程序，包括初始变性、循环反应等步骤。
8.进行PCR反应，最后通过电泳检测PCR产物。
结果和讨论本实验中，我们成功利用反转录PCR技术合成了RNA样本的cDNA，并通过PCR 扩增得到了目标基因的产物。
利用电泳检测，我们确认了PCR产物的特异性，同时观察到不同样本之间的mRNA表达差异。
根据实验结果，我们可以得出以下几点结论： 1. 实验结果表明RNA样本提取和纯化工作顺利进行，并且得到的cDNA质量良好。
2. PCR引物的设计符合预期，实现了特异性扩增。
3. 不同样本的PCR产物在电泳图上呈现出不同的带型，说明了目标基因在不同样本中的mRNA表达水平存在差异。
这可能与生物学的差异、处理条件的差异等因素有关。
4. 需要进一步验证和深入分析得到的PCR产物的序列和特性，以进一步了解目标基因的表达与功能。
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实验操作步骤：
1）RNA提取：
关键 防止RNA降解
RNA 提取的成功与否 是RT-PCR 检测中最 重要的步骤。
2)逆转录： RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物（随机引物，Oligo dT; 特异引物)
5'
mRNA
cDNA
AAAAAAAA3' TTTTTTTT
思考题
? 结合实验结果，试论应用RT-PCR研究外源 基因转录表达的优缺点。
?RT-PCR—一步法和两步法
两步法：由于单管反应时 RT和PCR都不能在最 佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用 基因特异引物扩增较短的基因，及定量 PCR。两 步法则是将 RT和PCR分别进行，这样使得两个 反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨， 适合那些 GC含量、二级结构严重的模板或者是 未知模板，以及多个基因的 RT-PCR。
Transcripción reversa
GSP1 (sense) 1ra cadena cDNA
AAAAAAAAAA- 3' TTTTTTTTTT- 5'
GSP (antisense)
GSP1
PCR usando GSP+GSP1
GSP Requiere el conocimiento de la secuencia para dise?ar GSP and GSP1
【结果与分析】
? 利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录； ? 观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的
电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。
RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因产物的电泳结果
实验中应注意的问题
? RNA提取过程中防止降解 ? 去除DNA的污染 ? 实验中注意设置阴性对照 ? 在冰上操作
A）在0.2mL微量离心管中，加入如下各成分
总RNA
2μL（1-5μg）
10×PCR buffer
1μL
dNTPmix（各2.5mM）
2μL
逆转录酶（200u/μL）
0.5μL
Oligo（dT） 或randorm 9 mers
2μL
ddH2O
至10μL
混匀后稍离心，42℃孵育30min，99℃ 5min然后4 ℃保温5min，终止反应后置冰
mRNA
cDNA
PCR 产物
?RT-PCR—一步法和两步法
?一步法： 利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、 引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA 反转录与PCR 扩增。利用反转录酶和 Taq酶作用在同一体系中直接以 mRNA 为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使 mRNA 的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限 度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测 出总RNA中小于1ng 的低丰度mRNA 。与Taq 酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基 因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。
2、Northern blot (RNA)
3、real-time PCR ( RNA ）
反转录 PCR(RT-PCR)
Oligo dT, 逆转录酶 特异性引物, Taq酶
mRNA cDNA PCR
用途: 获得所需cDNA片段；检测基因表达
注意问题：
1、PCR效率差异，重复性 2、内参选定 3、共同扩增 4、扩增片段位置 5、mRNA丰度
转基因植物表达的 RT-PCR 检测
实验原理
RNA 的多聚酶反应（ RT-PCR）是以mRNA 为 模板进行逆转录反应（ reverse transcription ， RT）与 PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中 少于10个拷贝的RNA 模板。
RNA 扩增包括两个步骤： ?在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成 RNA的互补cDNA ，加热后cDNA 与RNA 链解离， 然后与另一引物退火，并由 DNA 聚合酶催化引物 延伸生成双链靶 DNA ， 最后扩增靶 DNA.
0.5μL
dd water
补足至 20μL
（C）根据具体的条件设置PCR仪的循环程序：
（D）PCR结束后，取10μL产物进行琼脂糖凝胶电泳。
RT-PCR全过程
mRNA (sense)
AAAAAAAAAA- 3' Primer Antisense: TTTTTTTTTT- 5' oligo(dT)o
? 仪器
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微 量管，双面离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电 泳系统，水漂，恒温水浴。
? 试剂
RNA 反转录酶，3U/μL Taq DNA 聚合酶，PCR缓冲液 （10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模
外源基因的转录表达
基因表达
? 基因表达指基因组中某基因在细胞中 转录为mRNA 和翻译成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
? 基因表达的改变预示着细胞在分子水平 上的变化。它往往是细胞形态功能变化之 前的变化。
目前研究转基因植物外源基因 转录表达的常用方法
1、RT-PCR (RNA)
上。
3) PCR 特异性引物、模板、Taq 聚合酶。
（B）在0.2mL PCR 微量离心管中配制20μL反应体系
10×PCR buffer（含MgCl2） 3μL
2.5mmol/L dNTP
2μLBiblioteka 10μmol/L Primer1
1μL
10μmol/L primer2
1μL
模板CDNA
5μL
3U/μL Taq酶