药化实验

实验一槐米中芦丁的提取、精制及含量测定

一、实验目的

1.掌握水提取法提取黄酮苷的原理及方法。

2.掌握芦丁的精制方法

3.掌握分光光度法测定芦丁含量的方法

二、实验原理

芦丁可溶解于热水，利用不同温度条件下，物质的溶解度不同的特性，通过降低温度使芦丁的浓度达到饱和状态而结晶析出。

三、实验用品

仪器：粉碎机、样品筛、电炉、石棉网、布氏漏斗、滤纸、脱脂棉、真空泵、抽滤瓶、天平、圆底烧瓶、冷凝回流管、层析缸、毛细点样管、电吹风、显色喷瓶、分光光度计。

材料：槐花米。

试剂：蒸馏水、硫酸、乙醇、色谱纯甲醇、甲酸、芦丁对照品等。

四、实验方法

1.芦丁的提取

取槐米20 g，加沸水250 ml，煮沸提取30min，纱布或脱脂棉趁热过滤，残渣同法再操作一次，合并两次滤液。将滤液适当浓缩（原体积一半）后室温放置析晶，待全部析出后，减压抽滤，用冷蒸馏水洗涤芦丁结晶，抽干，得粗制芦丁（若抽滤堵滤纸可采用离心的方法：离心12000rpm，10min），置空气中干燥后，称重。芦丁得率（％）＝粗制芦丁（g）÷粗粉重量（g）×100％。

2. 芦丁的精制纯化

取粗制芦丁，按照1:60加入蒸馏水，煮沸15min，趁热抽滤，滤液冷却静置后即可析出晶体，抽滤，得芦丁精制品，置空气中干燥后，称重。

3.芦丁的水解（槲皮素的制备）

取精制芦丁适量，研细后置于250 ml圆底烧瓶中，按照1:70的量加入2％硫酸，加热回流40~60min，生成鲜黄色沉淀，放冷沉淀，抽滤，沉淀物为芦丁的苷元即槲皮素，用蒸馏水洗至中性，抽干水分，晾干，称重即为粗制槲皮素。粗制槲皮素再用95％乙醇回流溶解，趁热过滤，加蒸馏水至乙醇浓度为50%，重结晶得精制的含2分子结晶水的槲皮素。

4.芦丁和槲皮素的薄层层析

4.1点样：在距离薄层板下边缘2cm处用毛细管点样，原点直径不应超过2～3mm，原点之间距离约为1～2cm。本实验点1、2、3、4四个样点（1为精制的芦丁，2为芦丁标准品，3为粗制槲皮素，4为精制槲皮素）。

4.2展开：点样后选择合适的展开剂在层析缸内展开。展开剂的选择，可以参考文献中和自己研究的样品类似物质的分离，也可以在薄层板上每隔2～3cm距离点上样品溶液，待斑点上的溶剂挥发后，向各斑点上分别滴加不同的展开剂展开如图比较，A～D四种溶剂，溶剂B比较适当。单一的溶剂分离效果不佳时，可以调制混合溶剂进行实验。溶剂前沿接近薄层板上端时，取出薄层板停止展开。本实验中展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水（8:1:1）展开，展距12cm。

4.3显色：取出的薄层板记录溶剂前沿位置，挥发干展开剂后，用显色剂进行显色。在薄层板上喷雾10％～20％硫酸后，于100℃以上加热，就可以出现灰褐色斑点，或者在碘蒸气中薰，则出现褐色斑点。这两种显色方法几乎适用于全部有机化合物。本实验用碘蒸气显色后观察样品斑点的位置，并计算Rf值。

4.4计算Rf：原点至溶剂前沿距离为a，样品斑点中心至原点距离为b，则Rf＝b/a 。一般鉴定纯化合物时，Rf值最好在0.4～0.6之间。被分离物质在展开剂中的Rf值之差最好大于0.05 。

5.槐米中芦丁含量测定

5.1色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱（25cm×4.6mm×5μm），以甲醇-1%冰醋酸水溶液（32：68）为流动相；流速为1.00ml/min；进样量为20μl；柱温为25℃；检测波长257nm。

5.2 标准曲线的制作

精确称取120℃真空干燥恒重的芦丁对照品7.9mg（或适量），用甲醇定容于50ml容量瓶中，摇匀，得对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液0.50、1.00、2.00ml于10ml容量瓶中用甲醇定容，然后在上述色谱条件下进样，测定峰面积，以芦丁对照品浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标，进行线性回归绘制标准曲线。

5.3 槐米中芦丁含量的测定

精密称取槐米干燥粉末0.1g置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml,称重，超声提取30min（功率250W，频率25kHz），冷却后称重，甲醇补足失重，摇匀过滤。精密量取续滤液

2ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。取适量样品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后作为供试样品液，进样20μl供试样品液进行色谱分析，计算峰面积，代入回归方程计算样品中芦丁的含量。

5.4 精制芦丁纯度的测定

精密称取精制芦丁0.1g置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml,称重，超声提取30min （功率250W，频率25kHz），冷却后称重，甲醇补足失重，摇匀过滤。精密量取续滤液2ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。取适量样品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后作为供试样品液，进样20μl供试样品液进行色谱分析，计算峰面积，代入回归方程计算样品中芦丁的含量，并计算精制芦丁样品中芦丁的纯度。

六、作业

1.计算热水提取芦丁的得率？

2.计算从粗制芦丁到纯化后芦丁的得率。

3.计算由芦丁水解产生粗制槲皮素的得率，乙醇结晶纯化后精制槲皮素的得率。

4.记录芦丁和槲皮素薄层色谱行为并计算Rf值。

5. 线性回归，绘制芦丁标准曲线通过标准曲线计算槐米中芦丁的含量和精制芦丁样品中的芦丁的纯度。

实验二 HPLC法测定甘草中甘草苷的含量

一、实验目的

1. 了解HPLC原理

2. 掌握HPLC测定甘草苷含量的方法

二、实验用品

仪器：岛津LC－20A高效液相色谱仪、岛津PDA检测器、色谱工作站、赛多利斯万分之一天平。

材料：甘草饮片。

试剂：甲醇、冰醋酸、色谱纯乙腈、超纯水、甘草苷对照品等

三、实验方法

1.色谱条件

色谱柱：C18（25cm×4.6mm×5μm），流动相乙腈-0.5%冰醋酸(1 ∶ 4) ，流速0. 8 mL/min，检测波长276 nm，柱温室温，进样体积10 μL。

2.标准曲线的制作

精密量取甘草苷对照品2mg于10ml容量瓶，甲醇溶解配制200μg/ml对照品储备液，然后倍比稀释为50、20、10、5、1μg/ml（分别取200μg/ml对照品储备液2.5、1，0.5，0.25，0.05ml，20％乙腈定容至10ml），然后将200、50、20、10、5、1μg/ml对照品溶液分别进样10 μL。按色谱条件测定甘草苷峰面积。以对照品量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

3.甘草供试样品的制备及其甘草苷含量的测定

精密称取甘草样品粉末0.4g于100ml锥形瓶中，精密加入70％乙醇20ml，精密称定后，置于超声波清洗仪中提取30min，取出冷却至室温，称重，补足失去的溶剂量过滤后精密量取滤液0.5ml于10ml容量瓶中，用20％乙腈稀释至刻度，摇匀，即得供试样品溶液C。

精密称取甘草样品粉末0.4g于150ml圆底烧瓶中，精密加入70％乙醇20ml，精密称重后置于水浴回流提取30min，取出冷却至室温，称重，补足失去的溶剂量，抽滤。精密量取滤液0.5ml于10ml容量瓶中，用20%乙腈稀释至刻度，摇匀，即得供试样品溶液H。

取适量不同方法制备的供试样品溶液（C和H），用0.45μm微孔滤膜过滤后取10μl进行