第9章重组人红细胞生成素生产工艺

5、重组人红细胞生成素
• 用基因工程技术生产的人红细胞生成素。 • 第一代：两种，天然基因表达，rhEPO-α和rhEPO-β。 • 1989：Amgen，Epogen；1990，Ortho Biotech，Procrit • rhEPO-α，CHO细胞生产 • Roche，NeoRecormon（rhEPO-β），BHK细胞系
• 2001年，EPO（包括Arnesp）的全球销售额达21.1亿美元， 2002年达26.8亿美元，2003年全世界EPO的年销售额超过50 亿美元。创下生物工程药品单个品种之最，是当今最成功 的基因工程药物。
• 强生（Johnson&Johnson）公司的促红细胞生成素 Procrit/Eprex更是表现不俗，2001年销售额34.42亿美元， 2002年销售额42.69亿美元，2003年销售收入达到39.84亿美 元。
生物制药工程
第九章 重组人红细胞生成素的生产工艺
• 9.1 概述 • 9.2 工程CHO细胞系的构建 • 9.3 CHO细胞培养过程与工艺控制 • 9.4 分离纯化工艺与质量控制
9.1.1 红细胞生成素及其种类
1、红细胞生成素的生成与作用机理 • 1890：现象，低氧压下红细胞增多 • 1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出红细胞生成素（erythropoietin，
3、红细胞生成素的生理作用
• 红细胞生成素，又称促红细胞生成素，或红细胞生 成刺激因子：调节红系祖细胞，对红细胞生成有特 异性刺激作用的细胞因子。
EPO与靶细胞结 合：骨髓细胞、 脾细胞、肝细胞 等，促进前体细 胞增殖和分化， 生成红细胞。
4、人红细胞生成素的生物合成
• 染色体上的位置：在7q11-q22区 • 基因结构：5个外显子和4个内含子，全长2.1kb • 编码特点：外显子1编码5’非翻译区和信号肽的前4个氨基酸，外显
• 目前，国内已有10多家单位获准生产红细胞生成素。沈阳 三生和上海麒麟鲲鹏（中国）生物药业的产品在国内医院 的销售额独领风骚，2001年EPO的国内医院销售总额约为 47449万元，2002年为49508万元，2003年上半年为28606万 元。估计国内的年市场容量在20到30亿元左右，但目前年 销售额只有区区5亿元左右。
• 安进（Amgen）开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红 细胞生成素新产品Arnesp于2001年得到FDA的批准，并于 2002年初正式上市。Arnesp是一种“高糖基化”促红素产 品，其促进红细胞生成的能力大大优于第一代EPO产品。第 一年上市即大获全胜，赢得开们红，Aranesp在2002年全年 销售额为4.2亿美元，2003年全年销售额为15.4亿美元。估 计在今后3年内，Arnesp将创造10亿~15亿美元的市场销售 额并夺取现有EPO生产商的部分市场，其市场前景不可估量。
EPO）。 • 定义：
• 在哺乳动物肾脏和肝脏产生的一种分子质量为46kDa的糖蛋白细胞因子。能 刺激幼稚红细胞的增生，血红蛋白化和红细胞的成熟。
2、天然红细胞生成素的种类
• 1971：从贫血羊血浆中分离纯化出羊EPO • 1977：从再生障碍性贫血患者的尿液中分离纯化出 人EPO • hEPO形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸组成及 顺序相同，165个氨基酸，活性类似。 • 糖基化及其含量不同： hEPO-α含有较多的N-乙酰 氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸，总含糖量比hEPO-β 高。
• 大小：165个氨基酸，分子量 34-36kDa（SDS-PAGE）、 30.4kDa（超滤），糖链占分子 量的39%。 • 糖基化程度与准确性对活性影 响很大。 • pI 4.2-4.6 • 56℃半衰期为136h • pH 3.3~10.0稳定 • 较耐有机溶剂，对蛋白酶敏感
9.1.4 hEFra Baidu bibliotekO的生产工艺路线研究
9.1.2 rhEPO的临床应用与市场
• 适应症：各类贫血症 • 起因：慢性肾衰竭（主），艾滋病，癌症；化疗引起的贫血（辅助
治疗） • 开发新的临床适应症：在肾病和糖尿病 • 在生物制品中排位第一：2004年销售额11.9 BUSD，重磅炸弹药物 • 各类体育竞技中，禁止使用的药物（耐氧）
9.1.3 hEPO的理化性质
• 1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人EPO （rhEPO），1989年安进（Amgen）公司的第一个基因重组 药物Epogen获得FDA的批准，适应症为慢性肾功能衰竭导 致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血等， 其市场表现不俗，1999年销售值达到17.6亿美元，2000年 19.6亿美元，2002年22.6亿美元，2003年24.4亿美元，成为 名副其实的“重磅炸弹”基因药物。
子2、3、4分别编码49、29、60个氨基酸，外显子5编码51个氨基酸 和3’非翻译区。 • 转录产物：hEPO的mRNA大小为1.6kb，193个氨基酸的前体蛋白质， 有27个氨基酸信号肽，翻译后除去166位精氨酸。
• 成熟hEPO：165个氨基酸的糖蛋白，3个N-糖基化（24、38和83位的 天门冬酰胺），一个O-糖基化（126位丝氨酸），2对二硫键（7位 半胱氨酸-61位半胱氨酸和29位半胱氨酸-33位半胱氨酸）。
• 第二代：EPO突变体 • 2001，Amgen，Arasnep长效EPO制剂。 • rhEPO-α的突变体，170个氨基酸，5个N糖基化位点；唾液酸残基提
高2倍，半衰期36h（EPO为4~8h）；CHO细胞系生产。
研发中的EPO
• 方向：高活性，长效（3~5倍） • 聚体化：二联体或三联体EPO（化学交联法，2~3 个单体共价键连接起来，延长半衰期，提高活性）。 • 融合化：与其他细胞因子和抗体融合 • PEG化：CERA（Roche）；Hematide（Affymax） • 高度糖基化：AMG114（Amgen） • 核心结构的筛选：20个氨基酸 • 化学合成药物：FG2216，FG4592（FibroGen）