(完整版)微生物检验学之衣原体及检验

衣原体及检验

一、概述

（一）概念衣原体是一群体积较小，能通过细菌滤器，细胞内专性寄生，并有独特发育周期的原核细胞型微生物。由于它具有一些与细菌类似的生物学特性，现归属于广义的细菌范畴。

（二）分类与命名

1.传统分类法按第九版Bergey细菌学分类手册，衣原体属于衣原体目、衣原体科、衣原体属。根据衣原体的抗原构造和DNA同源性的特点，将衣原体属分为四个种，包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和家畜衣原体。能引起人类致病的主要是前三种。

沙眼衣原体可分三个生物亚种，即沙眼生物亚种、性病淋巴肉芽肿生物亚种（LGV）及鼠生物亚种。其中沙眼亚种又分A～K14个血清型；LGV生物亚种又分4个血清型L1、L2、L2a和L3。前两个亚种对人类有致病性，鼠亚种则不侵犯人类。

肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种。只有一个血清型，即TWAR组。

2.分子生物学特性分类法该法主要是从衣原体种系发生上分析和评价传统分类法。

二、生物学性状

1.发育繁殖周期与形态染色衣原体在宿主细胞内生长繁殖有独特的发育周期，可见到两种形态结构不同的颗粒。

（1）原体：呈球形或椭圆形，直径约0.3μm，外有胞壁，内含致密的核质，为成熟的衣原体。吉姆萨染色呈紫色，Macchiavello染色呈红色。在细胞外较为稳定，无繁殖能力，但有高度的感染性。

（2）网状体又称始体：呈球形或椭圆形，直径0.5～1μm，无胞壁，胞浆内无致密的核质，而有纤细的网状结构。吉姆萨染色和Macchiavello染色均呈蓝色。为衣原体发育周期中的繁殖型，代谢活泼，不能自胞外存活，无感染性。

衣原体的发育周期：原体当与易感细胞表面的特异受体吸附后，通过细胞的吞饮作用进入细胞，形成吞噬小泡。原体在泡内变软，增大为网状体。约8小时后，网状体在空泡内以二分裂方式繁殖、聚集，构成各种形状的包涵体。感染18～24小时后，网状体浓缩形成具有坚韧细胞壁的原体，最后随宿主细胞破裂而释出，再感染新的易感细胞，开始新的发育周期。每个发育周期约需40～72小时。

2.抗原成分衣原体的抗原性相当复杂，有属、种、型等特异性抗原。

（1）属特异性抗原：衣原体细胞壁LPS为属特异性补体结合抗原。其与革兰阴性菌LPS结构不同，缺乏O-多糖和部分核心多糖，无典型内毒素生物学活性。长期应用于衣原体血清学诊断。

（2）种特异性抗原：主要位于外膜蛋白（MOMP）上。

（3）型特异性抗原：也位于MOMP上，用单克隆抗体作微量免疫荧光试验可识别衣原体各血清型。

3.分离培养特性衣原体专性细胞内寄生。绝大多数能在6～8日龄鸡胚卵黄囊中生长繁殖，并可在卵黄囊膜中找到包涵体、原体和始体颗粒，也可在传代细胞（如HeLa-299和Mc-Coy等细胞株）中培养。

4.抵抗力衣原体抵抗力弱，沙眼衣原体感染材料在35～37℃条件下，经48小时左右即失去活性。不耐热，加热50℃经30分钟或56～60℃ 5～10分钟可杀死，但耐寒，在冰冻条件下可存活数年。鹦鹉热衣原体比沙眼衣原体稳定。对四环素、青霉素、红霉素、螺旋霉素、利福平较敏感。

三、临床意义

人类衣原体病主要包括：

（一）沙眼衣原体

1.沙眼由沙眼生物亚种A、B、Ba和C四个血清型引起。主要通过眼-眼或眼-手-眼（常通过公用毛巾等媒介）的途径进行直接或间接接触传播。

2.包涵体结膜炎由沙眼生物亚种B、Ba、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K血清型引起。包括婴儿及成人两类。婴儿经产道时该亚种可致包涵体结膜炎和婴幼儿肺炎。

3.泌尿生殖道感染主要由沙眼生物亚种D-K血清型引起，是经性接触传播引起的非淋菌性泌尿生殖道感染的主要病原。衣原体感染是男性尿道炎最常见的病因之一。未经治疗者多数转为慢性，周期性加重，或可合并附睾炎、前列腺炎等。在女性可引起尿道炎、宫颈炎、阴道炎、盆腔炎，也可与妇女不孕症有关。衣原体常与淋病奈瑟菌混合感染，淋病奈瑟菌对衣原体的繁殖起激活和促进作用。

4.性病淋巴肉芽肿由沙眼衣原体LGV生物亚种（L1、L2、L2a、L3）血清型引起，主要通过性接触传播。引起以化脓性腹股沟淋巴结炎为特征的性病，又称第四性病。

主要侵犯淋巴组织，女性以累及会阴、肛门、直肠及盆腔淋巴结多见，男性以累及腹股沟淋巴结为常见，发生化脓性炎症和慢性肉芽肿，有些可形成瘘管。

（二）鹦鹉热衣原体主要引起鸟类或家禽感染，由感染该衣原体的鸟类等动物的粪便污染环境，以气溶胶形式传给人类。使人类发生上呼吸道感染、肺炎和毒血症。典型临床表现为非典型肺炎。也有引起心内膜炎的报道。

（三）肺炎衣原体其传播方式主要是人与人之间经飞沫或呼吸道分泌物传播。引起青少年急性呼吸道感染，以肺炎为主，常可呈地方性、散发性流行，也可引起支气管炎、咽炎等。该衣原体也可引起慢性感染，其与急性心肌梗死和慢性冠心病的关系越来越引起注意。

四、微生物检验

1.标本采集与处理

（1）沙眼衣原体：沙眼和包涵体结膜炎的患者，取眼穹隆部及睑结膜病灶作刮片。子宫颈炎取子宫颈刮片上皮细胞或分泌物作涂片。标本置于运送培养基中送检，常用的运送培养基为2SP培养基。

性病淋巴肉芽肿患者可取腹股沟淋巴结脓液，也可取直肠拭子或活检材料送检。

（2）鹦鹉热衣原体：采取患者血液、痰液或咽喉含漱液，痰标本用约2～10倍的灭菌肉汤或组织培养液洗脱附着在标本上的病原体，用力振摇，制成悬液，置室温1～2小时后，低速离心取上清液接种。尸检材料取肝、脾、肺等组织，也可采腹腔和心包渗出液。

（3）肺炎衣原体：一般利用拭子经鼻前庭插入鼻咽部，旋转后取出，利用转运培养基，冷藏送检。也可采集气管内痰液或肺泡灌洗液。要求24小时内接种或置-70℃保存。

2.直接显微镜检查染色镜检，寻找上皮细胞细胞质内的包涵体。包涵体即指在易感细胞内含增殖的始体和子代原体的空泡。根据包涵体的形态、在细胞内的位置及染色性等特性，对鉴别衣原体有意义。

（1）吉姆萨（Giemsa）染色：原体呈紫红色，始体呈蓝色，包涵体呈深紫色。沙眼衣原体包涵体密度低，呈空泡形。鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体包涵体呈深密度的卵圆形，肺炎衣原体在HeLa细胞中的包涵体形态与鹦鹉热衣原体十分相似，但不像鹦鹉热衣原体具有多形性。

（2）碘液染色：标本经甲醛固定后，用Lugol碘液染10分钟，水洗后镜检。因包涵体的基质含有丰富的糖原，可被碘液染成深褐色，而细胞的其他部分呈黄色。沙眼衣原体含糖原，碘液染色阳性。鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体碘液染色阴性。

（3）可利用抗LPS单抗进行直接法荧光抗体染色检测上皮细胞内的衣原体抗原。

3.酶免法检测抗原可检测临床标本中的可溶性抗原。

4.核酸检测按MOPO基因序列或其他具有种、型特异性的核酸片段，构建特异性引物或探针，利用PCR、核酸探针技术进行检测。按16SrRNA基因序列设计引物一般具有属特异性。

5.分离培养各种衣原体均可在鸡胚卵黄囊和组织细胞内生长繁殖，鹦鹉热衣原体常用小鼠分离。

（1）鸡胚卵黄囊接种：将检查标本加适当抗生素（如链霉素等）处理后接种于鸡胚卵黄囊分离培养。

（2）细胞培养：目前常用的细胞有两种：即经X线照射的McCoy细胞和HeLa细胞。不同种的衣原体有各自最适合的培养细胞系。沙眼衣原体多用McCoy细胞，鹦鹉热衣原体适合用Hela 229细胞系进行培养。肺炎衣原体适合用HEP-2和HL细胞系进行培养。为了达到较好的培养效果，可对细胞系进行一定处理，可以用DEAE葡聚糖预处理，以便增加分离率，也可以用细胞生长抑制剂，抑制宿主细胞生长，以利于衣原体的分离培养。