双缩脲法测定蛋白质(教学课件)
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实验六双缩脲法测定蛋白质含量
三、操作
1、稀释血清的制备 准确吸取血清0.5mL，置于试管中，加入 0.9% NaCl（即生理盐水）4.5mL,混匀备用。 （血清稀释倍数是多少？5/0.5=10）
2.取三支试管按下表操作
试剂（mL） 蒸馏水
5mg/mL标准蛋白质溶液
空白管 标准 4.0 — — 1.0 4.0
稀释血清 双缩脲试剂 A540
混匀，放置30min后，用分光光度计在 540nm波长处比色，以空白管调零点，测定各 管吸光度。
四、计算
A测定 100 C标准 稀释倍数 血清蛋白质含量（g / 100 mL） A标准 1000
C标准 ：标准蛋白质溶液浓度，为5mg/mL
血清稀释倍数为10 （人的正常值：6～8g/100mL）
2.器材：
(1)试管及试管架； (2) 吸管； (3) 分光光度计。
试剂和器材 1.试剂
(1) 0.9％NaCl溶液即生理盐水； (2) 双缩脲试剂：称取1.5g 硫酸铜(CuSO4•5H2O) 和 6.0g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6•4H2O) 溶于500mL蒸馏水 中，在搅拌下加入300 mL 10%NaOH溶液和1.0g KI， 最后用蒸馏水定容至1000mL。 (3) 标准蛋白质溶液(5mg/mL)：牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/LNaOH配制。 (4) 待测蛋白质溶液：血清样本；
实验四 双缩脲法测定蛋白质含量
一、目的
掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法
二、原理
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物， 在碱性溶液中双缩脲与硫酸铜反应生成紫红色 络合物，称为双缩脲反应。具有两个或两个以 上肽键的化合物都有双缩脲反应，因此蛋白质
【医学课件】 双缩脲法测定血清蛋白
三、试剂 1. 溴甲酚绿试剂 BCG
2. 60g/L蛋白标准液
三、试剂 1. 6mol/LNaOH
2. 双缩脲试剂
3. 双缩脲空白试剂
4. 60－70g/L标准液
四、操作
Bl
0.1
0.1
蛋白标准液
0.1
蒸留水
0.1
空白试剂
5.0
双缩脲试剂
5.0
5.0
5.0
混匀置25℃30分钟或37℃10分钟，蒸留水调零在540nm处 比色，测各管吸光度 五、 计算 血清总蛋白(g/L)
实验三、双缩脲法测定血清蛋白
一、目的
二、原理 血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液 中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物，这 种 紫 红 色 络 合 物 在 540nm 处 有 明 显 的 吸 收 峰 ， 吸 收 峰 在一定范围内与血清中蛋白含量成正比，与同样方法 处理的蛋白标准液比较求得其含量。
=(AU-ARB-AB)/(AU-ARB-AB)*标准液浓度(g/L)
六、参考值 成人 60－80(g/L) 七、注意事项 略
附：溴甲酚绿法测定血清白蛋白
一、目的
二、原理 血清白蛋白在PH4.2的缓冲液中带正电荷， 在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的 染料溴甲酚绿结合形成蓝绿色的复合物，在波长 630NM处有吸收峰，其颜色深浅与蛋白的浓度成正 比。
2. 60g/L蛋白标准液
三、试剂 1. 6mol/LNaOH
2. 双缩脲试剂
3. 双缩脲空白试剂
4. 60－70g/L标准液
四、操作
Bl
0.1
0.1
蛋白标准液
0.1
蒸留水
0.1
空白试剂
5.0
双缩脲试剂
5.0
5.0
5.0
混匀置25℃30分钟或37℃10分钟，蒸留水调零在540nm处 比色，测各管吸光度 五、 计算 血清总蛋白(g/L)
实验三、双缩脲法测定血清蛋白
一、目的
二、原理 血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液 中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物，这 种 紫 红 色 络 合 物 在 540nm 处 有 明 显 的 吸 收 峰 ， 吸 收 峰 在一定范围内与血清中蛋白含量成正比，与同样方法 处理的蛋白标准液比较求得其含量。
=(AU-ARB-AB)/(AU-ARB-AB)*标准液浓度(g/L)
六、参考值 成人 60－80(g/L) 七、注意事项 略
附：溴甲酚绿法测定血清白蛋白
一、目的
二、原理 血清白蛋白在PH4.2的缓冲液中带正电荷， 在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的 染料溴甲酚绿结合形成蓝绿色的复合物，在波长 630NM处有吸收峰，其颜色深浅与蛋白的浓度成正 比。
双缩脲法测定蛋白质含量(共7张PPT)
1
2 345
课后练习
1、记忆五种蛋白质浓度测定方法的优缺点、 灵敏度和原理。
2、双缩脲法显色的颜色是什么? 3、使用紫外－可见分光光度计时，测定A值应
当在什么范围内比较合理？为什么？
注意
1、除－CONH-有此反应外——CO NH2，
-CH2-NH2，-CS- NH2等基团亦有此反应。
2、双缩脲法常用于蛋白质的快速测定 。
3、低浓度的铵盐不干扰结果；Tris及含氨基酸、多肽的缓冲
被．以及蔗糖、甘油等干扰本实验。
4、反应完后，放置30min；灵敏度低1～20mg
Tris:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐
操作
3、低浓度的铵盐不干扰结果；
双缩脲法测定蛋白质含量
1
2
3
4
5
0——
0蛋白质标—含准有两酪—个以蛋上白的肽（键，ml因）此，有双缩—脲反应，在碱性1溶.液0 中蛋白质与C1u2.＋0形成紫红色络合—物，其颜色的深—浅与蛋白质的浓度成
样品（ml） — 正Leabharlann ，而与蛋白质的分子量和氨基酸成份无关。
2、双缩脲法显色的颜色是什么?
双01、缩除脲H双—－2法OC缩测(O定Nm脲—Hl蛋-)有白试此质剂反含应量（外—m—l）CO
2.0 NH2，4.0
— 1.0 4.0
— 1.0 4.0
2.0
2.0
—
—
4.0
4.0
0——
室温放置30分钟，于540nm处比色 2、双缩脲法常用于蛋白质的快速测定 。
Tris及含氨基酸、多肽的缓冲被．以及蔗糖、甘油等干扰本实验。
双缩脲法测定蛋白质含量
原理
蛋白质含有两个以上的肽键，因此，有双缩脲反应，在碱性
大学精品课件：实验3-双缩脲法测定蛋白质含量
样品（ml）
—
—
1.0
H2O(ml)
2.0
1.0
1.0
双缩脲试剂（ml） 4.0
4.0
4.0
室温放置30分钟，于540nm处比色
实验注意事项
1、试管要洗干净
2、取样要准确
3、加样顺序不可颠倒
4、各管试剂加完后要立即混匀
5、显色后放置时间不可太短或过长源自6、仪器在使用前要预热和校准
课后练习
1、描述五种蛋白质浓度测定方法的优缺 点、灵敏度和原理。
比
⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式 (A)
⑦ 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中
⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽 中，盖上样品室盖
⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A ⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测
样品的吸光度参数
实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。
光路
返回
光路
返回
返回
在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋 白质溶液同时反应，并于540～560nm下比色，可 以通过标准曲线法或对照法求出未知样品的蛋白质 浓度。
Cu2+ 紫红色络合物
(碱性溶液)
蛋白质在碱性溶液中也 能与硫酸铜发生相同反应， 产生紫红色络合物。
实验操作
试管编号
1
2
3
标准蛋白（ml）
—
1.0
—
2．常用方法 （1）标准曲线法
▪ 标准曲线与样品的测定条件必须一致。
（2）标准管法
CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可 求得CX。 （3）摩尔吸光系数法
双缩脲法测定蛋白质浓度
×
吸 光 度
× × ×
×
蛋白质浓度（mg/mL）
牛血清白蛋白标准曲线（双缩脲法）
吸光度-蛋白浓度现性方程：
实验试剂
双缩脲试剂；
标准溶液贮备液：2mg/mLBSA溶液 待测蛋白液：卵清蛋白液
实验操作
1. 标准曲线绘制工作表 管号 试剂 mL BSA
(2mg/mL)
0
1
2 0.6 2.4 2.0
3 0.9 2.1 2.0
4 1.2 1.8 2.0
5 1.5 1.5 2.0
6 1.8 1.2 2.0
未 未 知1 知2 3.0 0.0 2.0 3.0 0.0 2.0
0.0 0.3 3.0 2.7 2.0 2.0
dH2O 双缩脲试剂
充分混匀,30 min以内在540nm处测定吸收度. 蛋白质浓度
(mg/mL)
0.0 0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
A540nm
数据处理
标准曲线绘制：用坐标纸，以吸光度值对标准蛋白质浓度作图 Y：A540；X：蛋白质浓度(mg/mL),
坐标刻度：涵盖全部测定值，易于读取，适当反应实验精度
比例：适当，基本保证图形为正方形，容易进行数据处理 数据点标示：用X，O 等图形，其中心点为数据值 趋势线回归：常用一元回归方程；直接估计——使实验数据点 分布在拟合曲线的两侧，
直线方程拟合：任意选取拟合曲线上两点，求直线方程
未知样品浓度：测Βιβλιοθήκη 值应在标准曲线范围以内 吸光度值代入方程 稀释倍数
实验5
双缩脲法测定蛋白质浓度
实验目的
掌握比色法测蛋白质浓度原理及方法 学习标准曲线绘制和分光光度计使用
双缩脲法测定蛋白质的浓度
2 、双缩脲试剂：将 1.75gCuSO4.5H2O 溶于约 150ml 蒸馏水，
然ห้องสมุดไป่ตู้置于 1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰
冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置 2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
四、实验步骤 1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂：
0 2mg/ml 牛血清白蛋白液（ml） 0 蒸馏水（ml） 3 双缩脲试剂（ml） 2.0 OD540 0 1 0.3 2.7 2.0 2 0.6 2.4 2.0 3 0.9 2.1 2.0 4 1.2 1.8 2.0 5 1.5 1.6 2.0 6 1.8 1.2 2.0
将上述溶液混合后，试管中即有紫红色出现，在540nm下测 的各管的吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标作出标 准曲线。 2、 样液的测定 取未知浓度的蛋白质溶液 3.0ml 置试管中，加入双缩脲试剂 2.0ml，混匀，测其540nm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋 白质浓度。
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行 此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。
二、实验仪器
1、 试管 2、 吸管 3、 7200分光光度计
三、实验试剂
1 、 2mg/ml 牛 血 清 白 蛋 白 液 ： 将 1g 牛 血 清 白 蛋 白 溶 于
0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml.
实验五
一、实验原理
双缩脲法测定蛋白质的浓度
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。 蛋白质在碱性溶液中可与 CU2+ 形成紫色化合物，在一定 浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的
深浅成正比，可用比色法测定。
双缩脲反应
然ห้องสมุดไป่ตู้置于 1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰
冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置 2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
四、实验步骤 1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂：
0 2mg/ml 牛血清白蛋白液（ml） 0 蒸馏水（ml） 3 双缩脲试剂（ml） 2.0 OD540 0 1 0.3 2.7 2.0 2 0.6 2.4 2.0 3 0.9 2.1 2.0 4 1.2 1.8 2.0 5 1.5 1.6 2.0 6 1.8 1.2 2.0
将上述溶液混合后，试管中即有紫红色出现，在540nm下测 的各管的吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标作出标 准曲线。 2、 样液的测定 取未知浓度的蛋白质溶液 3.0ml 置试管中，加入双缩脲试剂 2.0ml，混匀，测其540nm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋 白质浓度。
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行 此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。
二、实验仪器
1、 试管 2、 吸管 3、 7200分光光度计
三、实验试剂
1 、 2mg/ml 牛 血 清 白 蛋 白 液 ： 将 1g 牛 血 清 白 蛋 白 溶 于
0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml.
实验五
一、实验原理
双缩脲法测定蛋白质的浓度
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。 蛋白质在碱性溶液中可与 CU2+ 形成紫色化合物，在一定 浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的
深浅成正比，可用比色法测定。
双缩脲反应
双缩脲法实验一蛋白质含量测定
6 1.2
0.8 1.0 5.0
0.0
2.0 1.0 5.0
五 操作
3.2.2 样品浓度测定 吸1 mL多糖液分别用蒸馏水稀释到100倍后， 再取1mL稀释到100倍，待用。 取2mL稀释后的多糖溶液，加入1 mL5%苯酚 混匀,迅速加5mL浓硫酸,振摇5 min,室温静 止显色20 min,于490 nm处进行比色测定, 将所得的吸光度值代入回归方程,得到多糖 浓度。
五、操作
2、平菇多糖的分离纯化
将所得上清液，倒入250ml烧杯中，按多糖
液体积：乙醇体积l:3的比例加入纯乙醇，
在4℃冷藏条件下下沉降1h，待沉降完全后，
将烧杯中的溶液放在离心管中，在
4000r/min条件下离心15min，得到平菇多
糖沉淀。
五 操作
3、平菇多糖的鉴定
离心得到的粗多糖充分溶解于50mL蒸馏水中，备用
3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离
子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根) 有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白 质； （c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应：大分子跑得慢，小分子跑得快 (3)电荷效应 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝 胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因 素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要 取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDSPAGE测定蛋白质分子量。
试验双缩脲法测定蛋白质含量
应用
（1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm， 核酸的最大吸收波长为260nm。 （3）比较吸光度的比值
纯DNA
A260nm 1.8 A280nm
常用方法
1.标准曲线法
标准系列
配制一系列不同浓度的标准溶 液（至少5个）按测定管同样方法 处理显色，在选定的波长分别测
C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸 光系数，也称为摩尔吸光系数。）
分光光度计的使用
紫外-可见分光光度计
光源
0.575
单色器
检测器 显示
吸收池 单波长单光束分光光度计
1．722型分光光度计的外形
2.仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测 试方式
“100%T/0ABS”键：用于自动调整 100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)
④ 拉动比色皿架拉杆一小格使比色皿架挡住光路，按“0%T” 键调透射比为零
⑤ 推入比色皿架使参比溶液位于光路中，盖好样品室盖，按 “100%T”调100%透射比
⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式A， 此时应显示为0，如果不是则按“100%T”再调A零
⑦ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样 品的吸光度参数
“0%T”键：用于自动调整零透射比
“波长设置”旋钮：用于设置分析波长
3.样品测试操作
① 打开电源开关，使仪器预热20分钟
② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长 位置上
③ 打开样品室盖，将参比溶液倒入比色皿中放入比色皿架靠 近测定者一端位置，并将样品溶液倒入比色皿中放入比色 皿架的其它位置，盖好样品室盖。
双缩脲法测定蛋白质浓度.
未知样品浓度：测定值应在标准曲线范围以内 吸光度值代入方程 稀释倍数
×
吸
光
度
×
× ×
×
蛋白质浓度（mg/mL）
牛血清白蛋白标准曲线（双缩脲法）
吸光度-蛋白浓度现性方程：
实验5
双缩脲法测定蛋白质浓度
实验目的
掌握比色法测蛋白质浓度原理及方法 学习标准曲线绘制和分光光度计使用
实验原理
蛋白质肽键结构具有双缩脲反应，所产生的紫色配 合物在540nm有最大吸收。在一定能够浓度范围内， 蛋白质浓度与双缩脲反应物光吸收度线性相关，可 以作为定量分析依据。
实验仪器与试剂
实验器材 玻璃试管1.5cm X15 cm， 10 只 刻度移液管5mLX3， 2mLX1， ？型 紫外-可见分光光度计
实验试剂
双缩脲试剂； 标准溶液贮备液：2mg/mLBSA溶液 待测蛋白液：卵清蛋白液
实验操作
1. 标准曲线绘制工作表
管号 0 1 2 3 4 5 6 未 未
试剂 mL
知1 知2
BSA
0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 3.0 3.0
(2mg/mL)
dH2O 3.0 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 1.2 0.0 0.0
双缩脲试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.02.0 2.0 2.0 2.0
充分混匀,30 min以内在540nm处测定吸收度.
蛋白质浓度 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
(mg/mL)
A540nm
数据处理
标准曲线绘制：用坐标纸，以吸光度值对标准蛋白质浓度作图 Y：A540；X：蛋白质浓度(mg/mL), 坐标刻度：涵盖全部测定值，易于读取，适当反应实验精度 比例：适当，基本保证图形为正方形，容易进行数据处理 数据点标示：用X，O 等图形，其中心点为数据值 趋势线回归：常用一元回归方程；直接估计——使实验数据点 分布在拟合曲线的两侧， 直线方程拟合：任意选取拟合曲线上两点，求直线方程
×
吸
光
度
×
× ×
×
蛋白质浓度（mg/mL）
牛血清白蛋白标准曲线（双缩脲法）
吸光度-蛋白浓度现性方程：
实验5
双缩脲法测定蛋白质浓度
实验目的
掌握比色法测蛋白质浓度原理及方法 学习标准曲线绘制和分光光度计使用
实验原理
蛋白质肽键结构具有双缩脲反应，所产生的紫色配 合物在540nm有最大吸收。在一定能够浓度范围内， 蛋白质浓度与双缩脲反应物光吸收度线性相关，可 以作为定量分析依据。
实验仪器与试剂
实验器材 玻璃试管1.5cm X15 cm， 10 只 刻度移液管5mLX3， 2mLX1， ？型 紫外-可见分光光度计
实验试剂
双缩脲试剂； 标准溶液贮备液：2mg/mLBSA溶液 待测蛋白液：卵清蛋白液
实验操作
1. 标准曲线绘制工作表
管号 0 1 2 3 4 5 6 未 未
试剂 mL
知1 知2
BSA
0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 3.0 3.0
(2mg/mL)
dH2O 3.0 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 1.2 0.0 0.0
双缩脲试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.02.0 2.0 2.0 2.0
充分混匀,30 min以内在540nm处测定吸收度.
蛋白质浓度 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
(mg/mL)
A540nm
数据处理
标准曲线绘制：用坐标纸，以吸光度值对标准蛋白质浓度作图 Y：A540；X：蛋白质浓度(mg/mL), 坐标刻度：涵盖全部测定值，易于读取，适当反应实验精度 比例：适当，基本保证图形为正方形，容易进行数据处理 数据点标示：用X，O 等图形，其中心点为数据值 趋势线回归：常用一元回归方程；直接估计——使实验数据点 分布在拟合曲线的两侧， 直线方程拟合：任意选取拟合曲线上两点，求直线方程
双缩脲法测定蛋白质含量
基本原理： 基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA 试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的 吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白 的浓度。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度
考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋 白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以 通过测定染料在595nm处光吸收的增加量 得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅 速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵 敏4倍）。
Folin-酚试剂法 酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 酚试剂法 法 测定蛋白质浓度
蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因 此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成 络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上， 引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质— 铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色 物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成 正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较 紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100 倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。
总蛋白定量分析－ 总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid， （ ， 二辛可宁酸、二羧基二喹啉） 二辛可宁酸、二羧基二喹啉）
•准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－ 2000µg/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20µg/ml •快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍 而且更加方便 •经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大 大节约样品和试剂用量 •不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 •检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
蛋白质含量测定(双缩脲法)
仅供个人参考不得用于商业用途For personal use only in study and research; not for commercial use 实验17 蛋白质含量测定（双缩脲法）一、目的掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
掌握分光光度计的使用方法。
二、原理碱性溶液中双缩脲（NH 2 一co 一NH 一co 一NH 2 ）能与Cu 2 + 产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应”。
蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯一比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关。
其可测定范围为1- l0mg 蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。
Tris ，一些氨基酸，EDTA 等会干扰该测定。
三、仪器、试剂和材料1 ．仪器（1) 分光光度计（2 ）分析天平（3 ）振荡机（4 ）刻度吸管：1m1X2 ，5m1X2 ，10m1 X 1 (5 ）具塞三角瓶：1OOml （6 ）漏斗：13 个2 ．试剂（ 1 ）双缩脲试剂：取硫酸铜（Cu S0 4 5H 2 O ）1.5g 和酒石酸钾钠（NaKC 4 H 4 O 6 .4H 2 O ） 6.0g ，溶于500m1 蒸馏水中，在搅拌的同时加入300m1 10% NaOH 溶液，定容至1000 ml ，贮于涂石蜡的试剂瓶中。
（ 2 ）0.05mol/L 的NaOH 。
(3) 标准酪蛋自溶液：准确称取酪蛋白0.5g 溶于0.05mol/ L 的NaOH 溶液中，并定容至100m1, 即为5mg/m1 的标准溶液。
3 ．材料小麦、玉米或其他谷物样品，风干、磨碎并通过100 目铜筛。
四、操作步骤1 ．标准曲线的绘制取 6 支试管，编号，按下表加入试剂：震荡15min ，室温静置30min ，54Onm 比色，以蛋白质含量（mg ）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2 ．样品测定（ 1 ）将磨碎过筛的谷物样品在80 ℃下烘至恒重，取出置于燥器中冷却待用。
双缩脲法测定蛋白质的浓度ppt课件
取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml置试管中，加入双缩脲试剂 2.0ml，混匀，测其540nm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋 白质浓度。
6
0123456
2mg/ml 牛血清白蛋白液（ml） 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8
蒸馏水（ml）
3 2.7 2.4 2.1 1.8 1.6 1.2
双缩脲试剂（ml）
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
OD540
0
将上述溶液混合后，试管中即有紫红色出现，在540nm下测 的各管的吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标作出标 准曲线。 2、 样液的测定
2、双缩脲试剂：将1.75gCuSO4.5H2O溶于约150ml蒸馏水， 然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰 冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置 2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
5
四、实验步骤 1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂：
实验五 双缩脲法测定蛋白质的浓度
一、实验原理
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。 蛋白质在碱性溶液中可与CU2+形成紫色化合物，在一定 浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的 深浅成正比，可用比色法测定。
1
双缩脲反应
尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双 缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色 的化合物，此反应称为双缩脲反应。
2
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行 此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。
3
二、实验仪器
1、 试管 2、 吸管 3、 72
1 、 2mg/ml 牛 血 清 白 蛋 白 液 ： 将 1g 牛 血 清 白 蛋 白 溶 于 0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml.
6
0123456
2mg/ml 牛血清白蛋白液（ml） 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8
蒸馏水（ml）
3 2.7 2.4 2.1 1.8 1.6 1.2
双缩脲试剂（ml）
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
OD540
0
将上述溶液混合后，试管中即有紫红色出现，在540nm下测 的各管的吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标作出标 准曲线。 2、 样液的测定
2、双缩脲试剂：将1.75gCuSO4.5H2O溶于约150ml蒸馏水， 然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰 冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置 2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
5
四、实验步骤 1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂：
实验五 双缩脲法测定蛋白质的浓度
一、实验原理
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。 蛋白质在碱性溶液中可与CU2+形成紫色化合物，在一定 浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的 深浅成正比，可用比色法测定。
1
双缩脲反应
尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双 缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色 的化合物，此反应称为双缩脲反应。
2
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行 此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。
3
二、实验仪器
1、 试管 2、 吸管 3、 72
1 、 2mg/ml 牛 血 清 白 蛋 白 液 ： 将 1g 牛 血 清 白 蛋 白 溶 于 0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml.
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质的浓度。
➢ 在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测
定蛋白质浓度。
NH2 CO
NH2
CO
NH2 NH2 加热180oC?
NH +NH3
CO
CO
NH 2
NH 2
精品 PPT
紫红色铜双缩脲复合物分子结构
精品 PPT
显色剂与显色反应
➢ 在分光光度法中，许多不吸收光的无色物质可以用显色反应变成有色物质，使之能进行比 色测定，并能提高测定的灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中，将待测组分转 变成有色化合物的反应叫做显色反应，与待测组分反应生成有色化合物的试剂叫显色剂。
还有红外光（波长大于760-5000000nm）、紫外光（波长200-400nm）、X射线等。 ➢ 在可见光区，不同波长的光呈不同的颜色，但各种有色光之间并没有严格的界线，而
是由一种颜色逐渐过渡到另一种颜色。
溶液的颜色与吸收光颜色的关系
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Beer-Lambert定律－吸收光谱法基本定律
➢ 描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。 ➢ 含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。
污染瓶中的标准液体。 ➢ 使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 ➢ 使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿
用嘴吸取，以免造成意外。
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吸量管的使用
➢ 正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。 ➢ 取液：用吸耳球吸取液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上
谢谢大家
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722分光光度计使用注意事项
➢ 样品室盖应轻开轻放； ➢ 比色皿拿其磨砂面，液体装入约3/4高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水
冲洗干净，倒置于滤纸上； ➢ 倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品； ➢ 每调换一次波长，都应将空白溶液的吸光度调至“0”。
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双缩脲法测定蛋白质含量
实验目的
了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度的原理和方法。
精品 PPT
实验原理
➢ 蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，
称为双缩脲反应。
➢ 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能
与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白
A＝KCL 或 lgI0/I =KCL A为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度； C为溶液浓度； L为溶液厚度； I0为照射待测物质的单色光强度，I为透过待测物质光线的光强度，透光度 T= I/I0即溶液透过光的强度与入射光的强度之比； K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。 实验中溶液厚度不变，则A＝KC
相同，吸收系数不同。 ➢ 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定)
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物质的定量分析
➢ 标准曲线法 配制一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光。测定 时先以空白溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光度。以吸光度为纵坐 标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。
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12、人乱于心，不宽余请。14:38:4914 :38:491 4:38Su nday , October 18, 2020
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13、生气是拿别人做错的事来惩罚自 己。20. 10.1820 .10.181 4:38:49 14:38:4 9Octob er 18, 2020
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14、抱最大的希望，作最大的努力。2 020年1 0月18 日星期 日下午2 时38分 49秒14 :38:492 0.10.18
生物化学与分子生物学实验
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实验记录
实验记录是在进行科学研究过程中积累资料、经验的一项重要工作，每一次实验过程 中都应当养成良好的习惯，及时做好记录和总结。 要求： ⑴ 真实性 ⑵ 原始性 ⑶ 完整性 ⑷ 条理性
实验报告的书写
实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包 括：实验题目、实验目的 、实验日期、操作步骤与条件、实验结果、讨论和结 论等项目。
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实验步骤
1.按下图表所示加入相应的试剂或样品
试剂
管号
01
2 34 5
6
牛血清标准蛋白溶液（ml） 2mg/ml
—ห้องสมุดไป่ตู้
0.6
1.2 1.8 2.4 3.0
0
待测蛋白液（ml）
— — — — — — 3.0
蒸馏水（ml）
3 2.4 1.8 1.2 0.6 0 0
蛋白质浓度（mg/ml）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 未知
➢ 严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验室内学生轮流安排值日，实 验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。
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试剂使用规则
➢ 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 ➢ 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。 ➢ 取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免
➢ 在实际分析中，同一待测组分可与多种显色剂发生显色反应，生成不同的有色物质。为了 保证测定的灵敏度和准确度，在分析时常需对显色反应进行选择，选择原则如下： 1. 选择性好，干扰少或干扰易消除； 2. 灵敏度要高； 3. 生成有色化合物的组成恒定，化学性质稳定； 4. 生成的有色化合物与显色剂之间的颜色须有明显的差别，最大吸收波长之差大于60nm。
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光吸收示意图
I0
I
C
b
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吸收光谱和物质的定性分析
➢ 物质的吸收光谱与物质分子结构有关。 ➢ 吸收光谱曲线是物质的特征曲线。用各种不同波长的光线作为入射光测定物质的吸光度
（Absorbance），然后以波长（λ）为横轴，相应的吸光度（A）为纵轴，按结果作图， 可得到该物质的吸收光谱曲线，这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力。 ➢ 在一定的温度、pH值等条件下吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可 找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（λmax）。物质不同，它 们的最大吸收波长也往往不同。
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端。 ➢ 调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体
下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。 ➢ 放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸
量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最后靠壁15秒。
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吸量管的使用注意事项
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722分光光度计使用方法
➢ 接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热10min; ➢ 将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用擦镜纸擦净外壁，放入样
品室内, 空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位置对应; ➢ 调好波长; ➢ 调节按钮
开盖时，调 T 参数 调为 100 合上盖，调 A 参数 调为 0; ➢ 逐步拉出样品室拉杆（听到“咔”一声），读取吸光度值(A）; ➢ 读数完打开样品室盖，再将读数写入记录本。
➢ 比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用 自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布(纸)擦拭。
➢ 上述所有玻璃器材洗净(以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准)后，根据需要晾干 或烘干。
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分光光度法
一般性实验-1
➢ 光是一种电磁波，通常用频率和波长来描述光。 ➢ 人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在400～760nm，人的眼睛感觉不到的
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶 液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留 液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管 及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲 洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水 冲洗干净，晾干备用。
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2. 各管混匀后加入双缩脲试剂3.0ml，充分混匀； 3. 37度水浴30min； 4. 在540nm 处以0号管调零点测定各管吸光度； 5. 绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标； 6. 对照标准曲线，求待测蛋白质浓度。
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注意事项
➢ 读数时要注意读的是A的值； ➢ 注意正确标记试管（用记号笔清晰标记于试管2/3高处）； ➢ 准确记时。
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实验室规则
➢ 上实验课时不迟到，不早退，自觉遵守课堂纪律，上课时应保持实验室安静，不得大 声说笑。进入实验室必须穿实验工作服。
➢ 实验课前认真预习有关课程，明确实验目的、要求和注意事项，熟悉实验内容和方法 步骤。