愈伤组织的诱导继代及分化
植物生物技术 愈伤组织的诱导继代及分化
⑶先芽后根： 愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心，从中仅分化出芽，一般情况下待芽 长到一定大小时，切下移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。有些植物在分 化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根，形成完整的植株。大多数植物均属这 类正常的分化途径，这类苗移栽较易成活。 ⑷先根后芽： 有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分化出根，而后在靠近愈伤组织的根部 上再分化出芽，有的将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至在根 端也能分化出芽。
长素降低些，尤其是使用2，4-D时。 一般地，经过继代培养的愈伤组织在稳定生长1～2代后，具有S型生长曲线。开 始一周生长缓慢，中间3周生长很快，4周以后生长又变迟缓。
第二节 悬浮培养
悬浮培养:一般是把一些小块生长旺盛的愈伤组织
放入液体培养基中，进行振荡培养，从而使愈伤 组织块变成良好分散性的细胞和小的细胞聚集体。 愈伤组织通过悬浮培养能产生大量的比较均一 的细胞，而且细胞增殖速度快，适宜进行大规模
（1）三角烧瓶容纳的培养基占总容积的20%～30%，培养基含量可随培养物量的减 少而减少； （2）转速一般为80～100 r/min； （3）细胞或愈伤组织的生长呈典型的S型曲线，即延滞期（lag phase），对数生长 期（log phase），然后逐渐减慢，直至停止。
3、愈伤组织的生长特性
一般情况下，25℃下培养的愈伤组织需要每4~6周继代一次。大多数研究工作表
官。可以把愈伤组织分化出芽、根器官概括为以下几种方式：
⑴单极分化： 愈伤组织中的分生中心在刺激物质的影响下向着一极分化，形成有根无芽或 者有芽无根的现象。 ⑵双极分化： 愈伤组织中随着细胞分裂出现两个或两个以上分生中心，其中有的分化芽， 有的分化根，根芽之间并无输导等组织沟通，在培养瓶内靠愈伤组织提供养料， 这种以愈伤组织隔离着的芽和根的苗，常常不能移栽成活。
第三章 植物愈伤组织的诱导、继代及分化
⑶先芽后根：愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心， 从中仅分化出芽，一般情况下待芽长到一定大小时，切下 移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。
有些植物在分化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根， 形成完整的植株。大多数植物均属这类正常的分化途径， 这类苗移栽较易成活。
⑷先根后芽：有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分 化出根，而后在靠近愈伤组织的根部上再分化出芽，有的 将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至 在根端也能分化出芽。
从单个细胞或外植体上脱分化形成典型的愈 伤组织，大致经历三个时期：
起动期：又称为诱导期,
是愈伤组织形成的起点。 外植体已分化的活细胞 在 外源激素的作用下，
通过脱分化起动而进入 分裂状态，并开始形成 愈伤组织。
起动期
分裂期
分裂期：外植体切口边缘开
始膨大，外层细胞通过一分 为二的方式进行分裂，从而 形成一团具有分生组织状态 细胞的过程。
二、从愈伤组织建立悬浮培养体系
多数悬浮培养物（suspension cultures）是将生长快、质地 疏松的愈伤 小块转移到与愈伤诱导含同样成分的液体培养 基里进行振荡培养而获得。
接种时必须有足够多的细胞块，以保证有较合适的细胞密 度。振荡速度一 般为 30-150rpm。
第一次继代时，应去掉开始时接入的大块细胞团——过滤。
第三节 愈伤组织分化与植株再生
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的生产。 体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着于原组织，每一 个体细胞胚称为胚状体，它可以同 合子胚一样发育成植株。 器官发生：指从愈伤组织形成芽及根的过程，芽是一个单 极性结构，物理地同母体组织联结着。
细胞分化
无论是在离体还是在活体条件下，植物细胞分化 研究的重点是维管组织的分化，特别是木质部成 分的分化。
11.3愈伤组织的诱导、形成及分化04
注意：
**愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成 分和培养时间而异。 **同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同的变 异。 **组织培养中涉及到的遗传变异主要是细胞核组成的改变， 变异是不可逆的，这种遗传上的改变可以是染色体畸变，细 胞核破碎，或者是由于细胞内复制引起的多倍性以及分子水 平上的改变等形式。 **培养基成分，特别是外源激素的成分与变异的产生密切有 关。
周继代一次。
** 继代时应注意愈伤组织分割。
Typical callus growth curve. X indicates time for subculture
拟分生组织
**愈伤组织在分裂期会出现导管细胞，筛管细胞，分泌细胞， 毛状体细胞及木栓细胞等，并出现由小而密集的分裂细胞构 成的细胞团，称为拟分生组织。 **这些区域化的细胞团往往在以后分化中称为形成芽原基及 根原基的中心，愈伤组织也经常呈颗粒状的外形，这些颗粒 中含有韧皮部、木质部和形成层组织，这种具有类似微管组 织的愈伤组织颗粒也具有分化形成不定芽和不定根的能力。
在愈伤组织诱导、增殖和形态建成过程中，对其调控幅 度最大的是植物生长调节物质，主要调节生长调节物质的 种类、浓度和比例，其中生长素和细胞激动素的浓度和配 比对大多数植物材料愈伤组织的诱导、增殖和形态建成的 调控起重要作用。对绝大多数植物材料而言，2,4-D 是诱 导愈伤组织和细胞悬浮培养的最有效物质，常用浓度为 0.2～2mg/L，为促进细胞和组织的生长还要加入0.5～ 2mg/L的细胞激动素（KT）。
callus type
胚性愈伤组织 embryogenic callus
成熟胚 mature embryo
幼穗 immatur e spike
愈伤组织培养 (1)
胡萝卜愈伤组织
愈伤组织培养
第一节 愈伤组织的诱导与分化 一、愈伤组织的诱导
在进行愈伤组织培养中，应根据不同的培养目的，获取不同的 外植体。 外源激素是植物愈伤组织诱导过程中不可缺少的组成成分。
第一节 愈伤组织的诱导与分化 二、愈伤组织细胞的分化
从单个细胞或外植体上形成典型的愈伤组织，大致要经历 三个时期：
愈伤组织培养
第一节 愈伤组织的诱导与分化
二、愈伤组织细胞的分化
质地不同的两种愈伤组织有时是可互变的，有时是不可逆 ห้องสมุดไป่ตู้。脆性愈伤组织由松散排列的细胞组成，而坚实愈伤组织则 由紧密排列的细胞组成。
加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆； 反之，减低或除去生长物质，则松脆愈伤组织可转变为坚实。
素而异。 菊芋1d，胡萝卜几天， 不同的光照条件，诱导情况不同，一般弱光易于诱导 ，且
分裂频率高。
愈伤组织培养
第一节 愈伤组织的诱导与分化
二、愈伤组织细胞的分化
外源激素是愈伤组织诱导过程中不可缺少的组成成分，是一 种诱导剂，能诱导细胞开始分裂，外源生长物质往往是通过调 整它的种类和浓度来诱导细胞开始分裂的。最常用的有2，4－ D、NAA、IAA和细胞分裂素等。2,4－D处理静止状态的组织 时，细胞的RNA含量明显增加，而且2，4-D可积累在分裂细胞 的核仁中。
愈伤组织培养
第一节 愈伤组织的诱导与分化
二、愈伤组织细胞的分化
（3）细胞的体积不再减小 愈伤组织分化时外植体细胞的大小发生十分明显的变化， 生长的愈伤组织的细胞平均大小不再减小，至此以后，保持相 对不变。 （4）出现各种类型的细胞 如薄壁细胞、分生细胞、管胞、石细胞、纤维细胞、色素细 胞、毛状细胞以及细胞丝状体等。 （5）出现一定的形态特征 生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡 绿色或绿色的，老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。
愈伤组织
一、愈伤组织的诱导
• 脱分化：一个已停止分裂的成熟细胞转变 为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的 现象。 •
一、愈伤组织的诱导
再分化 ：愈伤组织在 一定的培养条件下又 可以经过胚胎发生形 成双极性的胚状体， 或经过器官发生形成 单极性的芽或根，进 而重新形成完整的植 株，这后一段过程一 般称为再分化。
第二章 愈伤组织培养
主要内容： 相关概念 第一节 愈伤组织的诱导与分化 第二节 愈伤组织的继代培养 第三节 愈伤组织的形态发生 第四节 愈伤组织培养的应用 思考题 重点： 1、愈伤组织诱导的概念和过程 2、愈伤组织分化的概念和过程
相关概念
• 草莓愈伤组织
• 烟草黑暗条件下愈伤组织
愈伤组织
愈伤组织源出于自然生长的 植物受损伤时，在愈合伤口处长 出的一团瘤状突起，瘤状突起内 的细胞相对于植物体成熟细胞已 发生脱分化的变化。 这一概念后来被引入植物 组织培养领域。培养中的愈伤组 织是指从外植体的内部或切口表 面形成的一团没有分化的组织， 这种组织具有再分化的能力。
（三）分化期
• 不同外植体来源的愈伤组织有一定的均一性。如叶栅栏组 织细胞和根细胞在大小和形态上有一定的差异，但是两者 诱导形成的愈伤组织就失去了原有的差异，变得比较均一。 • 若诱导条件不同，愈伤组织的形态和物理性质也有一定 的变化，有的紧密坚实，有的疏松脆弱。例如，在柑橘子 叶培养中，在MS附加1mg/l NAA与0.2mg/l 6-BA的培养基 上形成的愈伤组织紧密坚实呈瘤状，而在MS附加0.2mg/l 2,4-D与0.2mg/l 6-BA培养基上形成的愈伤组织则疏松易脆。
诱导愈伤组织极为重要的因素－植物生长调节物质
• 常用的生长素是——2,4－D、IAA和NAA， 浓度为0.01—10mg· L-1，如诱导玉米胚愈 伤组织发生的培养基为MS+2,4－D8+NAA １，很多情况下单独用2,4－D就可； • 常用的细胞分裂素是——激动素和6-BA， 使用的浓度范围在0.1—10mg· L-1。 • 两者结合应用时，能更强烈地刺激愈伤组 织的形成。
大麦成熟胚愈伤组织诱导、继代及分化研究
第26卷第2期2019年6月天津农学院学报Journal of Tianjin Agricultural UniversityVol.26,No.2June,2019文章编号：1008-5394(2019)02-0008-05DOI：10.19640/ki.jtau.2019.02.002大麦成熟胚愈伤组织诱导、继代及分化研究李晨，谢晓东，王景太，崔春阳，王万坤，陈小强^曲(天津农学院农学与资源环境学院，天津300384)摘要：以大麦品种G1614成熟胚为研究对象，以MS培养基为基本培养基，探讨2,4-D质量浓度、碳源和成熟胚切割方式对大麦成熟胚愈伤组织诱导的影响，以及NAA/KT配比对大麦愈伤组织分化的影响。
结果表明：2,4-D质量浓度为5mg/L时，大麦成熟胚出愈率较髙；30g/L蔗糖作为碳源时，大麦成熟胚愈伤诱导率较高；纵切大麦成熟胚会促进大麦愈伤组织的诱导；在分化培养基中添加0.5mg/L NAA和4.0mg/L KT时，可使大麦愈伤组织获得较高的分化率。
关键词：大麦；成熟胚；愈伤组织；分化中图分类号：S512.3文献标识码：AStudy on callus induction,subculture and differentiation ofmature embryo of barleyLI Chen,XIE Xiao-dong,WANG Jing-tai,CUI Chun-yang,WANG Wan-kun,CHEN Xiao-qiang Corresponding Author(College of A gronomy and Resource Environment,Tianjin Agricultural University,Tianjin300384,China)Abstract:In this study,G1614was used as plant materials.The effects of different concentrations of2,4-D,different kinds and concentrations of carbon source,and different cutting ways to mature embryos on the callus induction of mature embryos from barley GI614were studied with MS medium as basic medium.And the effects of different concentrations of KT and NAA on the differentiation of barley callus were also studied.The results showed that inducing rate of callus were higher at5mg/L2,4-D. Callus induction rate of mature barley embryos using30g/L sucrose as carbon source was higher.The induction rate of barley callus was promoted by longitudinal cut of mature embryo.The addition of0.5mg/L NAA and4.0mg/L KT in the differentiation medium resulted in a higher differentiation rate of G1614callus.Key words:barley;mature embryo;callus;differentiation大麦(Hordeum vulgare L.)属禾本科植物，为第四大谷类作物，其品种遗传改良研究一直倍受重视目前，大麦主要作为啤酒生产的原料以及饲料作物使用。
第三章-愈伤组织诱导
第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。
愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。
一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。
细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。
持续十几小时~几天。
2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。
3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。
若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。
2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。
颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。
一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。
3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。
迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。
其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。
生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。
二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。
愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。
3 愈伤组织的培养
第三节愈伤组织的形态发生
一、不定芽方式（adventitious bud）
外植体 脱分化 愈伤组织 高生长素(1,2-D)
再分化
芽
低(生长素/细胞分裂素)
高(生长素/细胞分裂素)
根
再生植株
第三节愈伤组织的形态发生
愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：
（ 1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即 无根的芽或无芽的根； （2）先长芽，后长根，多数情况； （ 3）先长根，再从根的基部长芽。这种情况较 难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物； （ 4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽 和根，然后两者结合起来形成一株植株。
从外表均一的外植体长出的愈伤组织，在开始阶 段是相当一致的，而从茎、根等器官切段上长出 的则是一个混杂的愈伤组织。
不同颜色的愈伤
第二节 愈伤组织的继代培养
1、定义：培养物在培养基上生长一段时间以后， 由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产 物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这 个过程叫做继代培养。
第二节愈伤组织的继代培养
2、愈伤组织培养的调控因素：
外植体 培养基 培养环境
第二节愈伤组织的继代培养
（一）材料本身
Photo indicating where the callus (c) arises from
第一节愈伤组织的诱导和分化
Wound callus on the stem of an Erythrina tree 刺桐树
二．愈伤组织的分化
• 从外植体脱分化形成 典型的愈伤组织大致 愈伤组织分化 可分为三个时期： 诱导期 分裂期 分化期
附：第五节 组织培养成苗
指把外植体放在培养室（有光照、 温度条件）里，成再生植株的过程。 外植体：1、带芽外植体
第四章之二愈伤组织的诱导、形成及分化
第一节 愈伤组织的概念及类型
一、定义 callus
在一定条件下从外植体的切口（伤口）部位生成的无 特定结构和功能的薄壁细胞团。 二、愈伤组织的起始条件
创伤+激素
★机械性创伤 ★微生物入侵
★昆虫袭击
三、来源
植物各种器官、组织、细胞均有产生愈 伤组织的潜在可能性
★光照 暗 弱光 ★温度 20-30℃ ★培养基
N源 NH4+/NO3C源 蔗糖
激素 生长素：2,4-D IAA NAA 0.01-10mg/L
细胞分裂素：KT ZT 6-BA 0. 1-10mg/L
二、愈伤组织的形成过程
特点
愈伤组织形成
起始期 分裂期
改变原来的分化方向和代谢方式， 合成代谢加强，合成大量蛋白质和 核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定 基础
外植体外层细胞开始分裂，细胞脱 分化，愈伤组织结构疏松，缺少组 织结构，颜色浅而透明
形成期
Callus表层细胞分裂逐渐停止， 而转向其内部的局部地区，并改
变分裂面的方向，出现瘤状结构 外表，Callus中可以发现维管组 织，但不形成维管系统
❖ **诱导期长短因植物种类、外植体的生理状 态和外部因素而异，即使同一种物种不同基 因型同一外植体的愈伤组织诱导期也不同。
0.056
80d
0.253 0.227 0.219 0.124
0.063
第四章之二愈伤组织的诱导、 形成及分化
第一节 愈伤组织的概念及类型 第一节 愈伤组织的诱导和形成 第三节 愈伤组织的继代及其生长分析 第四节 愈伤组织形态建成 第五节 愈伤组织的形成及其生理生化基础
植物组培2-愈伤组织的诱导
植物组织培养-愈伤组织的诱导一、【实验目的】掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。
二、【实验原理】植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。
植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。
而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。
植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。
超净工作台工作原理：本工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备室内空气→预过滤器(初滤) →小型离心风机压入静压箱→高效空气过滤器(精滤) →出风面吹出洁净气流(具有一定的、均匀的断面风速）→不断排除工作区原来的空气→形成高洁净的工作环境三、【实验仪器和材料】仪器：培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL ），烧杯，量筒，培养皿，棉线，接种箱或超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮纸试剂：乙醇、2 ，4 – D （生长素类似物）、次氯酸钠、6- 苄基氨基腺嘌呤（6-BA ）、MS 培养基、0.1 mol/L NaOH 与0.1 mol/L HCl材料：绿豆、胡萝卜、自选材料四、【实验步骤】（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。
（2）将植物体用自来水冲洗后,用酒精棉擦拭欲取材部位表面, 或于70%酒精中浸沾数秒钟。
（3）将材料放入已灭菌的100ml烧杯（或试剂瓶）中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。
（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。
（5）弃次氯酸钠浸泡液，用无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。
（6）将已灭菌的植物材料置于灼烧后冷却的金属盘中，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散，以绿豆为材料时，将绿豆纵切或横切，去皮后分别接种。
第五章愈伤组织的诱导、形成及分化
B、继代时间与变异
不同激素组合和浓度对蚕豆愈伤组织细胞倍性及染色 体畸变的影响
注意：
**愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养 基成分 和培养时间而异。 **同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同
的变异。
**组织培养中的遗传变异是不可逆的，这种遗传上的改
变可以是染色体畸变，细胞核破碎，或者多倍体以及分
第五章 愈伤组织的诱导、形成及分化
第一节 愈伤组织的诱导和形成 第二节 愈伤组织形态建成
第三节 愈伤组织的形成及其形态 建成的某些生理生化基础
为什么进行愈伤组织培养？
①无性繁殖，大量扩繁；
② 为细胞悬浮培养和次生代谢产物生产与利用、原生质
体培养和细胞融合提供材料；
③ 为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的
A: Callus induction from ovary（子房） B: Callus from ovule(胚珠) C: Callus from anther （花药）
D: Formation of globular embryo structure（球形胚胎结构）
不同外植体胚性愈伤组织发生
基因型 genotype
（继代培养），则愈伤组织可无限制地进行细胞分裂增殖，
维持不分化的状态。
小麦幼胚
诱导期
分裂期
分化期 分裂期 分化期
愈伤组织诱导形成过程
■分化期 **停止分裂的细胞发生生理生化代谢变化，形成不同 形态和功能的细胞。细胞体积不再减少，最明显的
特征是生长着的愈伤组织细胞的平均大小突然不再减
少，而保持相对稳定。 **愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢直至停止，突然 转向愈伤组织内部深处的局部地区，并改变分裂面 方向，出现瘤状结构外表和内部分化。
第三章_愈伤组织诱导及分化调控
1. 外植体的选择 需考虑以下因素:
(1) 外植体的基因型 (2) 同一植物不同部位外植体，其细胞的分化能
力有相当大的差别 (3) 植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更
容易去分化
一个细胞向分生状态回复过程所能进行的程度， 取决于它在原来所处的自然部位上已经达到的细 胞分化程度和生理状态
再生植株：器官发生(organogenesis)和体细胞 胚胎发生(somatic embryogenesis)
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的 生产。体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着 于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以 同合子胚一样发育成植株。
器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈 伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器 官的过程 。
从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具 有全能性。
差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受 精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖 细胞的低。
全能性实现的两个必须满足的条件： 把具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影
响下解脱出来 要给予植物细胞一定的刺激
二、几个重要的概念
外植体（explant): 植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，
（2）物理因素 光：
很多光照条件下，一些植物均能进行器官发生， 说明光周期并不是非常重要的因子
有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而 在连续光照下则不能
尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期， 多数培养条件是14-16h光照，8-10h黑暗
温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉 花就不一样
B
愈伤组织
一、愈伤组织的诱导
不同外植体的比较：
一般双子叶植物比单 子叶和裸子植物诱导愈 伤组织容易；
幼年细胞和组织比成 年细胞和组织容易；
二倍体细胞比单倍体 细胞容易。
胡萝卜愈伤组织
二、愈伤组织细胞的分化
从单个细胞或外植体上形成典型的 愈伤组织，大致要经历三个时期：
（二）分裂期
• 分裂期指细胞通过一分为二的 方式，不断增生子细胞的过程。 外植体的细胞一但经过诱导， 细胞脱分化，其外层细胞开始 细胞分裂。
• ① 细胞的数目迅速增加。胡 萝卜组织培养7d后，细胞数可 增加 10倍。
• ② 每个细胞平均鲜重下降。 这是由于鲜重的增加赶不上细 胞数目的增加之故。
（二）分裂期
（三）分化期
• 是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化 而形成由不同形态和功能的细胞组成的愈 伤组织。在细胞分裂末期，细胞内开始发 生一系列的形态和生理变化，导致细胞在 形态和生理功能上的分化，出现形态和功 能各异的细胞。分化期愈伤组织内的细胞 主要出现下列变化。
（三）分化期
• （1）细胞分裂部位和方向发生改变 • 分裂期的细胞分裂局限在组织的外缘，
这一概念后来被引入植物 组织培养领域。培养中的愈伤组 织是指从外植体的内部或切口表 面形成的一团没有分化的组织， 这种组织具有再分化的能力。
愈伤组织培养
愈伤组织培养将母体 植株上的各个部分切下作 为外值体，接种到无菌的 培养基上，进行愈伤组织 诱导、生长和发育的一门 技术。
一般情况下，植物 组织均能诱发形成愈伤组 织。
（一）诱导期：
外源激素是愈伤组织诱导过程中不可缺 少的组成成分，是一种诱导剂，能诱导细 胞开始分裂，外源生长物质往往是通过调 整它的种类和浓度来诱导细胞开始分裂的。 最常用的有2，4－D、NAA、IAA和细胞 分裂素等。2,4－D处理静止状态的组织时， 细胞的RNA含量明显增加，而且2，4-D 可积累在分裂细胞的核仁中。
愈伤组织的培养(2)
12
二、愈伤组织器官的形成
1、器官分化：如茎、根
（1）器官分化再生植株的方式：
①先芽后根：最常见； ②先根后芽：较少见； ③同时形成根和芽：在愈伤组织不同部位分别形成根和芽，相互
注：细胞脱分化在多数情况下形成愈伤组织，但也可直接分化为胚
性细胞形成体细胞胚或组织、器官。
7
三、愈伤组织的生长和调控
1、愈伤组织生长的特点：
①发生在不与琼脂培养基接触的表面； ②不同植物材料、在不同的培养条件下表面不同。
2、优良愈伤组织的特性：至少2-3项
①高度的胚性或再分化能力，能再生植株； ②分散性好，容易散碎，便于建立优良的悬浮系或分离原生质体； ③旺盛的自我增殖能力，容易扩大规模； ④经过长期继代保存而不丧失胚性，可进行各种遗传操作。
3、细胞悬浮培养的体细胞胚胎发生：
（1）胡萝卜细胞悬浮培养物中存在两种类型的细胞：
①自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，这类细胞 一般不具备胚胎发生潜力；
②成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成 胚能力，因而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。
（2）胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后，其 外围的许多细胞开始第一次不均等分裂，靠近细胞团方向 的一个细胞较大，以后发育成类似胚柄的结构；另一个细 胞则继续分裂形成类似原胚的结构，以后经过类似于体内 的发育过程，经球形期、心形期等发育阶段形成完整的体 细胞胚。
1、胚胎发生：形成胚状体； 2、器官生生：形成芽、根，最终形成完整植株。
（二）细胞分化和组织分化： 二、愈伤组织器官的形成 ： 三、体细胞胚胎发生：
愈伤组织培养
菊花叶片培养
器官形成
愈伤组织形成
胚形成
五、愈伤组织的应用
(1)加快了植物新品种和良种繁育速度 植物组织培养将传统的育种方式改在试管和室
内进行，利用一块植物组织在一年内可繁殖成千 上万株的小植株，取得迅速高效、低成本推广新 品种的效果。
(2)利于种质资源保存和远距离运输 应用组织培养保存种质资源具有节约土
1、植物愈伤组织的形成结构
根据愈伤组织的性质和细胞组成的特点，可以将 它们的结构分为致密和松散两种类型。
松散型
致密型
2、愈伤组织形成的过程
外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下 通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划 分为四个时期，即诱导期、分裂期、形成期和分 化期。
诱导期：
是细胞准备进行分裂的时期。 特点：代谢活化了，细胞内的合成代谢迅速进行，
通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不 分化的增殖状态。
由于代谢产物的积累会产生毒害作用，如 果长时间不继代培养，就会使愈伤组织变 成黑褐色，继而死亡。
用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保 存愈伤组织的一种方法。
一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼 脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增 殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。因此，由 于愈伤组织的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变 成了一个不规则的馒头状的组织块。
影响因子： （一）外植体本身 （二）培养基 （三）培养环境
（一）外植体本身
1．遗传型 材料的基因型对愈伤组织的器官 分化有决定性的影响。
2．器官和部位 对有些植物而言，不同的器 官或组织所形成的愈伤组织，在生理上或形态 上存在明显差异。
3．年龄 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导 形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。
愈伤组织培养
分裂期
是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞 的过程。
外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅 速分裂，使细胞脱分化。
在细胞分裂期，其形成结构和生理生化都发生深 刻的变化：
•
1.数目迅速增加。 2.平均鲜重下降。 3.体积小，内无液泡。 4．核和核仁增大到最大。
•
形成期
是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结 构的愈伤组织的时期。
•
由于代谢产物的积累会产生毒害作用，如 果长时间不继代培养，就会使愈伤组织变 成黑褐色，继而死亡。
用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保 存愈伤组织的一种方法。
•
一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼 脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增 殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。因此，由 于愈伤组织的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变 成了一个不规则的馒头状的组织块。
它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。
•
•青苹果愈伤组织增殖培养
•
•乌桕愈伤组织增殖培养
•
三 愈伤组织的形态发生
形态建成：外植体在适宜的培养条件下经 过脱分化和再分化形成完整植株的过程。
在组织培养中，从外植体形成器官或无性 系的形态发生，有下面两种方式：
•
形态发生方式（一）
不定芽方式 指愈伤组织通过再分化形成不定芽再生植 株。这是组织培养中常见的器官发生方式。
这一时期愈伤组织内细胞的特点是： ①大而不规则，高度液泡化，整个组织是比较松 散的。 ②细胞增殖速度快,适合用液体培养或悬浮培养。
•
③生长旺盛的愈伤组织呈乳黄色或白色，有光泽 ，也有浅绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变 为黄色甚至褐色。
•
•愈伤组织形成
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一.愈伤组织形成条件
若是一旦脱离了母体植株，摆脱了原来所受到的遗 传上的控制和生理上的制约，在一定的培养条件下，就 会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细 胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分化细胞经过连续 的有丝分裂，形成愈伤组织（离体隔离）。
一.愈伤组织形成条件
一般认为静止细胞并未丧失其分裂潜能，只是分化过 程中产生一类抑制剂阻碍其分裂的能力，若去除抑制 物质即可使分化的体细胞恢复分裂活力。 机械损伤是引起诱导组织细胞分裂的刺激因素。
形成期：形成无序结构的愈伤组织的时期
分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心， 或者进一步分化为维管组织结节——由分生组 织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细 胞，并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞 等，但不形成维管系统。
愈伤组织的形态特征
来自不同植物或是不同部位外植体的愈伤组织，其质地、颜 色和物理性质差异很大。有的很紧密坚实，有的很疏松脆弱或呈 胶质状；有的呈淡黄色，有的呈白色或淡绿色等。不同质地、颜 色的愈伤组织再分化能力不同。
一.愈伤组织形成条件
外植体可以是各种器官或组织，理论上讲诱导愈 伤组织成败的关键不在于外植体，而在于培养条 件，其中激素的成分和浓度是极为重要的因素。 特别是生长素类对于细胞分裂的诱导以及其后的 生长增殖，是必要的物质。
二.愈伤组织的诱导
外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱 导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程 被大致划分为三个时期（诱导期、分裂期和 形成期）。
1.诱导期：细胞分裂的准备期
接种的外植体细胞通常都是分化的成熟细胞，处于静止状态，细 胞大小没有多大变化，外观无明显特征，但在外源激素作用下， 细胞内物质代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸等物质的合成。
王凯基等（1981）在研究离体培养的油橄榄茎段时发现，细胞内 合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。
【学习目的与要求】
掌握愈伤组织的诱导与继代培养、分化与植 株再生的两种发生途径及愈伤组织形态发生 的调控因素。
【主要内容】
第一节 愈伤组织的诱导与继代培养 第二节 愈伤组织分化与植株再生 第三节 愈伤组织形态发生的调控因素
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芦荟的植物组织培养过程
第一节 愈伤组织的诱导与继代培养
植物组织培养（Plant Tissue Culture）：指通过无菌操作分离植 物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制 的条件下进行培养，使其产生完整植株的过程。
③ 细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。 ④ 随着细胞不断分裂和组织生长，细胞的总干重、蛋白质和
核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。
3.形成期：形成无序结构的愈伤组织的时期
形成期是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结 构的愈伤组织的时期。进入形成期后，细胞的平均大小相对 稳定，不再发生变化，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平 周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状 或片状的拟分生组织，称做分生组织结节。
愈伤组织在长期的继代培养中能够形成分生组织区、管胞和 色素细胞或是体细胞胚，这种能够形成体细胞胚的愈伤叫做胚性 愈伤组织。
三.继代培养
脱分化细胞不断进行分裂形成愈伤组织，愈伤 组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质 枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移 到新鲜培养基上继续培养。这个过程叫做继代。通 过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化 的增殖状态。
愈伤组织（Callus）：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团 薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序 生长的薄壁细胞。
一.愈伤组织形成条件
虽然如全能性所言，发育和分化过程并不导致细 胞全能性的丧失。但是，在一个完整的植物中，每个 分化细胞都是某个器官和组织中的一个成员，它只能 在与其周围成员相互协调和彼此制约当中，恰如其分 地发挥整个植株所赋予它的一定的功能，而不具备施 展其全能性的外部条件。
基发育而成的。 ②从外植体脱分化形成愈伤，在愈伤组织上
产生一些分生细胞团，随后由这些分生细胞团 分化成不同的器官原基。
①外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器
官原基。这一途径有两种情况：
一、是外植体中已存在器官原基，进一步培养 即形成相应的 组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养。
二、外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞 团，然后由分生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组 织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中 具有重要的实践意义。
2.分裂期：开始分裂到持续分裂的时期
分裂期是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生 子细胞的过程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层 细胞开始迅速分裂，使细胞脱分化。分裂期主要表现 如下： ① 细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后，细胞数可 增
② 细胞体积小，内无液泡，细胞的核和核仁增大到最大。如 同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。
形态建成：外植体在适宜的培养条件下经脱分化、分化或直接 发育成各种形态完整的植物体的过程。
在愈伤组织培养物中，细胞分裂常以无规则方式发生，并产生无 明显形态或极性的无序结构组织块，这时虽然在愈伤组织中发生了 细胞分化，形成维管化组织和瘤状结构，但并无器官发生。若将其 转入分化培养基中，即可再分化完成形态发生，再分化产生苗或根 的分生组织，甚至胚状体，进而使它发育成苗或完整植株。
三.继代培养
一般在愈伤组织生长至直径2～3cm(4～6周)时将其切成小块继 代培养。可以根据需要选取合适质地、颜色的愈伤进行培养。继代 培养时应切除黑褐色的愈伤，选取生长旺盛的组织。生长旺盛的愈 伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡绿色或绿色的；老化 的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。
第二节 愈伤分化与植株再生
一.愈伤组织形态发生的途径
1.器官发生方式：指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定 芽再生成植株。这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。
2.胚状体方式：指由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、胚 轴的胚状结构，进而长成完整植株。
1.器官发生与植株再生
根据起源不同器官分化发生有两种方式： ①器官是由切下的外植体中已存在的器官原