第七章 定点诱变
第七章 定点诱变
制备单链DNA模板时用ung- dut-突变的大肠 杆菌菌株如CJ236菌株，该菌株合成的 DNA中部分胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。如 M13噬菌体DNA中有20-30个尿嘧啶
2．原理 Kunkel 法过程包括： ① 目标 DNA 插入 phagemid 载体并进入 E.coli CJ236 。
② 由于该菌体 ung- dut- 突变，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）
利用BAL 31核酸酶制备嵌套缺失突变体
处理不同时间
Klenow DNA聚合酶 补平末端
与克隆载体连接
3．DNase Ⅰ 的消化
一种内切酶，可优先水解 ds or ss DNA 中的 嘧啶核苷酸 。 Mg2+ ：独立作用于每条 DNA 链，位点随机。
第四节 嵌套缺失 嵌套缺失(Nested Deletions)的制备主要依赖核 酸酶,如核酸外切酶Ⅲ (ExonucleaseⅢ,ExoⅢ),BAL31或DNaseⅠ,这些 酶可以特定的作用方式消化DNA,同时消化 DNA的速率可控制,因此能同时分离嵌套缺失 和多组终末端相差无几的缺失体 利用该技术可构建一系列梯度缺失重组子,借此 可对该段DNA分子上的重要功能区进行定位, 用于寻找在基因表达调控中起关键作用的启动 子和增强子等顺式作用元件
（二）位点选择诱变 Altered Sites in vitro Mutagenesis System 使用了2个寡核苷酸引物 一个是用来引入突变的突变引物 一个是用来选择用的
福建农林大学-研究生复试-作物育种学-第7章-诱变育种
第七章诱变育种
一、诱变育种的概念及特点
二、物理诱变
三、化学诱变
四、诱变后代的处理
五、提高诱变育种效率的方法
一、诱变育种的概念及特点
1、诱变育种的概念
利用理化因素诱发生物体产生变异，再通过选择育成新品种或新材料的育种方法。
★物理诱变：利用辐射诱发基因突变和（或）染色体变异
★化学诱变：应用化学物质诱发基因和（或）染色体变异
2、特点
（1）优点
提高突变率，变异范围广。突变率可达3%，比自然突变高100-1000倍。突变类型多，还可能产生新基因。
对单一性状改良有效。如早熟性、株高等。
多为点突变和隐性突变，易稳定，育种年限短。
●热中子：极早熟大豆哈75-222（早32天）
●γ射线：原丰早水稻（早40天）
●热中子（印度）蓖麻早150天（270天→120天）
●大麦白粉病抗性基因mlo
（2）局限
有利变异少。
难以综合改良。
诱变的方向和性质尚不能控制。
▪二、物理诱变
（一）物理诱变剂的种类及其性质
物理诱变剂：各种辐射线。因此，物理诱变通常称为辐射诱变。
分为：电离辐射线和非电离电离辐射线。用于作物育种的大多是电离辐射线。
▪1、电离辐射线
χ射线（伦琴射线）：最早用于诱变的射线。20世纪20年代利用χ射线诱发玉米、大麦；1934利用χ射线育成第一个烟草突变品种Chlorina
●由x光机产生，其能量和穿透力与工作电压有关。
●低电压产生软χ射线，穿透力弱，适于花粉外照射
●高电压产生硬χ射线，穿透力强，适合小块组织、愈伤组织的外照射。
γ射线（丙种射线）：是一种短波长、能量高、穿透力强的电离辐射线。目前应用最多。
●农用γ射线由放射性同位素60Co、137Cs产生，需专门的照射室(60Co源室)，严密防护，安全。适于外照射。
第七章 诱变育种
康普顿Compton散射：
其过程与光电吸收不同。能量相当高的光子与物 质作用时，产生比光电子能量高得多的反冲电子和能 量减弱的散射光子。反冲电子在穿过物质时能引起电 离，同时散射光子根据本身的能量值也可由于光电吸 收或新康普顿散射而与物质相互作用。 hv
电子对的产生：
光子能量大于1.02百万电子伏的硬射线能 与原子核相互发生作用，结果产生一个正电子 和一负电子，光子整个消失，这叫电子对的产 生。负电子可使介质中的原子电离并消耗其全 部能量。正电子存在的时间很短，当其速度近 于或等于零时，则和一个负电子结合而转化成 光子，这叫光化辐射。
五、辐射处理的主要方法
辐射处理分外照射内照射两种形式。 （一）外照射：是指被照射的种子、球茎、 鳞茎、块茎、插穗、花粉、植株等所受的 辐射来自外部的某一辐射源。目前外照常 用的是X射线，ß射线、快中子或热中子。 外照方法简便安全，可大量处理，所以广 为采用。
外照射处理植物的部位和方法： １、种子 照射种子的方法有处理干种子、 湿种子、萌动种子三种。目前应用较 多的是处理干种子。
处理干种子的优点是： 1) 能处理大量种子； 2) 操作方便； 3) 便于运输和贮藏； 4) 受环境条件的影响小； 5) 经过辐射处理过的种子，没有污 染和散射的问题。
２、无性繁殖器官 许多园林植物是用无性繁殖的，而且 有部分园林植物从来不结种子，只依靠无 性繁殖的. 诱变育种是对这类材料进行品种改良 的重要手段，在诱变育种中只要得到好的 突变体，就可直接繁殖利用。
第七章诱变育种
第二节 诱变育种前的准备工作
由于诱变育种工作量大,周期长,因此,在诱变育种前必需 做好充分准备,如了解菌种的培养特征,了解培养基组分和培 养条件对目标产物合成的影响等,并进行严格设计,以提高诱变 育种的效率.
一、了解影响菌种生长发育的主要因素
1.培养基: ①培养基的营养成分决定微生物的营养生长和生殖生长:培养 基是影响菌种生长和孢子形成的重要因素之一,对产生孢子的 微生物来说,培养基的营养成分是控制菌体生长和孢子形成的 主要因素,营养太丰富,会促进菌丝大量生长而不利于孢子形 成.
4.温度:温度对菌种的影响很大，在培养过程中温度越高，生 长越快，但超过一定的范围，会使生产能力下降，甚至引起 变异，高温对菌种生产能力的影响很大。 5.湿度：湿度也影响菌种生长和孢子形成。相对湿度高，生 长慢，相对湿度低，生长快。放线菌在不同相对湿度下培养 时，其形成的孢子数量有明显的影响。一般放线菌要求相对湿 度约40－60％，而真菌要求相对湿度约70％。 6.药品和原料的质量：药品规格和原料来源不同会影响菌种 的质量。为了使菌种质量保持稳定，药品和原材料的质量应相 对稳定，如有变动，要适当调整培养基的配比。 二、了解菌株的菌落形态 每个菌株在特定的培养基和培养条件下具有特定的菌落形态和 培养特征。霉菌和放线菌的菌落形态特征通常包括菌落大小、 形状、高度、放射线多少、外观组织结构（如粉状、绒毛状或 絮状等）、孢子多少和色泽、可溶性色素等。细菌的菌落形态 特征包括菌落大小、形状、高度、颜色、色泽、边缘结构、表
《定点诱变技术》课件
4
验证修饰深度和准确性。
对PCR扩增和测序的数据进行分析， 解读实验结果，得出结论，为下一步
的研究提供指导。
应用案例
定点诱变技术在基因 修复中的应用
定点诱变技术可以实现对 基因组特定位点的精准修 饰，为基因修复研究提供 了新思路，有望用于治疗 遗传性疾病等。
定点诱变技术在农业 生产领域中的应用
可以利用定点诱变技术来 研发适应环境变化、产量、 营养含量更高的作物品种， 提高粮食产量和质量。
定点诱变技术可能会带来一系 列的伦理、法律和社会问题， 例如导致人们撕裂不和，社会 不公等问题。
定点诱变技术未来发展 的瓶颈和解决方案
目前，定点诱变技术在某些肿 瘤细胞和人类胚胎细胞中并没 有得到广泛应用，需要进一步 研究，探索更为高效、精准、 安全的定点诱变技术。
《定点诱变技术》PPT课 件
本课程将介绍定点诱变技术的原理、实验步骤、应用案例和未来展望，以及 它对人类社会的影响和挑战。
概述
什么是定点诱变技术？
定点诱变技术是一种精准编辑基因的方法，可以在基因组中特定位置对基因进行修改。
为什么需要定点诱变技术？
传统的基因编辑技术往往是非特异性的，不能达到精准编辑的效果，而定点诱变技术可以 避免对非目标区域的影响。
实验步骤
1
实验前的准备工作
首先需要构建引导RNA分子、购买
诱变育种
作物对辐射的敏感性的大小顺序是：
①不同科、属、种和品种的辐射敏感性不同。
②作物的不同器官、组织以及发育时间和生理状 况，其敏感性也不同。
③处理前后的环境条件影响诱变效果：ⅰ）种子 含水量是影响诱变效果的主要因素之一；ⅱ）辐射 处理时的外界条件（如氧气、温度、光照）以及处 理后的贮存时间条件对诱变效应均有影响； ⅲ） 照射后种子贮存时间的长短会影响种子的生活力， 所以一般都在处理后尽早播种； ⅳ）在照射处理 时所应用的照射剂量因作物种类、处理材料（种子、 植株或花粉）均有所不同。
7.2.5 物理诱变处理的方法
物理诱变处理的方法分外照射和内照 射两种。
外照射指种子等所受的辐射来自外部 的辐射源。
内照射是利用放射性同位素32P、35S 、 14C 的化合物, 配成溶液浸渍种子或使作 物吸收, 或注射茎部。
7.2.6 诱变处理的剂量
各种诱变处理以采用中等到低的剂 量为好。对于多倍体的小麦应该避免采 用高剂量的诱变，以使处理后代中有更 多的单一位点突变体, 各种诱变因素的 适宜诱变剂量如表7-2、表7-3
7.2.4 诱变处理的材料
诱变处理的材料通常选用本地区大面积推广 应用的适应性和综合性状良好, 而某些性状需要 改良的品种。但是为了同时改良多种性状则以杂 交后代为材料的效果好 , 用诱变因素处理杂种, 不仅可以提高突变频率, 扩大其后代的变异幅度, 而且能够打破不利的基因连锁, 促进基因重组。
定点诱变技术
同时利用重叠延伸PCR技术可以对基因中心区 段进行取代、插入、缺失的突变。
大引物PCR介导的定点突变
各种点突变方法的比较
方法
寡聚核苷酸 介导的突变
盒式突变
优点 保真度高
简单易行 突变效率高
PCR介导的突变
操作简单 突变成功率高
缺点
操作复杂 周期长
合成多条引物成本高 后续工作复杂 受到酶切位点的限制 TaqDNA聚合酶保真性偏低
Family gene shuffling library of chimeras
基因的定点诱变
即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上 在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质
Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后 按照特定的需要和目的，给予选择压力， 反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适 合特定目的的分子筛选出来，获得满足需 要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管 中分子水平的模拟进化。
基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5
以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。 不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6
用一套随机引物与模板配对延伸，产生 不同位点的短DNA片段混合物（含有少 量点突变），以这些短DNA片段为引物 重新组装成全长基因。
基因直接进化的步骤
突变
基因突变库的建立
筛选
基因突变库的活体或离体筛选
Key steps of a typical directed enzyme evolution experiment
体外诱变
是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变 其核苷酸序列，获得突变基因。研究基 因的结构与功能的关系，获得所需功能 的突变体蛋白质 主要方法有：随机诱变，DNA体外重组， 寡核苷酸介导的定点诱变，嵌套缺失
第七章诱变育种mhj
M1不选择
M1不选择的原因：
① M1存在着生物学损伤，植株生长较差。 ②突变往往发生在个别细胞中，植株是由变异和 不变异的细胞组成的嵌合体。 ③突变多是隐性突变，形态上不易显露出来。
M1植株隔离自交，使突变基因纯合。 植株隔离自交，使突变基因纯合。 单株、单果、或按处理采收种子。 单株、单果、或按处理采收种子。
概念
致死剂量： ◎ 半致死剂量： ◎ 临界剂量：
◎
剂量的选择原则：
活：后代要有一定的成活植株 ◎ 变：在一定的成活植株中，有较大的变异效应 ◎ 优：产生的变异有较多的有利突变。
◎
影响选择的依据
作物对辐射敏感性的差异
①不同科、属、种、品种敏感性不同
豆科>禾本科>十字花科
②不同倍数植物敏感性不同
二倍体>多倍体
烷化剂： 核酸碱基类似物 叠氮化物 嵌入剂 丫啶橙,二氨基丫啶
二、化学诱变剂的种类
烷化剂： 核酸碱基类似物 叠氮化物 嵌入剂 丫啶橙,二氨基丫啶 无机化合物 H2O2,亚硝酸等 生物碱
世界各国推广植物突变体数
（FAO/IAEA, 1991） ）
物种数 80 19 11 33 143 品种数 1019 40 29 409 1497 植物类别 种子繁殖植物 果树 其他无性繁殖植物 观赏植物 小计 占％ 68.1 2.7 1.9 27.3
基因定点诱变
使用化学合成的含有突变碱基 的寡核苷酸片段作引物,启动 单链DNA分子进行复制，随 后这段寡核苷酸引物便成为了 新合成DNA子链的一个组成 部分。
寡核苷酸引物诱变过程
正链DNA合成 突变引物合成 异源双链DNA分子制备 闭环异源双链DNA分子富集 转化 突变体筛选
寡核苷酸引物诱变法的局限性
异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修 复体系修复
提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法
(1) Kunkel 定点诱变法: 1985年由 T.A.Kunkel发明
ung:尿嘧啶脱糖苷酶
(2) 硫代磷酸诱变法: 已知有些限制酶不能切割 硫代磷酸DNA分子．在异源双链DNA分子 制备时，加入硫代核苷酸，使之掺入突变 链中．然后用前述酶切割，并用外切酶局 部消化后，进行聚合反应，从而产生具有 定点突变的异源双链DNA
百度文库 2.4.３ ＰＣＲ诱变
(1) 重组PCR定点诱变:克服寡 核苷酸引物诱变能力仅限于5’ 端.
特点:经3轮PCR反应,一对互补 的带有突变碱基的内侧引物和 2个外侧引物
(2) 大引物诱变:核心是第一 轮PCR产物为第二轮PCR引 物
返回目录
返回第二章
第七章 诱变育种
Chapter 10. Population improvement and recurrent selection
本章内容：
第一节 群体改良的意义； 第二节 群体改良的原理； 第三节 基础群体的建立 第四节 群体改良的轮回选择法； 第五节 雄性不育性在轮回选择中 的应用。
三、遗传平衡定律
哈迪-温伯格定律 (Hardy－Weinberg
law) (1908)
–在一个完全随机交配的大群体内，
如果没有其它因素干扰时，群体的
基因频率与基因型频率在生物世代
之间将保持不变。
遗传平衡定律的意义
群体遗传研究群体基因频率和基因型频率 变化规律，揭示生物进化历程；遗传平衡 定律是群体遗传的基础 根据遗传平衡定律，平衡群体的基因频率 和基因型频率是保持不变的，也就是说平 衡群体的遗传结构是稳定不变的； 群体的遗传平衡是有条件的，研究影响遗 传平衡的因素及规律也就是研究群体结构 改变(进化)的规律。
第一节 群体改良的意义
一、群体改良的概念
群体改良(Population Improvement）
对变异群体进行周期性选择和重组来 逐渐提高群体中有利基因和基因型的
频率,以改进群体综合表现的育种方
法。
与选育品种或自交系 相比 , 群体改良是实现 中长期育种目标的育 种手段。
二、群体改良的意义
基因定点诱变
基因工程
第二章 基因工程技术原理
返回目录
第四节 基因定点诱变
返回第二章
2.4.1 盒式诱变
利用一段人工合成 的具有突变序列的 寡核苷酸片段取代 野生型基因中的相 应序列.
西北师范大学
2.4.2 寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基 的寡核苷酸片段作引物,启动 单链DNA分子进行复制，随 后这段寡核苷酸引物便成为了 新合成DNA子链的一个组成 部分。
基因工程
第二章 基因工程技术原理
西北师范大学
寡核苷酸引物诱变过程
正链DNA合成 突变引物合成 异源双链DNA分子制备 wk.baidu.com闭环异源双链DNA分子富集 转化 突变体筛选 寡核苷酸引物诱变法的局限性
异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修 复体系修复
基因工程
第二章 基因工程技术原理
西北师范大学
基因工程
第二章 基因工程技术原理
提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法
(1) Kunkel 定点诱变法: 1985年由 T.A.Kunkel发明
ung:尿嘧啶脱糖苷酶
西北师范大学
基因工程
第二章 基因工程技术原理
(2) 硫代磷酸诱变法: 已知有些限制酶不能切割 硫代磷酸DNA分子．在异源双链DNA分子 制备时，加入硫代核苷酸，使之掺入突变 链中．然后用前述酶切割，并用外切酶局 部消化后，进行聚合反应，从而产生具有 定点突变的异源双链DNA
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第七章定点诱变
［本章摘要］
突变有重复、缺失、倒位、易位四种类型。定点诱变主要是关于：简单的插入或缺失，单个碱基的置换以及系统的缺失、插入或成串碱基的置换。寡核苷酸介导的定点诱变主要是对单个或少数几个碱基的操作；外切核酸酶Ⅲ、BAL31、DNase Ⅰ介导嵌套缺失，可以得到系列缺失体。
第一节：寡核苷酸介导的诱变
70年代初j×174 DNA （ss DNA 5386bp），当用带琥珀突变的ssDNA 与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象。即产生带野生型基因组的噬菌体，原因是野生型DNA 片段与突变体的相应序列退火，形成错配的异源双链体，后者可被宿主编码的错配修复系统转变为全长的野生型基因组。由此可利用突变的DNA 片段将突变引入到野生型DNA 中。
一、Kunkel法或称“U” 法
1．背景介绍
dut-dUTP 酶缺陷，细胞不能把dUTP 转化为dUMP ，因此细胞内dUTP 的含量大为增加，其中一些dUTP 可掺入DNA 中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置。
ung -UDG 酶缺陷，UDG 酶[尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）]可除去掺入DNA 中的尿嘧啶残基。
2．原理
Kunkel 法原理如图7-1 所示，过程包括：
①当目标DNA 插入phagemid 载体并进入E.coli CJ236 后。
②由于该菌体ung- dut-突变，合成的DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）。
③M13K07 辅助感染下，产生带U 的单链DNA 。
④与引入诱变的Oligo 复性。
⑤在T7DNA polymerase 和ligase 作用下，以带U 的单链DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链。
⑥感染dut+ung+ E.coli MV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链DNA 。而有U 的DNA 链，在dut+和ung+产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力。
3．酶和primer
①DNA polymerase
②ligase
③T4 gene 32 protein：提高含二级结构的ssDNA 的突变率
④primer：要求5' 端磷酸化。
引物的终极条件：与靶DNA 正确配对，特异性地与靶DNA 序列退火。
A.单核苷酸置换插入或缺失
5' 端完全配对，使得上游（引物）起始的DNA 合成不容易将诱变寡核苷酸取代，约需8-10bp 。3' 端所形成的杂交体足以引导DNA 合成。如果错配核苷酸太靠近3' 端，3' 端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。所以3' 端需有7-9bp 完全配对；为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸。一般17-19bp ，错配在中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大。
B.多处缺失或变换2 个bp 以上的oligo
两侧需12-15bp ，侧翼双链区的Tm 应约为35-40℃。突变区域大，效率越低（两侧形成稳定杂交体的能力是突变区长度的函数→越低）。
Tm = 4 （G + C）+ 2 （A + T）
⑤模板/结果
靶DNA 尽可能短，应测序确定其突变。
二、Altered Sites II in vitro Mutagenesis System
三、Transformer Site-Directed mutagenesis 原理及过程如图7-3 所示。
图7-3 ：Transformer Site-Directed mutagenesis 原理图
四、PCR 定点诱变
1．同源重组法
引物1、3 ，致突变引物，引物2、4 ，准确配对引物。
作用原理如图7-4 ，过程包括：
①以1、2 和3、4 分别为引物进行PCR ，得到引入了突变的线状DNA 分子。
②线状DNA 分子转化同一宿主。
③同源重组得到环状的引入了突变的目标DNA 。
2．Dpn I 法
作用原理如图7-5 所示，作用过程包括：
①以野生型DNA 为模板，致突变引物扩增出目标分子。
②依赖甲基化的限制性内切酶Dpn I 特异性降解模板DNA （甲基化）。
③扩增产物连接，转化大肠杆菌，得到大量复制。
3．重叠延伸 Overlap extension
原理参照图7-6 ，具体内容参考第五章。
第二节嵌套缺失1．外切核酸酶Ⅲ的消化
2．BAL 31 的消化
BAL31 主要活性为3' 外切核酸酶活性，可从线性DNA 两条链的3' 端去掉除单核苷酸。它是一个内切核酸酶（单链，nick, gap），依赖Ca2+，EGTA 可抑制活性。
3．DNase Ⅰ的消化
DNase Ⅰ是一种内切酶，可优先水解ds or ss DNA 中的嘧啶核苷酸。当Mg2+ 存在时独立作用于每条DNA 链，位点随机。当Mn2+ 存在时大致在同一位置切割dsDNA ，产生平端或1-2 个核苷酸突出。