第7章重组人干扰素生产工艺

天然干扰素种类繁多，分子量也不同，亦有不同 的抗原性。目前了解由人的不同细胞产生的干扰 素至少有三种不同的抗原成分：白细胞干扰素抗 原(Le)、人成纤维细胞干扰素抗原（F）和T淋巴 细胞干扰素抗原（T）。
根据世界卫生组织规定，将人细胞所产生的几种干扰素， 按其抗原性不同分为α、β和γ三类，Le干扰素即为α-干扰 素（IFN-α），F干扰素为β干扰素（IFN-β）。T-干扰素即 γ干扰素（IFN-γ）。
收集培 养液
分离 纯化
重组人 干扰素
CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary），该细胞具有不死性，可以传 代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。
上市产品：rhuIFNβ-1a
1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)
Alick Isaacs
Jean Lindenmann
1966-1971年，Friedman发现了干扰素的抗病毒机制，引 起了人们对干扰素抗病毒作用的关注，而后，干扰素的免 疫调控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗肿瘤作用逐渐被 人们认识。
Robert M. Friedman
1976年，Greenberg等首先报道用人白细胞干扰素治疗4 例慢性活动性乙肝，治疗后有2例HBsAg消失。但是由于 人白细胞干扰素原材料来源有限，价格昂贵，因此未能大 量应用于临床。
免疫调节活性（rhuIFNγ）--治疗慢性肉芽肿瘤 多发性硬化症--rhuIFNβ
7.1.4 IFN的副作用
流感样症状是最为常见的症状，如畏寒、疲劳、 厌食、头痛、呕吐、肌痛、腹泻等。
以低剂量开始给药可以避免过强的副反应，或 预先给解热镇痛药可控制这一反应，睡前服用也 可减轻反应。全身反应在持续治疗1至2周后可较 好耐受。
3.基因工程大肠杆菌发酵生产工艺
工程菌构建 发酵培养 包涵体 复性
重组人 干扰素
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001-2002：PEG化IFN，PEG-Intron，Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met（甲硫氨酸），无活性包涵
根据对酸和热稳定性，将干扰素分为I型和II
型：pH2.0，56℃，1h，有活性的为I型。 I型干扰素：IFN-α、IFN-β、IFN-ζ、
IFN-ε 、IFN-ω II型干扰素：IFN-γ
α干扰素
IFN-α基因表达产物为188~189个氨基酸的前 体，N端23个氨基酸残基是亲水信号肽，分泌出 细胞时被切除，活性产物为165~166个氨基酸。
多亚型混合干扰素
1975年，美国的斯爵德（Strander）等发现
Namalva细胞（Burkitt淋巴瘤）具有高效的干扰
素诱生能力。
1999年，IFNα-n1/Wellferon，批准用于临床。
优点：首次实现大规模商业化生产，8m3反应器。
缺点：仍然需要病毒诱导；细胞系的改变，致使 亚型干扰素的种类较前一工艺更多，活性低。退 出临床应用。
细胞因子（cytokine）是指有机体细胞合成和 分泌的小分子多肽，可调节机体的生理功能，参 与各种细胞的增殖、分化、凋亡和行使各种功能。
细胞因子在某些情况下还可产生病理作用，参 与自身免疫病、肿瘤、移植排斥、休克等疾病的 发生和发展。
干扰素（interferon，IFN）
• 干扰素是最早发现、研究最多、第一个 被克隆、第一个用于临床治疗疾病的细胞因子。 • 干扰素是机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是 机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋 白。 • 在正常个体的脾脏、肝脏、肾脏、外周血淋巴细 胞和骨髓中都可以检出。
β型包括β1a、β1b。 临床阶段：IFNω
干扰素的理化性质
分子量18~40kDa 等电点5.7~8.5 pH2~10范围内稳
定 比病毒颗粒小 对乙醚、氯仿敏感 容易吸附到玻璃等
介质上。
7.1.2 IFN的生物学功能
抗病毒（rhuIFNα） 抗肿瘤（rhuIFNα） 免疫调节（rhuIFNγ） 多发性硬化症（rhuIFNβ）
1918年流感病毒大爆发时场景
1957年，英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士 研究人员Jean Lindenmann，在利用鸡胚绒毛尿 囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细 胞能产生一种因子，后者作用于其他细胞，干扰 (interfere)病毒的复制，故将其命名为干扰素 (interferon)。
对酸不稳定，不耐热。分子中含有很多碱性氨基 酸，等电点超过pH8.6。
天然IFN-γ是一种糖蛋白，而大肠杆菌表达的IFNγ无糖基化，仍有生物学活性。
重组人干扰素的种类
上市的重组人干扰素有重组人干扰素-α、重组人 干扰素-β、重组人干扰素γ三类，共六种。
根据分子结构的不同将其分类命名，其中α型包括 α1b、 α2a、 α2b，其中α2b生物活性高，其与相 应受体的结合率强，抗体发生率低，是目前国际 公认疗效最好、构效比最佳的重组人干扰素-α， 临床应用最为广泛。
β干扰素
IFN-α和IFN-β 具有许多相似的生物学和生物化 学性质，核苷酸序列的同源性高达80％，氨基酸 水平的同源性约为25%~30 ％ 。
天然人IFN-β由166个氨基酸组成，分子量 23kDa。
成熟IFN-β有20％糖基（第80位有一个N-连接 糖基化位点）。
有3个半胱氨酸（Cys），其中第31位和141位 Cys之间形成的二硫键，与分子的正确折叠和功 能有关，对于其生物学活性非常重要统症状等，同时出现 干扰素抗体。
7.1.5 中国干扰素市场
我国是世界乙型肝炎高发国，目前有800万～ 1000万名乙肝病人。这些病人却很少选用干扰素作 为治疗药物，主要原因就是干扰素过高的价格。
目前国内重组人干扰素的市场呈现国产药品和 进口药品并存的格局。进口重组人干扰素为长效干 扰素，价格偏高，单价均在1000元左右。国产重组 人工干扰素为普通干扰素，最高剂量的单价只在 100元左右。
病毒诱导
1989年，IFNα-n3/Alferon，批准上市 缺点：产量低，1g IFNα/3x105 L人血
白细胞来源困难，工艺复杂，收率低， 价格昂贵潜在的血源性病毒污染的可 能性（特别是逆转录病毒）。
2.人源转化细胞系培养生产工艺
Namalva 细胞培养
合成干扰素
分离纯化
病毒诱导
因产生蛋白质因子发挥作用，因此不同细胞对干 扰素的敏感不同；
（3）病毒大量复制时引发细胞炎症应答，此时干 扰素易产生作用；
（4）当病毒DNA已整合到宿主细胞的染色体中时， 干扰素不能发挥其抗病毒活性。
2、干扰素抗肿瘤作用机制
肿瘤细胞：无限繁殖能力；转化能力；滋 润能力。
干扰素抗肿瘤作用机制：
免疫监视的作用是处理发生突变的自身细 胞。
干扰素能够增强监视效应细胞对病变细胞 的直接杀伤作用。
（2）对免疫防卫系统的调节：
免疫防卫的作用是排斥和消灭侵入的外源 性物质。
干扰素对其中的体液免疫、细胞免疫和吞 噬免疫均有调节作用。
（3）对免疫自稳系统的调节：
免疫自稳的作用是调节机体免疫系统自身，排除 免疫代谢过程中产生的废物和损伤、死亡的淋巴 细胞，即机体的自我调节、自我稳定。
生物制药工程
主讲教师： 刘 凯 liukai_1982@
山东农业大学生命科学学院微生物系
第七章 重组人干扰素生产工艺
7.1 干扰素概述 7.2 基因工程假单胞杆菌的构建与保藏 7.3 重组人干扰素的发酵工艺过程 7.4 重组人干扰素的分离纯化工艺过程
7.1.1 概述
表达产物：166个氨基酸，糖基化蛋白，22.5kDa
工艺特点：分泌表达，产量低，成本高，过程控 制严格。可以做到无血清培养。
是多种疾病的治疗手段
1、广谱抗病毒活性
病毒的复制可概括为吸附→侵入→脱壳→ 生物合成→装配→释放。
干扰素抗病毒的作用机制有： （1）抗病毒的作用过程 （2）抑制病毒蛋白质的合成 （3）降解病毒mRNA
干扰素抗病毒作用机理
干扰素抗病毒作用的特点：
（1）不能杀死病毒，仅仅是抑制作用； （2）对病毒没有直接的作用，通过细胞核内的基
通过核酸内切酶切割分析，从而搞清了其全部核苷酸的顺 序，由此又推导出全部核苷酸顺序，在α、β与γ三型干扰 素中又因各型中又有氨基酸的顺序不同，又可分为若干亚 型。
IFN-，由白细胞产生，有25种不同的亚型 IFN-，成纤维细胞产生，4种亚型
IFN-，活化的T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)产生， 4种亚型
目前干扰素的销售量仅为国内理论需求量的1%， 理论上，我国干扰素市场应有100亿～200亿元人民 币的销售额，如果今后干扰素真能降价到位，则其 在国内市场销量还能提高10～20倍。
7.1.5 干扰素的生产工艺研究
1.体外诱生干扰素制备工艺：仙台（Sendai）病 毒诱导人白细胞
血浆
人白细胞
分离纯化 人白干扰素
γ干扰素
IFN-γ虽然基因序列、氨基酸组成和来源与 INF-α和IFN-β完全不同、但生物学活性有许多相 似之处。
N端23个氨基酸为信号肽，在分泌出细胞时被 切除，活性产物由143个氨基酸组成，分子质量 为16 kDa。
IFN-γ分子中没有形成二硫键的半胱氨酸，其 活性形式是牢固的二聚体或四聚体，单体没有活 性。
体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
优点：来源上脱离了人血，并且纯度和活性比人白干扰素 有所提高，成本明显降低。
缺点：生物合成、纯化及制剂阶段均使用了一些动物或人 血液提取成分，仍然没有摆脱潜在的传播血源性疾病的危 险。