第八章酵母基因工程详解
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其它酵母：已有60多种酵母菌建立了转化系统 乳酸克鲁维酵母（ ) 非洲酒裂殖酵母（ )
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，
它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖
链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白
能抑制超糖基化的突变类型
质的糖基化系统，但野生 突变类型
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因：
1 编码ห้องสมุดไป่ตู้素-羧基延伸蛋白52（52） 对数生长期表达 稳定期关闭
2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（52） 对数生长期表达 稳定期关闭
3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（76） 对数生长期表达 稳定期关闭
4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
4 酵母菌转化方法
原生质体转化法 碱金属离子介导转化法 电激转化法
酵母菌原生质体转化法
细胞：去壁的原生质体 原理：以等渗缓冲液稳定原生质体，以2+诱导细胞
摄取外源。 特点：30%以上为多质粒共转化 转化效率：可达原生质体总数的1-2%，但操作周期长， 而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
细胞：带壁的完整细胞 原理：通过碱金属离子（如等）、和热休克处理诱
导细胞吸收外源。 特点：
吸收线型的能力明显大于环状，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
酵母菌电击转化法
细胞：带壁完整细胞或原生质体 原理：通过电脉冲对细胞膜造成摄取通道 特点：转化率高（105 / ）、操作简便、适用范围广
接合酵母属中的1和1，以及 克鲁维酵母属中的1等均与2μ质 粒类似。
1
A
2
同源重组 B
人工构建酵母质粒的共同特点
含有大肠杆菌质粒的复制元点，以便克隆操作 含有一定数量供克隆操作的单一酶切位点 含有在酵母和大肠杆菌中进行选择的双标记 除YIp型质粒外均为穿梭载体
质粒
*复制子：2m质粒来源的 *拷贝数50-100 *不稳定 培养几代后，质粒的丢失率高 达5070%，主要是由于分配不 均匀所致。
真菌基因工程
一、真菌表达系统的优缺点 二、酵母转化系统 三、甲醇酵母表达系统 四、丝状真菌表达系统
一、真菌表达系统的优缺点
具有原核系统的操作简便、分子生物学背景清楚的优点 具有真核系统蛋白翻译后加工和分泌系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） 缺点：产物糖基化位点和结构特点与高等真核的有差距
2、酵母载体系统
野生型质粒：2m质粒（酿酒酵母） 人工构建质粒: 5种
酵母附加型质粒（） 酵母复制型质粒（） 酵母着丝粒质粒（) 酵母人工染色体（） 酵母整合型质粒（）
酿酒酵母中的2μ环状质粒
野生型，双链、环状、6
拷贝数达50至100个
反向重复序列，600 ，重组 编码产物驱动的同源重组 编码产物控制质粒的稳定性 的结合位点
酿酒酵母（ ）： *无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真 核生物 *繁殖方式与原核类似，易于操作 *基因表达调控机理与高等真核类似
用作外源基因表达的酵母宿主菌
酿酒酵母： 最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化
甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理 毕赤酵母：巴斯德毕赤酵母（ ） 汉逊酵母：多型汉逊酵母（ ）
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
1、 2、 3、 4、 5、 6、 7
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由 4基因表达， 4-突变株能正常生 长。
1缺陷型： 1编码泛素激活酶E1，1突变是致死性的，但其等位基因缺陷是非 致死性的
4 - 5 双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
生物效应
型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 超糖基化倾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。
甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 型 外侧糖链添加缺陷型
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型
生物效应
1
改善重组蛋白分泌
2
提高重组蛋白表达
载体：携带相应的合成基因 如：12、1、34 、3
选择压力：不完全培养基 如：、无机盐培养基
显性标记基因
显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因
编码产物
遗传表型
氨基糖苷转移酶
氯霉素乙酰转移酶
二氢叶酸还原酶
胺1
铜离子螯合物
2
蔗糖转化酶
糖2
乙酰乳糖合成酶
草剂
抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺 耐受铜离子 耐受高浓度蔗 抗硫酰脲除
1
提高重组蛋白表达
1
提高重组蛋白表达
11 改善重组蛋白分泌
提高重组蛋白表达
作用位点
钙离子依赖型的酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
HOOC
76
E3
靶蛋白
E3
靶蛋白
蛋白酶体
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
质粒
*复制子：染色体来源的 *拷贝数50-100 *不稳定 培养几代后，质粒的丢失率高达 5070%，主要是由于分配不均匀 所致。 :
质粒
*在中引入 ：着丝粒序列，来源于3号染色
体，有丝分裂稳定，低拷贝数 *复制子：染色体来源的 *拷贝数：1-5
质粒
*在中引入 ：端粒，染色体末端序列，利于
线性末端稳定 稳定性：随着插入片段的增大而增 加 用途：大型基因文库构建
二、酵母转化系统
酵母宿主系统 酵母载体系统 酵母系统标记基因 酵母转化方法 外源DNA在酵母宿主中的命运
1、酵母宿主系统
用作模式真核生物的酵母宿主菌 用作外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
用作模式真核生物的酵母宿主菌
质粒
*只有大肠杆菌的复制子 *引入酵母基因组的同源序列 *载体以同源或非同源重组方式整
合入宿主基因组 *拷贝数：大多情况下为1个
以酵母标记基因（3)的5’端和3’ 端作同源序列
3 用于酵母转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因 显性基因
营养缺陷型的互补基因
宿主细胞：为氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变子 主要有：、、、
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，
它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖
链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白
能抑制超糖基化的突变类型
质的糖基化系统，但野生 突变类型
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因：
1 编码ห้องสมุดไป่ตู้素-羧基延伸蛋白52（52） 对数生长期表达 稳定期关闭
2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（52） 对数生长期表达 稳定期关闭
3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（76） 对数生长期表达 稳定期关闭
4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
4 酵母菌转化方法
原生质体转化法 碱金属离子介导转化法 电激转化法
酵母菌原生质体转化法
细胞：去壁的原生质体 原理：以等渗缓冲液稳定原生质体，以2+诱导细胞
摄取外源。 特点：30%以上为多质粒共转化 转化效率：可达原生质体总数的1-2%，但操作周期长， 而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
细胞：带壁的完整细胞 原理：通过碱金属离子（如等）、和热休克处理诱
导细胞吸收外源。 特点：
吸收线型的能力明显大于环状，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
酵母菌电击转化法
细胞：带壁完整细胞或原生质体 原理：通过电脉冲对细胞膜造成摄取通道 特点：转化率高（105 / ）、操作简便、适用范围广
接合酵母属中的1和1，以及 克鲁维酵母属中的1等均与2μ质 粒类似。
1
A
2
同源重组 B
人工构建酵母质粒的共同特点
含有大肠杆菌质粒的复制元点，以便克隆操作 含有一定数量供克隆操作的单一酶切位点 含有在酵母和大肠杆菌中进行选择的双标记 除YIp型质粒外均为穿梭载体
质粒
*复制子：2m质粒来源的 *拷贝数50-100 *不稳定 培养几代后，质粒的丢失率高 达5070%，主要是由于分配不 均匀所致。
真菌基因工程
一、真菌表达系统的优缺点 二、酵母转化系统 三、甲醇酵母表达系统 四、丝状真菌表达系统
一、真菌表达系统的优缺点
具有原核系统的操作简便、分子生物学背景清楚的优点 具有真核系统蛋白翻译后加工和分泌系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） 缺点：产物糖基化位点和结构特点与高等真核的有差距
2、酵母载体系统
野生型质粒：2m质粒（酿酒酵母） 人工构建质粒: 5种
酵母附加型质粒（） 酵母复制型质粒（） 酵母着丝粒质粒（) 酵母人工染色体（） 酵母整合型质粒（）
酿酒酵母中的2μ环状质粒
野生型，双链、环状、6
拷贝数达50至100个
反向重复序列，600 ，重组 编码产物驱动的同源重组 编码产物控制质粒的稳定性 的结合位点
酿酒酵母（ ）： *无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真 核生物 *繁殖方式与原核类似，易于操作 *基因表达调控机理与高等真核类似
用作外源基因表达的酵母宿主菌
酿酒酵母： 最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化
甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理 毕赤酵母：巴斯德毕赤酵母（ ） 汉逊酵母：多型汉逊酵母（ ）
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
1、 2、 3、 4、 5、 6、 7
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由 4基因表达， 4-突变株能正常生 长。
1缺陷型： 1编码泛素激活酶E1，1突变是致死性的，但其等位基因缺陷是非 致死性的
4 - 5 双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
生物效应
型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 超糖基化倾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。
甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 型 外侧糖链添加缺陷型
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型
生物效应
1
改善重组蛋白分泌
2
提高重组蛋白表达
载体：携带相应的合成基因 如：12、1、34 、3
选择压力：不完全培养基 如：、无机盐培养基
显性标记基因
显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因
编码产物
遗传表型
氨基糖苷转移酶
氯霉素乙酰转移酶
二氢叶酸还原酶
胺1
铜离子螯合物
2
蔗糖转化酶
糖2
乙酰乳糖合成酶
草剂
抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺 耐受铜离子 耐受高浓度蔗 抗硫酰脲除
1
提高重组蛋白表达
1
提高重组蛋白表达
11 改善重组蛋白分泌
提高重组蛋白表达
作用位点
钙离子依赖型的酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
HOOC
76
E3
靶蛋白
E3
靶蛋白
蛋白酶体
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
质粒
*复制子：染色体来源的 *拷贝数50-100 *不稳定 培养几代后，质粒的丢失率高达 5070%，主要是由于分配不均匀 所致。 :
质粒
*在中引入 ：着丝粒序列，来源于3号染色
体，有丝分裂稳定，低拷贝数 *复制子：染色体来源的 *拷贝数：1-5
质粒
*在中引入 ：端粒，染色体末端序列，利于
线性末端稳定 稳定性：随着插入片段的增大而增 加 用途：大型基因文库构建
二、酵母转化系统
酵母宿主系统 酵母载体系统 酵母系统标记基因 酵母转化方法 外源DNA在酵母宿主中的命运
1、酵母宿主系统
用作模式真核生物的酵母宿主菌 用作外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
用作模式真核生物的酵母宿主菌
质粒
*只有大肠杆菌的复制子 *引入酵母基因组的同源序列 *载体以同源或非同源重组方式整
合入宿主基因组 *拷贝数：大多情况下为1个
以酵母标记基因（3)的5’端和3’ 端作同源序列
3 用于酵母转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因 显性基因
营养缺陷型的互补基因
宿主细胞：为氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变子 主要有：、、、