第八章酵母基因工程详解
第八章基因工程诞生与发展
有关基因工程技术发明获得 Nobel奖
第八章基因工程诞生与发展
基因工程概念
在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的 DNA片段，在体外切割，拼接形成重组DNA，然后将 重组DNA与载体的遗传物质重新组合，
第八章基因工程பைடு நூலகம்生与发展
我是一个实验主义者，我能告诉你的检验 它是否有效的唯一方法就是尝试它。
——保罗·伯格
第八章基因工程诞生与发展
保罗·伯格 Paul Berg
• 保罗·伯格1926年生于美国。 在参加了第二次世界大战 后回到宾夕法尼亚州立大 学学习，1948年获生物化 学学士学位，
• 后在凯斯西部保留地大学 获生化博士学位，1959年 到斯坦福大学任教。
先进入市场。 美国已有40多种基因药物投放市场，主要用于治疗
癌症、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、细菌
感染、代谢病等疑难病症。
第八章基因工程诞生与发展
美国投放市场的基因药物，1997年超过60亿美 元，且每年以20%的速度增长。
我国也有10多种基因药物投放市场，但大部分基 因药物仍需进口。
因此，基因是企业家的聚宝盆。
因此，他开发了在酶的作用下在试管内将的噬菌体基 因与SV40基因结合在一起的技术。
第八章基因工程诞生与发展
DNA体外重组的创建成功， 是“遗传工程”的奠基之作。
EcoRI
＋
SV40 λDNA
1972. PNAS
David Jackson Robert Symons Paul Berg
《基因工程》第八章基因工程的安全防护
基因工程的安全防护
二. 生物公害的控制
1. 实验人员适应性训练 随着学科之间的交叉和渗透, 大量其它专业的科学家( 随着学科之间的交叉和渗透, 大量其它专业的科学家( 物 理、化学、工程学、数学等) 进入了这一领域. 这些人缺乏生 化学、工程学、数学等) 进入了这一领域. 物学, 特别是有关病原微生物的知识. 物学, 特别是有关病原微生物的知识. 对从事基因操作的实验人员进行以下几方面的训练: 对从事基因操作的实验人员进行以下几方面的训练: 不同危险度微生物的操作技术; 不同危险度微生物的操作技术; 关于物理防护的技术知识; 关于物理防护的技术知识; 关于生物防护的技术知识; 关于生物防护的技术知识; 有关拟开展的实验的安全知识; 有关拟开展的实验的安全知识; 处理事故的能力； 处理事故的能力；
基因工程的安全防护－生物公害的控制 2.生物防护 2.生物防护 ( Biological Containment ) 2) 宿主细胞 宿主细胞应当具有在特定的有选择的条件下生存、 宿主细胞应当具有在特定的有选择的条件下生存、繁 殖, 而在一般自然条件下很难生存和繁殖的生物特性( 例如, 而在一般自然条件下很难生存和繁殖的生物特性( 例如, 营养缺陷型菌株、低温条件生长菌株等) 营养缺陷型菌株、低温条件生长菌株等)。 DNA重组体 3) DNA重组体 DNA重组体在自然条件下对人类和生态环境应当是安全 DNA重组体在自然条件下对人类和生态环境应当是安全 无害的。 无害的。
基因工程的安全防护－生物公害的控制
4. 重组体的保管 除了上述的安全防护外, 除了上述的安全防护外, 还应该 : 建立特殊实验的管理和健康监督安全管理机构和规则; (1) 建立特殊实验的管理和健康监督安全管理机构和规则; (2) 对安全性没有把握的实验, 要进行特殊管理, 对安全性没有把握的实验, 要进行特殊管理, 并进行临 床人体实验; 床人体实验; 在实验前和实验后一年内, 应对实验人员进行健康检查. (3) 在实验前和实验后一年内, 应对实验人员进行健康检查.
《微生物学》主要知识点-08第八章微生物的遗传
第八章微生物的遗传概述：遗传(heredity or inheritanc® 和变异(variation)是生物体的最本质的属性之一。
遗传即生物的亲代将一整套遗传因子传递给子代的行为或功能。
变异指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变。
基因型(ge no type某一生物个体所含有的全部基因的总和。
表型(phe no type)某一生物所具有的一切外表特征及内在特性的总和。
饰变( modification)不涉及遗传物质结构改变而发生在转录、翻译水平上的表型变化。
8.1遗传变异的物质基础8.1.1三个经典实验1. 经典转化实验：1928年F.Griffith以Streptococcus pneumoniae为研究对象进行转化(transformation)实验。
1944年O.T.Avery等人进一步研究得出DNA是遗传因子。
S strun A2. 噬菌体感染实验：1952年Alfred D.Hershey和Martha Chase用32P标记病毒的DNA，用35S标记病毒的蛋白质外壳，证实了T2噬菌体的DNA是遗传物质。
3.植物病毒的重建实1956年H.Fraenkel-Conrat用含RNA的烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）与TMV 近源的霍氏车前花叶病毒（Holmes ribgrass mosaic virus,HRV）所进行的拆分与重建实验证明，RNA也是遗传的物质基础。
8.2微生物的基因组结构：基因组（genome是指存在于细胞或病毒中的所有基因。
细菌在一般情况下是一套基因，即单倍体（haploid）;真核微生物通常是有两套基因又称二倍体（diploid ）。
基因组通常是指全部一套基因。
由于现在发现许多非编码序列具有重要的功能，因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列的总称，包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的DNA序列。
第8章-酵母基因工程---基因工程原理与技术---刘志国-课件
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
酵母基因工程
酵母基因工程一酵母基因工程的发展现状1.酿酒酵母自身的改造（1）将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母（2）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母（3）将β—葡聚糖酶基因导入酵母（4）将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达（5）将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母2酵母表达异源蛋白（1）表达水平（2）表达质量2酵母基因工程的发展趋势（1）解决酵母基因工程中还存在的缺陷（2）在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向（3）利用酵母基因工程筛选更多新药（4）改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本（5）酵母的生理承受极限研究引起人们的关注3发展历程1.1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。
2.1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。
3.1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。
4.我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。
5.1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。
二．酵母基因工程的优点1.安全无毒，不致病；2.有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；3.容易进行载体DNA的导入。
DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；4.培养条件简单，容易进行高密度发酵；5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中；6.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能三．酵母表达系统（1）酵母表达载体①载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。
原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列(ori)和抗生素抗性基因序列。
酵母部分：1酵母菌中维持复制的元件：2μ质粒复制起点；自主复制序列(ARS)；整合型载体的整合介导区。
2营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列3基因启动子和终止子序列4信号肽序列②载体的复制形式附加型载体：在酵母染色体外自主复制1酿酒酵母2μ质粒的DNA的复制元件所构建的2酵母基因组DNA的自主复制序列ARS所构建的整合型载体：随同酵母染色体一起复制1含有与受体菌基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，介导载体与宿主染色体之间发生同源重组。
基因工程-外源基因在酵母菌中的表达
基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。
【微生物工程】第八章_基因工程菌的培养
基因工程菌培养方式
连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程
度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研
究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等 创造了良好的条件。
但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。 在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优 化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高表达水平或最大产率。
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是元件促进重组分子的缺失重排
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高
r1质粒上的parb基因引入表达型载体中其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞基因工程菌的稳定性基因工程菌的稳定性提高基因工程菌稳定性的策略施加选择压力根据载体上的抗药性标记向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素加入大量的抗生素会使生产成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素只能维持一定时间添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力载体上的营养缺陷型标记向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂成本较高提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法提高基因工程菌稳定性的策略分阶段控制培养因外源基因表达造成质粒不稳定时可以考虑将发酵过程分阶段控制在生长阶段使外源基因处于阻遏状态避免因表达造成不稳定性问题的发生
第八章基因工程电子教案
导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。
目的基因的筛选和鉴定
(screening/selection)
• 遗传学方法
– 插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择 – 标志补救 表达产物与营养缺陷互补
• 3′→5′外切酶活性 • 5′→3′外切酶活性
3′→5′外 切 酶 活 性
5′
3′
3′
5′
5′→3′外 切 酶 活 性
末端脱氧核 苷酰转移酶 (TDT)
载体 vector
• DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和 表达
• 克隆载体、表达载体 • 原核载体: 质粒(pBR322,pUC…）
Eco RⅠ Hind Ⅲ
氨苄青霉素 抗性基因
(ampr)
Pst Ⅰ
pBR322
Bam HⅠ
Sal Ⅰ
四环素 抗性基因
(terr)
Ava Ⅰ
O ri
Pvu Ⅱ
常用的克隆载体
• λ噬菌体(λphage) • 基因组分三个区域: 左侧区、中间区（非必需
区）、右侧区 • DNA，替换型载体，外源DNA: 9~23kb • 常用: EMBL 系列、 λgt 系列、charon系列 • 粘性质粒(cosmid): λDNA的 cos区+质粒，双链
环状DNA，克隆容量: 40~50kb • M13噬菌体 • 最大优点: 产生单链DNA
特点:
cos:cohesiveend site
RF DNA: replicational form DNA
优点:
表达载体(expressing vector)
发酵工程第八章
pH对细胞形态的影响 pH对细胞形态的影响 这实际上是pH值对细胞生长和代 这实际上是pH值对细胞生长和代 谢途径影响的外部（宏观）表现， 在GA发酵过程中，pH值不同， GA发酵过程中，pH值不同， 代谢途径不同，菌体形态不同。 在青霉素发酵过程中，pH≧6.0时， 在青霉素发酵过程中，pH≧6.0时， 菌丝体缩短，而pH≧7.0时，膨 菌丝体缩短，而pH≧7.0时，膨 胀的菌丝体明显的增加。
一、氧对发酵的影响
影响了菌系的酶活性 氧的存在影响了代谢途径
二、氧传递动力学：
氧传递的双膜理论 1溶氧过程存在一个界面，这个界面 的厚度可以忽略不计。在这个界面上， 气相中氧的分压与溶于液相中氧的浓 度呈平衡关系，既Pi与Ci呈平衡关系， 度呈平衡关系，既Pi与Ci呈平衡关系， 符合亨利定律：Ci= 符合亨利定律：Ci= K *Pi 2传质过程是一个稳定的过程，各点 氧的浓度不是时间的函数。 3气膜、液膜都以层流状态存在。
三、提高氧传递效率的途径
提高kLa 提高kLa 搅拌 打碎气流，形成小气泡，增加气液接触 面积. 面积. 使液体形成涡流，增加气泡在液体中的 滞留时间 增加液体的湍流程度，减少气泡周围的 液膜阻力k3液膜阻力k3-1，减少氧在液体主流中的 传递阻力k4传递阻力k4-1 对于真菌、食用菌等易结团现象，降低 细胞膜的表面阻力，降低细胞周围代谢 物的浓度
提高（c* c)，即氧传递动力 提高（c* - c)，即氧传递动力
c*，受到体系的温度、发酵液的 c*，受到体系的温度、发酵液的 浓度、粘度、pH值等因素的影响， 浓度、粘度、pH值等因素的影响， 改变c*是没有太大的余地的。因 改变c*是没有太大的余地的。因 为，发酵温度、浓度等严格的受 到菌体生长和发酵工艺的限制。
生物技术概论论文-酵母基因工程菌的构建过程及其在食品领域中的应用
酵母基因工程菌的构建过程及其在食品领域中的应用随着科技的发展，食品生物技术在食品工业发展中的地位和作用越来越大，已经渗透到食品工业的方方面面，特别是基因工程技术等技术在21世纪的食品工业中充当重要的角色。
而工程菌就是用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系，是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点。
主要应用于治理海洋石油泄漏，生产基因工程药物，酵母基因工程中等方面。
而酵母基因工程中，酵母基因工程菌就是菌类细胞株系用的是酵母菌，能够发挥着一定的功能，可以提高发酵的效率。
酵母基因工程的优点：1.是真核生物，大多具有价高的安全性。
2.繁殖速度快，能大规模生产，具有降低基因工程产品成本的潜力。
3.将原核生物中已知的分子和基因操作技术与真核生物中复杂的转运后修饰能力相结合，能方便外缘基因的操作。
4.采用高表达启动子，可高效表达目的基因，而且可诱导调控。
5.提供了翻译后加工和分泌的环境，使得产物和天然蛋白质一样或类似。
6.酵母菌可表达外源蛋白与末端前导肽融合，指导新生肽分泌，同时在分泌过程中可对表达的蛋白进行糖基化修饰。
7.不会形成不溶性的包涵体，易于分离提纯8.移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物中使用中引起免疫反应的问题。
9.酵母菌（主要是酿酒酵母）已完成全基因组测序，他具有比大肠杆菌更完备的基因表达控制机制和对表达产物的加工修饰和分泌能力。
10.酵母可进行蛋白的N-乙酰化，C-甲基化，对定向到膜的胞内表达蛋白具有重要意义。
构建基因工程菌是一个复杂、繁琐的过程，因此构建酵母基因要注意：1、结构简单，易于研究2、繁殖能力强，数目多3、成本低，易于培养、4易于观察。
一．酵母基因工程菌的构建过程：1.目的基因的获取：获取目的基因是实施基因工程的第一步，有三种方法提取目的基因。
（1）从自然界中已有的物种中分离出来：.从基因文库中获取目的基因（俗称：鸟枪法）：将含有某种生物的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。
酵母同源重组原理
酵母同源重组原理酵母同源重组原理是指利用酵母细胞进行基因工程操作以获得想要的特定基因或蛋白质。
该技术的基本原理是利用酵母细胞自然的DNA重组能力，通过合成或克隆DNA片段，将目标基因或载体DNA序列纳入到酵母细胞染色体中，并让其在细胞内表达，从而实现基因工程改造的目的。
酵母是一类单细胞真菌，常见的有酿酒酵母、面包酵母等，不仅广泛应用于食品工业，还被广泛用于生物学实验中。
酵母细胞具有许多与真核生物相似的生物学特点，包括真正的核糖体、线粒体、内质网和高度保守的基因调控机制。
因此，酵母也成为了生物学研究的理想模式生物。
其中，同源重组是指将同一染色体上的两个相似的DNA序列之间的交换事件。
这种重组机制是酵母细胞通过自然方式进行基因重组的重要方式，同时也是酵母同源重组技术的原理基础之一。
通过利用酵母同源重组技术，可以将外源DNA片段集成到酵母基因组中，实现外源基因的表达。
利用酵母基因工程技术进行基因表达，主要受到以下因素的影响：1、酵母细胞和外源DNA的适应性：外源DNA序列与酵母细胞基因组的适应程度越高，在其整合过程中的成功率就越高。
2、DNA浓度和转化技术：转化DNA的浓度和质量对重组的成功率和效率具有很大的影响，因此DNA的提取方法和转化技术必须严格控制。
3、选择标记：选择标记是用于筛选欲表达基因转化体的标记物质。
在基因工程中，一般会选择具有抗性基因、荧光素酶等作为筛选标记物质。
总之，酵母同源重组技术是一种很重要的基因工程技术，它结合了酵母生物的优越性，可以实现外源基因的高效表达，并且具有特异性与背景低噪声等特点，因此在微生物学研究、基因治疗和生物制药等领域中得到了广泛应用。
《酵母基因工程》课件
利用酵母细胞生产某些药物的活性成分或中间体，可降低生产成本和提高产量。
改良农作物和食品品质
农作物改良
通过基因工程技术将优良性状基因转入酵母细胞，再将其返回植物细胞，实现农作物的 遗传改良，提高产量和抗逆性。
食品品质
通过酵母基因工程改良食品加工过程中的菌种，提高食品的口感、营养价值和安全性。
基因治疗和基因组编辑
基因治疗
利用酵母基因工程技术将正常基因转入 病变细胞，替代或修复缺陷基因，从而 达到治疗遗传性疾病和恶性肿瘤的目的 。
VS
基因组编辑
通过酵母基因工程技术实现精准的基因组 编辑，如CRISPR-Cas9系统，可对人类 、动物和植物的基因进行精确的敲除、插 入和突变等操作，为遗传疾病治疗、农作 物改良等领域提供有力工具。
04
CATALOGUE
酵母基因工程面临的挑战和解决方案
基因表达调控的复杂性
总结词
酵母基因表达调控涉及多个层面，包括转录 、转录后和翻译后调控，具有高度复杂性。
详细描述
酵母基因表达调控涉及转录因子、顺式元件 和反式元件之间的相互作用，以及mRNA的 稳定性、翻译效率和蛋白修饰等。这些因素 共同决定了基因的表达水平和细胞命运。
02
CATALOGUE
酵母基因工程的工具和技术
基因克隆和鉴定技术 样本中分离出来，获得其DNA序 列的过程。
基因鉴定
利用分子生物学技术，如测序、 基因表达谱分析等，对克隆得到 的基因进行功能、结构和表达特 征的鉴定。
酵母转化技术
药物。
基因治疗
利用酵母作为载体，将 外源基因导入人体细胞 内，治疗遗传性疾病和
癌症。
生物能源
通过基因工程手段改良 酵母，提高其生物燃料
微生物学第八章
具有一定遗传型的个体,在特定 环境条件下通过生长发育所表现 出的形态等生物学特征的总和.
李 先 磊
表型是由遗传型所决定,但也和环境有关。
表型饰变：
化学化工学院
表型的差异只与环境有关 特点:暂时性、不可遗传性、表现为全部个体行为 微
生 物 学 （ MICROBIOOGY
橘生淮南则为橘,生于淮北则为枳.
李 先 磊
化学化工学院 4、毒性质粒（virulence plasmid）
许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起 的,这些质粒具有编码毒素的基因,其产物对宿主 微 (动物、植物)造成伤害。 生 物 产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病 学 （ 原菌之一,其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素 编码的质粒。 苏云金杆菌含有编码δ内毒素(伴孢晶体)的质粒
李 先 磊 ）
MICROBIOOGY
第一节 遗传的物质基础
微 生 物 学 （ MICROBIOOGY ） 李 先 磊
化学化工学院
一、DNA作为遗传物质 二、RNA作为遗传物质
三、朊病毒的发现与思考
一、DNA作为遗传物质
微 生 物 学 （ MICROBIOOGY ） 李 先 磊
化学化工学院
化学化工学院
李 先 磊
二、微生物与人类基因组计划
化学化工学院
微 人类基因组计划 生 物 (Human Genome Project) 学 （ MICROBIOOGY
1985年提出； 1990年正式开始实施； ） 2001年2月，测序工作完成；
李 先 磊
后基因组时代
化学化工学院
微生物基因组测序工作是在人类基因 微 生 组计划的促进下开始的,最开始是作为 物 学 模式生物,后来不断发展,已成为研究微 （ 生物学的最有力的手段。
第八章酵母基因工程详解
显性标记基因
显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因 编码产物 氨基糖苷转移酶 氯霉素乙酰转移酶 二氢叶酸还原酶 遗传表型 抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺胺
aph cat dhfr
cup1
suc2 ilv2
铜离子螯合物
蔗糖转化酶 乙酰乳糖合成酶
耐受铜离子
耐受高浓度蔗糖 抗硫酰脲除草剂
特点：转化率高（105 / mg DNA）、操作简便、适用范围广
5 外源DNA在酵母宿主细胞中的命运
单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制 不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体 外源DNA常通过同源或非同源方式与染色体DNA重组 线性化DNA更易于同源重组
酵母菌表达系统的选择
巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生 长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长 迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯 德毕赤酵母表达系统的三大优势。 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因 的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种 具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。
真菌基因工程
一、真菌表达系统的优缺点
二、酵母转化系统
三、甲醇酵母表达系统
四、丝状真菌表达系统
一、真菌表达系统的优缺点
具有原核系统的操作简便、分子生物学背景清楚的优点
具有真核系统蛋白翻译后加工和分泌系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） 缺点：产物糖基化位点和结构特点与高等真核的有差距
基因工程
(三)科技发展必需和人文社会科学发展相结合：
1.当代各种全球性问题出现，从一定意义上来说是由 于科学技术广泛应用于社会而引发的，如TMD、NMD(布 什对萨达姆)
2.科学技术是第一生产力，而文化水平是人类把握科 学技术的一个尺度。
3.科学技术是一把双刃剑，原子核技术可以给人类带 来光明，原子弹却可以把长崎、广岛夷为平地；克隆技术， 基因工程技术可以挽救濒临灭绝的动物（国宝熊猫），也可 以动摇人类以性爱为基础的生产方式……（冷冰冰克隆人和 自然人，×情人节少了一个经济增长点；克隆战争狂人和反 战英雄；克隆idea孙悟空齐天大圣）。基因工程技术是当 代科学技术重要的前沿。
（四）此克隆非彼克隆
供体细胞 受体细胞 发育场所 关键区别
胚胎细胞克隆 胚胎细胞（核） 去核未受精的卵细胞 母体宫腔 克隆的是子代（多生了一个）
体细胞克隆 体细胞（核）
去核未受精的卵细胞 母体宫腔
复制的是自己（复制了一个）
（五）克隆是一把双刃剑
试想，有了克隆技术，有人在你毫不知晓的情况下复制一个“你” 去犯罪，怎么办？试想，有了克隆技术，一些极权的政治野心家一下 子克隆出好几个战争狂人希特勒、墨索里尼，怎么办？还有，有了克 隆技术，世界上同时生活着多个你、我、父母、兄弟、姐妹，按现行 的社会伦理道德很难为其“名份”定位，又该怎么办？因此说克隆对 人类社会伦理道德提出了一场非同寻常的挑战，平添一系列是我非我、 是父非父、是妻非妻、是子非子之类的麻烦事，绝非危言耸听。从社 会伦理角度看，用克隆技术培育出的人，有其特定的生理性状，这对 人类的自然发展和人种的自然构成无疑会产生极大的影响。
二．基因工程的概念
（一）基因（gene） 基因 从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序
基因工程 酵母单杂交技术的原理及应用
酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪90年年代中期又发展起来的--用于核酸和文库蛋白之间的研究。
在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点。
将已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin）上游，把报告基因连接到Pmin下游。
编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用原件结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。
转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。
优点：简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真真核生物，杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了体外研究时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很高。
缺点：有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报道基因的转录，因而存在假阳性结果。
如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合蛋白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于细胞核内，以及融合的GAL4-AD封闭了蛋白上与DNA作用的位点则都可能干扰AD杂合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性的结果。
酵母单杂交系统应用：1. 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。
Chew et al（1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基因的内含子结合蛋白。
2. 对DNA结合结构域进行分析如果能得到DNA结合结构域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析.Mak et al（1996）运用此技术测试哺乳动物具有基本的螺旋- 环- 螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性。
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生物效应
型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 超糖基化倾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。
甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 型 外侧糖链添加缺陷型
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型
生物效应
1
改善重组蛋白分泌
2
提高重组蛋白表达
质粒
*只有大肠杆菌的复制子 *引入酵母基因组的同源序列 *载体以同源或非同源重组方式整
合入宿主基因组 *拷贝数：大多情况下为1个
以酵母标记基因（3)的5’端和3’ 端作同源序列
3 用于酵母转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因 显性基因
营养缺陷型的互补基因
宿主细胞：为氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变子 主要有：、、、
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
1、 2、 3、 4、 5、 6、 7
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由 4基因表达， 4-突变株能正常生 长。
1缺陷型： 1编码泛素激活酶E1，1突变是致死性的，但其等位基因缺陷是非 致死性的
4 - 5 双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
细胞：带壁的完整细胞 原理：通过碱金属离子（如等）、和热休克处理诱
导细胞吸收外源。 特点：
吸收线型的能力明显大于环状，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
酵母菌电击转化法
细胞：带壁完整细胞或原生质体 原理：通过电脉冲对细胞膜造成摄取通道 特点：转化率高（105 / ）、操作简便、适用范围广
载体：携带相应的合成基因 如：12、1、34 、3
选择压力：不完全培养基 如：、无机盐培养基
显性标记基因
显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因
编码产物
遗传型
氨基糖苷转移酶
氯霉素乙酰转移酶
二氢叶酸还原酶
胺1
铜离子螯合物
2
蔗糖转化酶
糖2
乙酰乳糖合成酶
草剂
抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺 耐受铜离子 耐受高浓度蔗 抗硫酰脲除
真菌基因工程
一、真菌表达系统的优缺点 二、酵母转化系统 三、甲醇酵母表达系统 四、丝状真菌表达系统
一、真菌表达系统的优缺点
具有原核系统的操作简便、分子生物学背景清楚的优点 具有真核系统蛋白翻译后加工和分泌系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） 缺点：产物糖基化位点和结构特点与高等真核的有差距
1
提高重组蛋白表达
1
提高重组蛋白表达
11 改善重组蛋白分泌
提高重组蛋白表达
作用位点
钙离子依赖型的酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
HOOC
76
E3
靶蛋白
E3
靶蛋白
蛋白酶体
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
质粒
*复制子：染色体来源的 *拷贝数50-100 *不稳定 培养几代后，质粒的丢失率高达 5070%，主要是由于分配不均匀 所致。 :
质粒
*在中引入 ：着丝粒序列，来源于3号染色
体，有丝分裂稳定，低拷贝数 *复制子：染色体来源的 *拷贝数：1-5
质粒
*在中引入 ：端粒，染色体末端序列，利于
线性末端稳定 稳定性：随生质体转化法 碱金属离子介导转化法 电激转化法
酵母菌原生质体转化法
细胞：去壁的原生质体 原理：以等渗缓冲液稳定原生质体，以2+诱导细胞
摄取外源。 特点：30%以上为多质粒共转化 转化效率：可达原生质体总数的1-2%，但操作周期长， 而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母（ ）： *无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真 核生物 *繁殖方式与原核类似，易于操作 *基因表达调控机理与高等真核类似
用作外源基因表达的酵母宿主菌
酿酒酵母： 最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化
甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理 毕赤酵母：巴斯德毕赤酵母（ ） 汉逊酵母：多型汉逊酵母（ ）
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因：
1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（52） 对数生长期表达 稳定期关闭
2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（52） 对数生长期表达 稳定期关闭
3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（76） 对数生长期表达 稳定期关闭
4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
二、酵母转化系统
酵母宿主系统 酵母载体系统 酵母系统标记基因 酵母转化方法 外源DNA在酵母宿主中的命运
1、酵母宿主系统
用作模式真核生物的酵母宿主菌 用作外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
用作模式真核生物的酵母宿主菌
接合酵母属中的1和1，以及 克鲁维酵母属中的1等均与2μ质 粒类似。
1
A
2
同源重组 B
人工构建酵母质粒的共同特点
含有大肠杆菌质粒的复制元点，以便克隆操作 含有一定数量供克隆操作的单一酶切位点 含有在酵母和大肠杆菌中进行选择的双标记 除YIp型质粒外均为穿梭载体
质粒
*复制子：2m质粒来源的 *拷贝数50-100 *不稳定 培养几代后，质粒的丢失率高 达5070%，主要是由于分配不 均匀所致。
其它酵母：已有60多种酵母菌建立了转化系统 乳酸克鲁维酵母（ ) 非洲酒裂殖酵母（ )
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，
它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖
链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白
能抑制超糖基化的突变类型
质的糖基化系统，但野生 突变类型
2、酵母载体系统
野生型质粒：2m质粒（酿酒酵母） 人工构建质粒: 5种
酵母附加型质粒（） 酵母复制型质粒（） 酵母着丝粒质粒（) 酵母人工染色体（） 酵母整合型质粒（）
酿酒酵母中的2μ环状质粒
野生型，双链、环状、6
拷贝数达50至100个
反向重复序列，600 ，重组 编码产物驱动的同源重组 编码产物控制质粒的稳定性 的结合位点